2011 年 2 月 博士學位論文
보리순 분말이 흰쥐의 지질 대사 및 항당뇨 효과에 미치는 영향
朝鮮大學校 大學院
食品營養學科
李 有 美
보리순 분말이 흰쥐의 지질 대사 및 항당뇨 효과에 미치는 영향
Effects of Barley Leaf Powder on Lipid Metabolism in Rats and its Antidiabetic Activity
2011 年 2 月 25 日
朝鮮大學校 大學院
食品營養學科
李 有 美
보리순 분말이 흰쥐의 지질 대사 및 항당뇨 효과에 미치는 영향
指導敎授 李 明 烈
이 論文 을 理學博士學位申請 論文 으로 提出 함
2010 年 10 月
朝鮮大學校 大學院
食品營養學科
李 有 美
의 을 함 李 有 美 博士學位 論文 認准
委員長 朝 鮮 大 學 校 敎 授 장 해 춘
( )印委員員 木 浦 大 學 校 敎 授 김 인 철
( )印委員員 南 部 大 學 校 敎 授 황 권 택
( )印委員員 朝 鮮 大 學 校 敎 授 김 복 희
( )印委員員 朝 鮮 大 學 校 敎 授 이 명 렬
( )印2010 年 12 月
朝鮮大學校 大學院
목 차
ABSTRACT ··· xiv
제 장 서 론1 ··· 1
제 장 재료 및 방법2 ··· 12
제 절 실험재료1 ··· 12
제 절 성분분석2 ··· 12
일반성분 및 식이섬유소 1. ··· 12
아미노산 2. ··· 14
지방산 3. ··· 15
비타민 4. ··· 16
유기산 5. ··· 18
무기질 6. ··· 19
구성당 7. ··· 20
제 절3 In vitro에서 항산화 물질의 함량 및 활성 측정 ··· 21
시료추출 1. ··· 21
총 함량 2. polyphenol ··· 21
총 함량 3. flavonoid ··· 22
소거능 4. DPPH radical ··· 22
에 의한 항산화능 측정 5. Rancimat ··· 23
제 절4 In vivo에서 지질대사 개선 및 비만억제효능 ··· 24
실험동물의 사육 및 식이 1. ··· 24
실험동물의 처리
2. ··· 27
혈청 및 활성 및 포도당 함량 3. ALT, AST ALP ··· 27
혈청 지질 함량 4. ··· 28
간조직의 지질 함량 5. ··· 28
지방조직 지질 함량 6. ··· 29
지방조직 활성 7. LPL ··· 29
가. Heparin-releasable LPL(HR-LPL) 활성··· 29
나. Total extractable LPL(TE-LPL) 활성··· 30
통계처리 8. ··· 31
제 절 당뇨효능실험5 ··· 32
1. In vivo에서 당뇨효능 실험 ··· 32
가 제 형 당뇨. 1 ··· 32
실험동물 (1) ··· 32
식이조성 (2) ··· 33
사육환경 (3) ··· 33
실험동물의 처리 (4) ··· 36
혈청 중 포도당 함량 측정 (5) ··· 36
경구 당 부하 검사 (6) ··· 36
혈청의 인슐린 및 펩티드 농도 측정 (7) , fructosamine C- ··· 36
혈청 중 및 활성 측정 (8) ALT, AST ALP ··· 37
혈청 지질 함량 (9) ··· 37
간조직의 지질 함량 (10) ··· 38
지방조직 지질 함량 (11) ··· 38
사육환경
(3) ··· 40 실험동물의 처리
(4) ··· 42 혈청 중 포도당 함량 측정
(5) ··· 42 혈청 중 인슐린 및 펩티드 농도 측정
(6) C- ··· 42 혈청 중 당화 헤모글로빈 농도 측정
(7) ··· 42 혈청 중 알부민 농도 및 총 단백질 함량 측정
(8) ··· 43 소장점막의 이당류 분해효소 활성
(9) ··· 43
혈청 중 및 활성 측정
(10) ALT, AST ALP ··· 44 혈청 지질 함량 측정
(11) ··· 45 간조직의 지질 함량
(12) ··· 45 지방조직 지질 함량
(13) ··· 45 통계처리
(14) ··· 45 제 장 실험결과 및 고찰3 ··· 46 제 절 성분분석1 ··· 46
일반성분 및 식이섬유소 함량
1. ··· 46 구성아미노산 함량
2. ··· 50 지방산 조성
3. ··· 52 비타민 함량
4. ··· 54 유기산 함량
5. ··· 56 무기질 함량
6. ··· 58 구성당 함량
7. ··· 61 제 절2 In vitro에서 항산화 물질의 함량 및 활성 ··· 63
총 함량
1. polyphenol ··· 63
총 함량
2. flavonoid ··· 64 소거능
3. DPPH radical ··· 66 에 의한 항산화능
4. Rancimat ··· 68 제 절3 In vivo에서 지질대사 개선 및 비만억제 효능 실험 ··· 70
체중증가율 식이섭취량 및 식이효율
1. , ··· 70
간장 체중 비율 및 지방조직 무게 2. / ··· 75
혈청 중 및 활성 3. ALT, AST ALP ··· 80
혈청 중 포도당 함량 4. ··· 83
혈청 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 5. ··· 85
혈청 중 콜레스테롤 콜레스테롤 콜레스테롤 총 콜 6. HDL- , LDL- , HDL- / 레스테롤 비율 ··· 88
동맥경화지수 및 심혈관 위험지수 7. ··· 91
간 조직 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 8. ··· 94
지방조직 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 9. ··· 98
지방조직 활성 10. LPL ··· 104
제 절 당뇨억제 효능4 ··· 109
1. In vivo에서 당뇨효능 실험 ··· 109
가 제 형 당뇨. 1 ··· 109
체중증가량 식이섭취량 식이효율 및 물 섭취량 (1) , , ··· 109
장기의 무게 (2) ··· 115
혈청 중 포도당 함량 (3) ··· 118
경구 당 부하 검사 (4) ··· 121
혈청 중 인슐린 농도 (5) ··· 123
혈청 중 농도 측정 (6) Fructosamine ··· 126
혈청 중 펩티드 농도 측정 (7) C- ··· 128
혈청 중 및 활성 (8) ALT, AST ALP ··· 130
혈청 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 (9) ··· 132
지방조직 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량
(13) ··· 142 나 제 형 당뇨. 2 ··· 148
체중증가량 식이 섭취량 식이효율 및 물 섭취량
(1) , , ··· 148 간장 체중 비율 및 지방조직 무게
(2) / ··· 155 혈청 중 포도당 함량
(3) ··· 159 혈청 중 인슐린 농도
(4) ··· 162 혈청 중 펩티드 농도
(5) C- ··· 164 혈청 중 당화 헤모글로빈 농도
(6) ··· 166 혈청 중 알부민 농도
(7) ··· 168 혈청 중 총 단백질 농도
(8) ··· 170 소장점막의 이당류 분해효소 활성
(9) ··· 172
혈청 중 및 활성
(10) ALT, AST ALP ··· 174 혈청 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량
(11) ··· 177
혈청 중 콜레스테롤 콜레스테롤 콜레스테롤 총
(12) HDL- , LDL- , HDL- /
콜레스테롤 비율 ··· 179 동맥경화지수 및 심혈관 위험지수
(13) ··· 182 간 조직 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량
(14) ··· 184 지방조직 중 중성지방 및 총콜레스테롤 함량
(15) ··· 187
제 장 요 약4 ··· 193 참 고 문 헌 ··· 207
LIST OF TABLES
Table 1. Operating condition of Amino Acid Autoanalyzer for amino acids ··
··· 14
Table 2. Operating condition of GC for fatty acids ··· 15
Table 3. Operating condition of HPLC for vitamin A and E ··· 17
Table 4. Operation conditions of HPLC for vitamin C ··· 17
Table 5. Operating condition of Ion Chromatography for organic acid ··· 18
Table 6. Operating condition of Atomic Absorption Spectrophotometer for minerals ··· 19
Table 7. Operating condition of Ion Chromatography for free sugars ··· 20
Table 8. Experimental design ··· 25
Table 9. Composition of experimental diet ··· 26
Table 10. Experimental design ··· 34
Table 11. Composition of experimental diet ··· 35
Table 12. Experimental design ··· 40
Table 13. Composition of experimental diet ··· 41
Table 14. Proximate compositions of barley leaf ··· 49
Table 15. Contents of insoluble dietary fiber and soluble dietary fiber in barley leaf ··· 49
Table 16. Contents of total amino acids in barley leaf ··· 51
Table 17. Compositions of fatty acids of barley leaf ··· 53
Table 21. Contents of carbohydrates in barley leaf ··· 62 Table 22. Contents of polyphenol in barley leaf powder ethanol extracts
··· 65 Table 23. Contents of flavonoid in barley leaf powder ethanol extracts ··
··· 65 Table 24. Antioxidative activities of barley leaf powder ethanol extract fractions on soybean oil ··· 69 Table 25. Changes of the body weight of the rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 72 Table 26. Liver weight of rats fed hight fat diet with barley leaf powder for 4 weeks ··· 77 Table 27. Serum activity of ALT, AST and ALP in the rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 82 Table 28. Contents of triglyceride and total cholesterol in the rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 87 Table 29. Contents of HDL-cholesterol, LDL-cholesterol and HDL-C/TC in the rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 90 Table 30. Atherogenic index and cardiac risk factor of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 93 Table 31. Effect of barley leaf powder on HR-LPL activity in adipose tissue
of rats fed high fat diet ··· 107 Table 32. Effect of barley leaf powder on TE-LPL activity in adipose tissue
of rats fed high fat diet ··· 108 Table 33. Effect of barley leaf powder on body weight change in the STZ-induced diabetic rats ··· 111 Table 34. Effect of barley leaf powder on diet intake in the
STZ-induced diabetic rats ··· 112 Table 35. Effect of barley leaf powder on organ weights in the STZ-induced diabetic rats ··· 117 Table 36. Serum activity of ALT, AST and ALP in the STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 131 Table 37. Contents of triglyceride and total cholesterol in the STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 133 Table 38. Contents of HDL-cholesterol, LDL-cholesterol and HDL-C/TC in the STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 136 Table 39. Atherogenic index and cardiac risk factor of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ·· 138 Table 40. Changes of the body weight of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks 151 Table 41. Effects of barley leaf powder on enzyme activities in diabetic db/db mice ··· 173 Table 42. Serum activity of ALT, AST and ALP in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ·· 176 Table 43. Contents of triglyceride and total cholesterol in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 178 Table 44. Contents of HDL-cholesterol, LDL-cholestero and HDL-C/TC
LIST OF FIGURES
Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of barley leaf powder ethanol extracts depending on concentration. ··· 67 Fig. 2. Food intake of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 73 Fig. 3. FER of rats fed high fat-high diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 74 Fig. 4. Mesenteric adipose tissue weights of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 78 Fig. 5. Epididymal adipose tissue weights of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 79 Fig. 6. Contents of glucose in the rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 84 Fig. 7. Contents of triglyceride in the liver of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 96 Fig. 8. Contents of total cholesterol in the liver of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 97 Fig. 9. Contents of triglyceride in the mesenteric adipose of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 100 Fig. 10. Contents of total cholesterol in the mesenteric adipose of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ···
··· 101 Fig. 11. Contents of triglyceride in the epididymal adipose of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 102
Fig. 12. Contents of total cholesterol in the epididymal adipose of rats fed high fat diet containing barley leaf powder for 4 weeks ···
··· 103 Fig. 13. The FER of STZ-induced diabetic rats fed experimental diet with barley leaf powder for 4 weeks. ··· 113 Fig. 14. Water consumption in the STZ-induced diabetic rats fed experimental diet with barley leaf powder for 4 weeks ··· 114 Fig. 15. Contents of glucose in the STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 120 Fig. 16. Blood glucose response to the oral glucose tolerance test (OGTT) in the STZ-induced diabetic rats ··· 122 Fig. 17. Concentrations of serum insulin in the STZ-induced diabetic rats ··· 125 Fig. 18. Concentrations of serum fructosamine in the STZ-induced diabetic rats ··· 127 Fig. 19. Concentrations of serum C-peptide in the STZ-induced diabetic rats ··· 129 Fig. 20. Contents of triglyceride in the liver of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 140 Fig. 21 Contents of total cholesterol in the liver of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 141 Fig. 22. Contents of triglyceride in the mesenteric adipose tissue of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4
Fig. 24. Contents of triglyceride in the epididymal adipose tissue of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 146 Fig. 25. Contents of total cholesterol in the epididymal adipose tissue of STZ-induced diabetic rats containing barley leaf powder for 4 weeks ··· 147 Fig. 26. The change of growth rate of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks. ··· 150 Fig. 27. Food intake of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks. ··· 152 Fig. 28. The FER of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 153 Fig. 29. Water consumption in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 4 weeks ··· 154 Fig. 30. Liver weight of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 156 Fig. 31. Mesenteric adipose tissue weights of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ···· 157 Fig. 32. Epididymal adipose tissue weights of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks. ··· 158 Fig. 33. Contents of glucose in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 161 Fig. 34. Contents of insulin in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 163 Fig. 35. Contents of C-peptide in the db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 165 Fig. 36. Contents of blood HbA1c level in the db/db mice fed
experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ···· 167 Fig. 37. Albumin concentrations of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks. ··· 169 Fig. 38. Total protein concentration of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 171 Fig. 39. Contents of triglyceride in the liver of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 185 Fig. 40. Contents of total cholesterol in the liver of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 186 Fig. 41. Contents of triglyceride in the mesenteric adipose tissue of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 189 Fig. 42. Contents of triglyceride in the epididymal adipose tissue of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 190 Fig. 43. Contents of total cholesterol in the mesenteric adipose tissue of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 191 Fig. 44. Contents of total cholesterol in the epididymal adipose tissue of db/db mice fed experimental diet with barley leaf powder for 6 weeks ··· 192
ABSTRACT
Effects of Barley Leaf Powder on Lipid Metabolism in Rats and its Antidiabetic Activity
Lee, Yu-Mi
Advisor : Prof. Lee, Myung-Yul, Ph. D.
Department of Food and Nutrition, Graduate School of Chosun University
Barley (Hordeum vulgare L.) is a plant widely distributed and cultivated with food goals, thus, its economical importance is very marked. By these reasons, it has been studied from different point of views. The barley leaf known to contain strong antioxidants such as superoxide dismutase (SOD), vitamin C, vitamin E and -carotene. Also, recent study has confirmed that barley leaf extract β
has antioxidant activity, free-radical scavenging activity, reducing power, and superoxide dismutase-like activity. Therefore the objective of this study was conducted to investigate the effects of powdered barley leaf on major chemical components analysis, antioxidant activities, lipid metabolism, and antidiabetic activities.
This study was investigated on the antioxidative activity of 80%
ethanol extracts from young barley leaf. Total polyphenol, flavonoid and DPPH radical scavenging activity contents of barley leaf ethanol
extract were highly. Also, rancimat test was highly and it was similar to the BHT. The results of effects of barley leaf powder on lipid metabolism in rats fed high fat diet were as follows; The body weight gain and Food intake were gradually decreased in the barley leaf powder fed groups compared with the HF group. The serum AST, and ALP activities were significantly decreased by barley leaf powder administration. Levels of serum HDL-cholesterol level decreased in the HF group and markedly increased in the barley leaf powder fed groups. Levels of total cholesterol and triglyceride in liver and adipose tissues were lower in barley leaf powder administered groups than in HF group. The activities of heparin-releasable lipoprotein lipase (HR-LPL) and total-extractable LPL (TE-LPL) in adipose tissues were increased in HF group than that of ND group, but those of barley leaf powder administered groups were significantly decreased.
This study was to investigate the effect of barley leaf powder of streptozotocin(STZ)-induced diabetic rats. The blood glucose of STZ group was increased than that of N group, and those of STZ-BH group was significantly decreased. Serum insulin concentrations were decreased with STZ group, however, the increased after barley leaf powder administration. The concentration of fructosamine was significantly decreased by barley leaf powder
glucose and serum insulin of Diabetes group was increased than that of Normal group, and those of barley leaf powder administered groups were significantly decreased. The serum C-peptide of barley leaf powder administered groups were significantly increased between Diabetes group. The contents of total glycated hemoglobin was significantly decreased by barley leaf powder groups. The concentration of Albumin and total protein were significantly increased by barley leaf powder groups. The disaccharidse activities, such as maltase, sucrase and lactase in small intestine were inhibited by barley leaf powder groups.
These results suggest that barley leaf powder may improve lipid metabolism of serum, liver and adipose tissue and potentially reduce lipid storage. Also, the barley leaf powder may improve antioxidant activities, lipid metabolism of serum, liver, adipose tissue and potentially reduce lipid storage. And the barley leaf powder might be effective on diabetic mellitus.
제 장 1 서 론
오늘날 현대인들은 식생활 패턴의 변화로 과거에 비해 채소류의 섭취가 감 소하는 반면 지방 육류 및 가공식품 등의 고칼로리 고지방 섭취가 증가하고, , 있다. 2008년 발표한 국민건강영양조사에 따르면 국민 1인당 하루 평균 식품 섭취량은 1,297.8 g으로 이 중 식물성 식품이 전체의 80.5%이고 동물성 식 품이 19.5%로 집계되었다 이는. 1969년 국민건강영양조사에서 발표한 동물 성 식품의 3%에 비하여 무려 6배 이상 증가하였다(1). 2009년 통계청의 사 망원인 통계자료에 의하면 암 뇌혈관 질환 심장 질환 순으로 총 사망자의, , 를 사망원인으로 보고하였다 이처럼 우리나라 사망 원인 중 수위를
47.8% (2).
차지하고 있는 심혈관계 질환의 위험요인으로는 고지혈증 고혈압 당뇨병, , , 비만 과음 흡연 가족력 스트레스 및 성격 등이 있다고 알려져 있으며 특, , , , , 히 비만은 비만 자체로도 질병이 되지만 당뇨병 고혈압 심혈관 질환 뇌졸, , , 중 일부 암 등과 같은 대사질환의 원인이 되므로 근본적인 비만의 치료만이, 이에 수반되는 많은 합병증들을 치료하고 예방할 수 있다(3,4).
비만은 유전적 환경적 사회 심리적 요소가 작용하여 신체 에너지 요구량, , ･ 보다 과잉으로 에너지를 섭취하였을 때 체지방 축적으로 체중이 증가하는 영 양불량의 과열량 상태를 말한다(5). 비만의 경우에는 산업화된 국가에서 흔히 나타나는 가장 심각한 영양문제로 비만의 치료는 약물투여와 수술뿐만 아니, 라 식이요법, 운동, 행동수정 요법들을 병행할 경우 좋은 효과를 나타내며 식이요법은 비만의 예방과 치료에 있어서 가장 중요하고 근본적인 방법 (6),
으로 알려져 있다(7). 이처럼 식이요법의 중요성이 인식되면서 Garcinia
절한 체중감소 등 부작용 발생 등의 문제가 대두되기 때문에 일상적으로 섭 취하여 온 천연식품으로부터 비만치료의 약리활성을 보이는 새로운 기능성식 품의 개발이 절실히 요구되고 있다.
비만으로 인하여 고지혈증 및 당뇨병이 생길 가능성이 높아지고 심혈관계 질환의 발병위험이 커지는데 먼저 고지혈증을 살펴보면 심혈관계 질환 중, , 관상동맥 질환의 가장 중요한 독립인자로 알려져 있다(14-18). 이러한 고지 혈증은 혈액내로 흡수된 중성지방 콜레스테롤 인지질 유리 지방산 등의 지, , , 방들이 단백질과 결합되어 물에 용해된 형태의 지단백질(lipoprotein)로 되는 데 이것을 혈청지질이라 하며 이 혈청지질이 정상수치보다 높은 경우를 고지 혈증이라 한다(19). 고지혈증의 원인으로는 축적된 저밀도 지단백질(low 내의 콜레스테롤이 적절히 제거되지 않는 죽상경 density lipopretein, LDL)
화증으로 발전하게 되는 것과 중성지방 증가 지단백질 증가 고밀도 지단백, , 질(high density lipoprotein, HDL)-콜레스테롤 감소 등을 들 수 있다 체내. 콜레스테롤은 주로 LDL-콜레스테롤에 의해 운반되고 있으며 운반된, LDL-콜 레스테롤은 주로 LDL receptor pathway에 의해 체내로 유입된다고 알려져 있다(20). 이외에도 동맥벽에 존재하는 대식세포를 통한 scavenger pathway 에 의해서도 LDL-콜레스테롤이 유입되는데, 이 경로는 LDL receptor 와는 독립적으로 작용하며 세포 내의 콜레스테롤 함량이 증가함에도
pathway ,
불구하고 계속적으로 에스테르화된 콜레스테롤을 세포 내로 끌어들이고 화, 학적으로 변이된 LDL을 인식하므로 결과적으로 변이된 LDL이 동맥벽 세포내 에 과잉으로 축적되게 된다(21,22). 또한 LDL은 내피 세포의 lipoxygenase에 의해 식품을 통하여 들어온 과산화지질에 의하여 산화 LDL로 산화되는 것으 로 밝혀졌는데(23), 이러한 산화적 스트레스에 의해 생성된 산화 LDL은 세포 독성이 있어 내피세포에 염증을 일으켜 동맥경화를 유발한다(24).
따라서 생체 내에서는 이러한 세포 독성을 스스로 보호하기 위한 방어체계 를 갖추고 있다. 그 방어기전은 항산화 활성효소 superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione
와 활성물질
reductase, glutathione-s-transferase (GST) glutathione
및 이 존재함으로서 의 생성을 억제
(GSH), tocopherol ascorbic acid radical
시킨다(25). 활성산소를 효과적으로 제거하기위해서는 GSH-Px, peroxidase 와 catalase 등과 같이 H2O2를 물과 알코올 등으로 환원시킨다든지
와 같이 을 제거함으로써 생성을 억제하는
carotenoids singlet oxygen radical
방법이 있다(26). 또한 비타민 C, uric acid, 알부민 비타민, E, ubiquinol 등 은 radical을 포획함으로써 산화의 연쇄반응을 억제하며 산화된 인지질을 복, 구해주는 phospholipase, 산화된 단백질을 인식하고 제거해주는 protease 등의 방어 시스템 등의 기작으로 손상된 부위를 재생해주는 작용을 한다
항산화 물질들은 등과 탈수소 반응을 통해 수소원자
(27,28). peroxy radical
를 공여하면서 자신은 보다 안정한 형태의 radical을 생성하고 이들도 나중에 비반응 물질로 전환된다 현재까지 알려진 천연 항산화물질로는 플라보노이. 드와 그 유도체(29), 갈변반응 생성물(30), 아미노산(31) 및 단백질(32)등이 있다 특히 식물체에 함유되어있는. phytochemical 물질들의 유리기 소거 작 용이 규명되면서 식물체를 이용한 산화적 스트레스 억제에 관한 연구가 이루 어지고 있다.
지방 섭취 과다에 운동 부족이 이어지면 유리지방산으로 인해 내장비만이 초래될 뿐만 아니라 혈액 속에도 유리지방이 남게 되어 유리지방산은 간 근, 육 췌장, β-세포 같은 비 지방조직에 유입되어 인슐린 작용의 저해를 비롯한 세포의 기능 장애도 일으키게 된다(19). 결국 췌장의 인슐린 분비세포에 손 상을 가해 당뇨병에 수반되는 각종 합병증을 유발하는 요인이 되기도 한다.
이러한 당뇨병은 고혈당을 특징으로 하는 일련의 대사 질환군으로 발생기전 에 따라 췌장 β-세포를 파괴하는 자가면역과정이 주원인이 되어 인슐린 부족
형 당뇨병은 전체 당뇨병 환자의 약 95%이상을 차지하며(36), 비만으로 인 해 인슐린이 정상적이거나 초과로 분비되지만 그 작용이 효과적으로 이루어 지지 않아 발생하는 것으로 인슐린 저항성이 있다고 하며 상대적인 인슐린, 결핍을 나타낸다(37). 비만의 일반적인 특징으로 나타나는 hyperinsulinemia 는 과도한 복부 비만에 의해 유발된 인슐린 저항성에 의해 나타나며 이것은, 인슐린 target cell인 지방세포에서 후수송체인 인슐린 receptor substrate-1
의 장애에 따른 인슐린 신호 전달 체계 장애 결과
(IRS-1) , glucose
장애에 의해 고혈당이 초래된다 상승된 혈당
transporter 4 (GLUT4) (34,35).
수준은 vascular oxidation 대사의 이상을 초래하며 산소가 불완전하게 산화 되어 생성된 유리기의 활성화로 β-세포의 자동면역기능이 파괴되어 당뇨증상 을 보이게 된다 이처럼 인슐린의 절대적인 부족보다는 과식 또는 과다한 열. 량섭취와 육체적 활동의 감소에 따른 비만증 등으로 인하여 근육이나 지방세 포 등 말초조직에서 인슐린에 대한 감수성이 둔화되어 당대사성 장애를 나타 내는 것이 특징(38)이며 급속한 도시화 및 서구화에 따른 사회경제적 환경, 의 변화 피로 및 스트레스 환경오염 등이 제 형 당뇨병의 발병과 관련 있, , 2 는 것으로 알려져 있다(39).
당뇨병의 지질대사 이상으로는 혈중 중성지방, 총 콜레스테롤의 증가와
콜레스테롤이 감소하는 특징을 보인다 이로 인해 당뇨병의 주
HDL- (40-42).
합병증인 동맥경화의 위험을 높이는 요인이 되며(43), 고중성지방혈증 고콜, 레스테롤혈증 및 지방산 등이 초래되기 쉽고 이로 인한 각종 심혈관계 질환, 의 사망률이 정상인의 2~5배에 달한다고 보고되었다(44). Sato 등(45)이 당 뇨병 환자의 혈장에서 지질과산화물이 증가되어 있음을 처음 발견한 이래 당 뇨병에서 지질과산화가 증가된다는 것이 여러 연구(46,47)에서도 밝혀져 이 를 뒷받침하고 있다 당뇨병에서의 지질과산화의 증가정도는 당화 혈색소 및. 혈당의 조절정도 유병 기간 연령 혈관합병증의 유무 등과 상관관계가 있으, , , 며 이러한 지질과산화의 증가는 생체막의 구조와 기능의 변화 등을 통하여, 당뇨 합병증발생과 연관되는 것으로 증명되었다(48).
고등동물에서 포도당은 특히 뇌와 적혈구의 주 에너지원이고 이러한 포도, 당은 간을 통하여 혈당의 조절 및 유지가 이루어지는데 간에서의 당대사 조 절은 단기적으로는 해당작용에서 glucokinase, phospho fructokinase,
등과 당신생합성에서
pyruvate kinase , glucose-6-phosphatase, fructose-1,6,-bisphosphatase, pyruvate carboxylase, phosphenol 등의 조절효소 활성조절에 의해 일어나며 장기적으 pyruvate carboxykinase
로는 호르몬에 의한 단백질 합성조절에 의해 일어난다(45). 현대 의학으로 당뇨병을 근원적으로 치료할 수 있는 방법은 아직 개발되지 못한 실정이며, 당뇨병의 치료방법으로 식이요법 운동요법과 함께 약물요법이 시도되고 있, 다(49). 하지만 약물요법은 위장장애 급격한 혈당감소 등의 부작용을 나타낼, 수 있으며 식이치료를 위한 자연식용식물은 영양학적 및 생리활성 측면에서, 높은 가치가 인식되어지고 있어 현재 당뇨병 환자의 약 70%가 민간요법에 따라 80~130여종에 이르는 항당뇨 효능이 있는 천연물질을 사용하는 것으로 알려져 있다(49).
당뇨치료를 위해서 당뇨환자들은 쉽게 혈당을 조절할 수 있다는 생각으로 민간요법 소재들을 충분한 과학적인 검토가 이루어 지지 않았음에도 불구하 고 일반적으로 상용화하고 있는 실정이다 이러한 무분별한 건강기능성 식품. 에 대한 이용은 당뇨를 악화시키고 합병증을 증가시키는 부작용을 초래할, 수 있으므로 건강기능성 식품의 오용과 남용을 막기 위하서는 과학적 근거를 토대로 한 건강식품의 정보제공이 매우 중요하다 그러므로 천연물로부터 혈. 당 조절에 도움을 주면서 부작용이 적은 소재를 찾고자 하는 연구가 활발히 진행 중이다(50).
발아 채소(seed sprouts)는 어린잎의 채소를 총칭하며, 일반적으로 새싹
드(Salad), 그리고 피자(Pizza) 등 다양하게 이용되고 있다 새싹채소는 성숙. 한 채소에 비하여 기능성 성분인 비타민과 무기질을 비롯한 식이섬유소와 생 리활성물질을 다량 함유하고 있다 예를 들어 메밀은 발아 시 특히. rutin의 함량이 크게 증가하는데 메밀종실과 이를 발아한 메밀 싹의 rutin 함량을 비 교해보면 Kim 등(51)의 연구에서는 메밀 싹에서 약 18 , Kim배 등(52)의 연 구에서는 약 27배까지 증가하는 것으로 나타나 rutin 공급원으로써 메밀 싹을 섭취하는 것에 대한 관심이 커지고 있다 우리나라 고유의 전통식품으로 알. 려진 콩나물은 가격이 저렴하고 기호성이 높아 대중 식생활에서 많이 이용되 어진다 특히 원료가 되는 콩이 발아되어 생장하는 과정에서 체내대사가 이. 루어짐으로서 섬유소는 증가하며 비타민 C와 A의 함량이 증가하고 소화율을, 증진시키면서 가스발생인자와 특히 trypsin inhibitor의 활성을 감소시킨다는 보고가 있다(53-55). 유채는 발아과정 중 필수아미노산과 항산화비타민 함량 이 현저히 증가되었고(56), 무순은 항산화비타민, 식이섬유소 및
함량이 높으며 알팔파 싹은 을 비롯하여 양
isothiocyanates (57), polyphenol 질의 단백질 불포화지방산 및 식이섬유소가 풍부하다, (58).
발아 채소는 생장이 빠르고 생산량이 많으며 신선하고 부드러워서 소비자, , 에게 좋은 식미감을 제공한다 또한 오늘날 사회문제로 대두되고 있는 농약. 의 잔류 독성 같은 식품공해 문제를 해소할 수 있는 무 오염 무공해 재배, 등으로 안전하게 식품을 섭취할 수 있는 장점을 가지고 있다 발아채소의 생. 리활성 효능 검증에 관한 연구로는 무순 싹은 당뇨유발 실험동물의 고혈당을 완화시켜 항당뇨 효과가 있는 것으로 보고(59)되었다 메밀채소 추출물은. in
vitro 연구에서는 콜레스테롤 생합성의 주된 조절효소인 HMG-CoA
활성 저해효과가 있으며 메밀채소 분말은
reductase , in vivo 연구에서 간 조
직 및 혈청 지질대사 개선효과가 있는 것으로 알려졌다(60). 알팔파 싹에서 추출한 사포닌을 급여한 실험동물에서는 혈청 콜레스테롤 저하작용이 있는 것으로 보고(61)되었고, Seo 등(62)은 4주간 사람에게 발아생식을 섭취한 후 체중과 피하지방 두께의 감소 혈당 및 혈청지질 성분이 개선되었다고 하였,
다 또한 고지방식이를 급여한 흰쥐의 경우 새싹채소 분말 급여로 지질대사. 개선효과와 항비만 효과가 있음을 관찰(63)하였고 Lee 등(64)의 연구에 의해 브로콜리 싹 에탄올 추출물 투여로 흰쥐의 콜레스테롤 저하효과와 항비만 효 과를 보고하였다 그러므로 발아채소의 다양한 생리활성 성분과 풍부한 영양. 소의 함유로 건강에 대한 관심이 날로 증가하고 있는 현대인들에게 소비 욕 구가 커지고 있는 것으로 예상된다 현재 재배되고 있는 발아채소의 종류는. 보리 메밀 무 알팔파 브로콜리 양배추 등이 다양하게 시판되고 있다 특, , , , , . 히 보리순은 단백질과 각종 비타민 효소 무기질 등 다양한 생리활성 물질이, , 함유하고 있어 새로운 건강식품으로 사용될 수 있는 가능성을 제시하고 있다 그러나 현재 보리순 가공 분말 형태의 제품이 시판되고 있지만 과학적
(65). ,
이고 체계적인 생리활성 연구가 우선적으로 선행되어 효능 검증이 필요하므 로 본 실험의 시료로 사용하게 되었다.
보리는 (Hordeum vulgare L.)는 외떡잎식물 벼목 화본과에 속하는 두해살 이풀로 높이는 약 1m 정도이다 세계적으로 다양하게 분포되어는 보리의 생. 산량 중 대부분이 소 양 돼지 및 가금류 등의 가축을 위한 사료로 급여될, , 뿐만 아니라 탄수화물 단백질 지질 비타민 등 다양한 영양성분을 골고루, , , 함유하고 있어 식용과 양조용으로 이용하고 있다(66). 우리나라를 비롯한 동 양에서는 주로 식량으로 쓰며 그밖에 소주 맥주 된장 고추장 엿기름 보, , , , , , 리차 등으로 이용되고 있다 곡류를 주식으로 하는 우리나라에서는 쌀 다음. 으로 보리가 높은 소비가 이루어 졌지만 농산물 수입개방화와 더불어 식생, 활 변화에 따른 우유 및 육류 가공품의 소비 증가로 쌀을 비롯한 곡류의 소 비가 날로 감소되어 왔다 이에 따라 농가소득을 향상 시킬 수 있는 작목의. 선정과 동시에 국제 경쟁력 있는 다양한 가공제품 개발이 중요한 과제가 되
보리의 잎은 잎집 잎몸 잎귀 잎혀로 구성되어 있으며 대부분 보리의 줄기, , , , 당 잎의 수는 9~11엽 정도가 발생하는데 본엽의 발생은 초엽 다음부터 발생 하여 아래로부터 제 본엽 제 본엽 등으로 부른다 보리 잎 중 초엽이 발생1 , 2 . 한 후 약 20 cm 전후의 보리잎 추출물의 분말품은 건강기능성식품의 형태로 일본과 기타 다른 여러 국가에서 폭넓게 이용되고 있다(66). 보리 잎을 이용 할 때의 장점은 파종 이후 유휴경지를 이용할 수 있다는 장점 및 가격 경쟁 력이 있고 겨울에 재배되므로 병충해의 피해가 적고 농약을 뿌리지 않아 완, 전무공해 원료라고 할 수 있다(69). 또한 다양한 영양소 및 생리활성 물질이 풍부하게 들어있어 건강기능성 식품으로의 이용가능성이 크게 주목받고 있, 다.
보리잎에 대한 연구로는 주로 미국 일본에서 주로 진행되고 있는데 보리, 잎의 추출물은 강력한 항산화효소인 SOD가 풍부하고, vitamin C, vitamin E,
이 다량 함유되어 있다 보리잎 내에 함유되어 있는 는
-carotene (70). SOD
β
생체 내에서 생성된 활성 산소를 과산화수소로 전환시키고 과산화수소는
와 에 의해 무독한
catalase glutathione peroxidase H2O로 전환되며 이 과정 에서 세포는 산소독으로부터 보호된다고 보고하였다(71). SOD는 free 을 근본적으로 제거하는 효소이고 다른 종류의 항산화제 보다 우수한 radical
효과를 나타내는데 보리잎에는 SOD가 490 units/g 이상이 함유되어(72) 있 어 활성산소를 제거해주는 능력이 뛰어난 것으로 밝혀졌다. 또한 Park 등
의 연구에서도 다양한 방법으로 건조한 보리 잎의 유사활성이
(69) SOD 90%
이상으로 높게 측정되어 천연항산화제 tocopherol, sesamol 및 합성항산화 제 BHT보다 유의적으로 높음을 보고하였다. 보리잎의 기능성 물질은 으로 잎 추출물에서 이미 확인된 바 있으며 특히 등
C-glycoslyflavone , Kitta
은 보리잎은 항산화 능력이 매우 강력하다고 보고하였는데 보리잎에 함 (73)
유된 2"- -glycosylisovitexinο 은 물과 알코올에 모두 용해 가능하며 고온에, 안정적이고 pH의 영향을 크게 받지 않는 항산화물질로서 UV로 유발된 피부 지질의 산화 해를 비타민 E의 50 ,배 항산화제인 BHT의 30배 이상으로 방지
하였으며 동맥경화를 비타민, C보다 더욱 강하게 방지하였다고 발표하였다. 또한 Lyman 등(74)은 2"- -glycosylisovitexinο 의 flavonoid는 여성호르몬 과 같은 작용을 하여 여성 생식기의 정상적 기능에 도움을 주고 (estrogen)
골 소실을 감소시켜 골다공증을 예방할 수 있으므로 폐경기 여성에게 도움이
될 수 있을 것으로 보고하였다.
은 보리 잎에서 발견된
Saponarin(6-c-glycosyl-7-0-glucosylapigenin)
계 항산화 물질로 알려져 있어 등 의 연구에서도 품종별
flavone (75), Ryu (66)
보리잎의 생육에 따른 saponarin 함량을 연구한 결과 본엽이 5매 일 때 함량이 가장 많은 것으로 나타나 내동성과 항산화 활성이 높은 것 saponarin
으로 조사되었다 이처럼 곡류나 채소 과일에 포함된. , flavone계의 항산화 물 질은 free radical로 인해 유발되는 활성산소를 제거 또는 생성을 저해하는 것으로 알려져 생체를 보호하기 위해 천연으로 존재하는 물질로서 많은 관심 이 높아지고 있다.
보리잎의 추출물에서 항염성 항류마티스염 활성과 궤양상해 치료효과 항, , 산화 항알러지 항암 항궤양 항바이러스 등의 기능이 나타난다고 보고, , , , (76)
하였고, 보리의 어린잎이 백색광 등 저에너지의 광을 받을시
의 생성이 증가하고 색소체에 많이 축적된다고 하였다 C-glycosylflavone ,
등 은 보리차가 녹차에 비하여 항산화력과 산화 억
(77,78). Ohmori (79) LDL
제효과가 약한 것으로 보고하였으나, Jang 등(80)은 보리잎차의 DPPH(1, 소거능과 아질산염 소거능이 녹차보다 약하나 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
유사 활성은 녹차보다 높아 보리잎차가 활성 산소종 활성을 억제하는 SOD
능력이 높다고 보고하였다. Kim 등(70)이 보리잎 분말차의 제조와 그 품질특 성에서 보리순 분말차는 식이섬유, β-카로틴 무기질 아미노산의 함유량이, ,
수하였으며 비타민, C, E 등과 함께 섭취 시 제 형 당뇨환자의 혈관계 질환2 이 예방될 수 있음을 제시하였다 또한. Yu 등(83)은 매일 15g의 어린 보리잎 추출물을 고지혈증 환자에게 4주간 급여한 결과 혈중의 지질 감소와 LDL 산 화가 저해되는 것으로 보고하였다.
그러나 예로부터 우리나라에서 보리순의 소비형태는 일부 전라남도지역에 서 떡과 된장국에 넣어 먹거나 생즙을 짜서 먹는 수준의 이용 뿐 다른 지방 에서는 이용하고 있지 않은 실정이므로 현대적 수요경향에 맞는 다양한 형, 태의 보리 잎 가공 형태의 보리 가공제품을 개발하기 위한 기초 자료가 필요 한 실정이다 또한 보리순은 다양한 생리활성 성분과 영양소를 함유하고 있. 으나 이들 성분들의 동물실험을 통한 체계적인 효능 검증은 이루어지지 않은 실정이다.
따라서 본 연구에서는 보리순의 항산화 물질인 SOD, vitamin C, vitamin
과 기능성 물질로 알려져 있는 및
E, β-carotene C-glycoslyflavone
그리고 수용성 식이섬유소가 풍부해 비만과 항당뇨 효능이 있으리 saponarin
라고 사료되어 먼저 일반성분과 영양성분 분석을 통해 보리순의 영양 가치를 평가하고, in vitro에서 DPPH radical 소거능과 rancimat을 통해 항산화성을 밝힘으로써 신선한 채소로의 이용은 물론 기능성 식품의 소재로서의 가치를 밝히고자 한다 또한 보리순의 생리활성 효능의 검증을 위하여 고지방식이를. 급여한 흰쥐의 혈청 및 지방조직의 지질대사 개선 효과에 미치는 영향에 대 하여 알아보고자 한다 그리고 국내의 경우 당뇨를 유발한 동물모델에서 보. 리잎을 대상으로 당뇨 개선 기전에 관한 발표된 자료는 거의 없는 실정이다.
그러므로 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐에 streptozotocin (STZ)을 주입하여 당뇨를 유발시킨 실험동물모델을 대상으로 제 형 당뇨에 미치는 영향을 규명1 하고자 한다 또한. C57BLKsJ db/db 마우스는 렙틴수용체의 돌연변이로 인 해 고혈당 고인슐린혈증 다식 비만 인슐린 저항성 고렙틴혈증 다양한 대, , , , , , 사적 이상을 특징으로 하는 동물모델로 제 2형 당뇨병 환자와 유사한 증상을 보이므로 당뇨병과 관계된 대사이상의 연구에 유용하다(84). 그리하여 본 실
험에서는 보리순 분말을 통하여 C57BLKsJ db/db 마우스에 6주 동안 보리순 분말식이를 통해 제 2형 당뇨에 미치는 영향도 알아보고자 시도하였다 이러. 한 생리활성 구명을 통하여 건강기능성 식품 제조용 신소재 개발의 기초 자 료로 제공하여 보리순의 이용성을 증대시키는데 기여하고자 한다.
제 장 2 재료 및 방법
제 절 실험재료 1
본 실험에 사용한 보리순(Barley leaf)은 울진군 서면 삼근리에서 재배된 것으로 2008년 3월 한농마을영농조합법인에서 구입하였다. 보리 순은
일정도 자란 것으로 정도의 잎 부분만을 사용하였다 보리순을
10 10 cm .
수세, 정선 및 탈수과정을 거쳐 -70℃에서 동결한 후 동결건조기에서 건조하여 분쇄기로 마쇄하여 시료로 사용하였다.
제 절 성분분석 2
일반성분 및 식이섬유소 1.
보리순의 일반성분은 Association of Official Analytical 방법 에 준하여 수분은
Chemists(A.O.A.C.) (85) 105℃ 상압가열건조법 조단백질은, micro-kjeldahl법, 조지방은 soxhlet 추출법 및 조회분은 회화법으로 분석하였고 탄수화물은, 100에서 수분, 조단백질 조지방 조회분을 제외한, , 값으로 나타내었다.
보리순의 식이섬유소 함량은 Prosky 방법(86)에 의하여 불용성 식이섬유소(insoluble dietary fibers) 및 수용성 식이섬유소(soluble dietary 함량을 분석하여 총 식이섬유소 함량을 구하였으며 실험에 사용한
fibers) ,
효소들은 dietary fiber kit 시약(Sigma, TDF-100A, USA)을 사용하였다. 시료를 1 g씩 2개 칭량하여 500 mL flask에 취하고 phosphate buffer (pH
와 의 를 넣은 후 끓는 물속에 6.0) 50 mL 100 mL heat-stable amylase
분간 반응하였다 실온으로 냉각시킨 후 를 로 조절하고
30 . pH 7.5±0.2 100
를 넣어 의
mL protease 60 ℃ shaking water bath(Hanbaek, HB-205SW,
에서 분간 반응시킨 후 냉각한다 다시 를 로 조절하고
Korea) 30 . pH 4.5±0.2
의 를 넣어 에서 분간 두고
0.3 mL amyloglucosidase shaking water bath 30
실온으로 냉각하여 P2 cruicible 여과기로 여과하였다. 여과 후 잔유물이 들어있는 P2 crucible을 105 ℃ oven에 넣어 건조시켜 칭량한 후 회분 함량과 단백질 함량을 뺀 값을 불용성 식이섬유소 함량으로 하였다 수용성. 식이섬유소 함량은 여액에 4배량의 95% ethanol을 넣어 1시간 정치시키고 여과기로 여과하여 잔유물을 건조 칭량한 후 회분 함량과
P2 cruicible ,
단백질 함량을 뺀 값으로 구하였다 이때 시료의 식이섬유소가 들어있는 두. 개의 P2 crucible 중 한 개는 525 ℃ oven에 5시간 회화시킨 후 칭량하여 회분함량을 측정하였고 나머지 한 개는 micro-Kjeldahl 방법에 준하여 단백질 함량을 측정하였다 시료의 불용성 식이섬유소와 수용성 식이섬유소. 농도는 다음과 같이 계산하였다. 측정치는 3회 반복하여 측정한 수치의 평균값으로 나타내었다.
부위별 식이섬유소 농도(mg/g)
[(R1+R2)/2]-P-A-B
= ×100
(m1+m2)/2 각각 개 잔유물의 무게
R1, R2 : 2 (g)
구성 아미노산 2.
구성 아미노산의 분석은 분해관에 시료 0.5 g과 6 N HCl 3 mL를 취하여 탈기하고 121℃에서 24시간 가수분해한 다음 여액을 rotary vacuum
로 감압 농축하여
evaporator ・ sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 10 mL로 정용하였다 용액. 1 mL를 취하고 membrane filter (0.2 μM)로 여과한 다음 아미노산자동분석기(Biochrom 20, Phamacia, England)로 분석하였으며 분석조건은 Table 1과 같다.
Table 1. Operating conditions of Amino Acid Autoanalyzer for amino acids
Item Condition
Instrument Biochrom 20 (Phamacia UK)
Buffer solution Sodium phosphate buffer (pH 7.0)
Reagent Ninhydrin (Phamacia)
Inj. volume 20 μL
지방산 3.
지방산 분석은 A.O.A.C.방법(85)에 준하여 시료 5 g을 blender로 균질화한 후 클로로포름 10 mL와 메탄올 20 mL을 가하고 2분간 균질화 다음 클로로포름 10 mL을 가하여 30초간 분사시켰다 여과 후. 30분간 방치한 후 상층을 제거하고 무수 Na2SO4를 가하여 탈수한 다음 rotary vacuum
로 감압 농축하였다 지방 을 톨루엔
evaporator ・ . 100 mg 5 mL에 용해하고
BF3-MeOH으로 메칠화하여 Gas Chromatography (GC-17A, Shimadzu,
로 분석하였으며 분석조건은 와 같다
Japan) Table 2 .
Table 2. Operating conditions of Gas Chromatography for fatty acids
Item Condition
Instrument GC-17A (Shimadzu, Japan)
Column SP™-2560 capillary column (100 m length × 0.25 mm i.d. × 0.25 μm film thickness) Column temp. 170 (5 min.) to 250℃ ℃(10 min.) at 4 /min.℃
Injector temp. 230℃
Detector temp. FID 270℃
비타민 및 4. A , E C
비타민 A와 비타민 E 분석은 Table 3과 같이 식품공전법(87)의 시험방법을 기준으로 수행하였다. 시료 0.5 g, ascorbic acid 0.1 g 및
를 취하여 에서 분간 가열한 후 용액
ethanol 5 mL 80℃ 10 50% KOH 0.25
를 첨가하고 분간 가열한 다음 증류수 와 를
mL 20 24 mL hexane 5 mL
가하여 1,150 ×g에서 20분간 원심분리 하였다 상징액을 분리 후. hexane 를 가하고 원심분리하여 상징액을 분리한 다음 증류수를 가하여 40 mL
분간 방치 후 하층을 제거하였다 이 과정을 회 반복한 후 전 용액을
10 . 3
합하여 Na2SO4로 탈수하고 rotary vacuum evaporator로 hexane을 감압 농축한․ 후 HPLC (LC-10AVP, Shimadzu, Japan)로 분석하였으며 분석조건은 Table
과 같다
3 .
비타민 C 함량은 각 추출물을 0.2 μm membrane filter (No. 2)로 여과하여 HPLC로 분석하였으며, 분석조건은 Table 4와 같다. 표준곡선은 를 L(+)-ascorbic acid (Shinyo Pure Chemicals Co., LTD., Japan) 표준시약으로 사용하여 최종농도가 25, 50, 75, 100 ppm이 되도록 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
Table 3. Operating conditions of HPLC for vitamin A and E
Item Condition
Instrument LC-10AVP (Shimadzu, Japan) Column Shim-pack GLC-ODS (M) 25 cm Eluent acetonitrile : isopropanol = 95 : 5 Flow rate 1 mL/min.
Inj. volume 10 μL
Detection Retinol : SPD-10A (UV-VIS Detector 254 nm) Tocopherol : RF-10A (Spectrofluorometric Detector)
Table 4. Operation conditions of HPLC for vitamin C
Item Condition
Instrument Young-Rin Associates
Column μBondapak C18 (3.9×300 mm) Mobile phase 0.1% phosphoric acid on water
유기산 5.
유기산 분석은 A.O.A.C.방법(85)에 따라 시료 1 g에 증류수 50 mL를 가하여 80℃ 수조에서 4시간 가열한 다음 Whatman filter paper (No.2)로 여과하고, 여액을 rotary vacuum evaporator (Eyela, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 증류수・ 10 mL로 정용하여 Ion Chromatography (DX-600,
로 분석하였다
Dionex, USA) (Table 5).
Table 5. Operating condition of Ion Chromatography for organic acids
Item Condition
Instrument DX-600 (DIONEX, USA) Column IonPac ICE-AS6 analytical
Eluent 0.4 mM heptafluorobutyric acid
Reagent 5.0 mM tetrabutylammonium hydroxide
Flow rate 1.0 mL/min.
Inj. volume 20 μL
Detection surpressed conductivity, AMMS-ICEⅡ
무기질 6.
무기질 분석은 A.O.A.C.방법(85)에 따라 시료 0.5 g, 20% 질산 10 mL 및 60% HClO4 3 mL를 취하여 투명해질 때까지 가열한 후 0.5 M 질산으로 50
정용하였다 분석항목별 표준용액을 혼합 후 다른 에 씩 취하여
mL . vial 8 mL
표준용액으로 하였고 0.5 M 질산을 대조구로 하여
원자흡수분광광도계(AA-6501GS, Shimadzu, Japan)로 분석하였으며, 분석조건은 Table 6과 같다.
Table 6. Operating condition of Atomic Absorption Spectrophotometer for minerals
Item Condition
Instrument AA-6501GS(Shimadzu, Japan)
Lamp Item Ca Fe K Mg Mn Cu Na Zn
Wave
length(nm) 422.7 248.3 766.5 285.2 279.5 324.8 589.0 213.9
Current(mA) 10 12 10 8 10 6 12 8
Slit
Width(nm) 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5 0.2 0.5
Lighting
Mode BGC-D2 Non-BGC BGC-D2 BGC-D2 Non-BGC BGC-D2 Non-BGC BGC-D2
구성당 7.
구성당 분석은 Gancedo 방법(88)에 준하여 실시하였다 시료. 1 g에 80%
를 가하여 에서 로 시간 가열한 다음
ethanol 50 mL heating mentle 75℃ 5 로 여과하고 여액을
Whatman filter paper (No. 2) rotary vacuum
에서 감압 농축 후 로 정용하여
evaporator ･ 10 mL Ion Chromatography
로 분석하였으며 분석조건은 과 같다
(DX-600, Dionex, USA) , Table 7 .
Table 7. Operating condition of Ion Chromatography for free sugars
Item Condition
Instrument DX-600 (Dionex, USA)
Column CarboPac TM-PA10 Analytical
Eluent 18mM NaOH
Flow rate 1.0 mL/min.
Inj. volume 20 μL
Detection ED50 Intergrated Amperometry
제 절 3 In vitro 에서 항산화 물질의 함량 및 활성 측정
시료추출 1.
건조된 보리순 분말을 100 g당 80% ethanol 1500 mL를 첨가한 후 환류냉각관을 부착한 65℃의 heating mantle에서 3시간씩 3회 추출한 다음
로 여과하였으며 여액을 수욕상에서
Whatman filter paper (No.2) , 40℃ rotary 로 용매를 제거하고 감압 농축한 후 시료의 산화를 방지하기
vacuum evaporator ․
위해 -70℃에 냉동 보관하였다.
총 함량
2. polyphenol
총 polyphenol 함량은 Folin-Denis (89)법 에 따라 측정하였다. Test tube에 시료 1 mL와 Folin reagent 2 mL을 넣은 후 실온에서 3분간 정치한 다음 10% Na2CO3 2 mL을 첨가하였고 이를 혼합한 후 30℃에서 40분간 정치하였으며, UV-spectrophotometer(Shimadzu UV-1601PC, Kyoto,
를 사용하여 에서 흡광도를 측정하였다 표준곡선은
Japan) 760 nm . tannic
를 이용하여 최종농도가 가 되도록
acid 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL 작성하였으며 이 검량곡선으로부터 시료중의 폴리페놀 함량을 구했다, .
총 함량 3. flavonoid
총 flavonoid 함량은 Davis법을 변형한 방법(90)에 따라 측정하였다 시료.
에 를 첨가한 다음 을 넣고
1 mL diethylene glycol 2 mL 1N NaOH 20 μL
에서 시간 동안 반응시킨 후 로
37℃ water bath 1 UV-spectrophotometer 에서 흡광도를 측정하였다 표준곡선은 을 이용하여 최종 농도가
420 nm . rutin
및 가 되도록 조제하였으며 이
0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 1.0 mg/mL , 검량곡선으로부터 시료중의 총 flavonoid 함량을 구했다.
소거능 4. DPPH radical
보리순 분말 추출물의 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법(91)을 이용하여 측정하였다. 보리순 분말 추출물 1mL와 0.2 mM
를 에 취한 후
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 1 mL test tube
혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켜 UV-spectrophotometer를 사용하여 에서 흡광도를 측정하였다 이때 활성의 비교를 위하여 합성
517 nm . ,
항산화제인 BHA, BHT를 이용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 보리순 추출물의 라디칼 소거능은 (1-시료첨가구의 흡광도 무첨가구의/ 흡광도)×100에 의하여 계산하여 나타냈다.
에 의한 항산화능 측정 5. Rancimat
보리순 분말 추출물에 포함된 용매를 완전히 제거한 함량이 600 ppm이 되도록 soybean oil(Sigma co., USA)에 첨가하고, 초음파(Ultrasonic
를 이용하여 시료 추출물과 유지가 잘
processor, UCX-750, USA)
혼합되도록 하였다. Rancimat의 측정 조건은 시료 3.0 g을 반응용기(reaction vessel)에 취하고 증류수 70 mL을 측정용기(measuring
에 넣은 후 에서 로 하여 산화안정성을
vessel) 110℃ air flow rate 20 L/h
비교하였다(65). 모든 측정치는 3회 반복 실험하여 얻은 값의 평균치로 표시하였다 기존의 상업용 항산화제인. BHT를 유지에 대해 첨가하여 양성 대조군으로 비교 실험하였다.
제 절 4 In vivo 에서 지질대사 개선 및 비만억제효능
실험동물의 사육 및 식이 1.
실험동물은 Sprague Dawley계 5주령 웅성 흰쥐 32마리를 중앙실험동물 주 에서 구입하여 조선대학교 실험동물센터에서( ) 1주일 동안 고형 배합사료 삼양사료 와 물로 적응시킨 후 평균체중( ) 155~160 g인 것을 난괴법에 따라 각 처리구당 8마리씩 4군으로 나누어 임의배치하고 stainless steel cage에 1마리씩 분리하여 4주간 사육하였다. 실험군(Table 8)은 정상식이군(ND), 고지방식이군 대조군( , HF), 고지방식이와 5% 보리순 분말 첨가군(HF-BL), 고지방식이와 10% 보리순 분말 첨가군(HF-BH)으로 나누어 실시하였다 실험에 사용된 식이는. AIN-93을 기준(92)으로 Table 9와 같이 조제하였다. 정상식이군은 식이무게의 10%의 라아드를 지방 급원으로 사용하였고, 고지방식이군은 식이무게의 20%의 라아드를 함유한 식이를 공급하였다. 보리순 분말 첨가량은 식이 무게의 5%와 10%로 하여 첨가하였다. 물과 식이는 제한 없이 공급하였고 사육실 온도는 18±2℃로 유지하였으며 조명은 12시간 주기(08:00~20:00)로 조절하였다. 최종 체중에서 실험개시 전의 체중을 감하여 체중증가량으로 표시하였고,
체중증가량을 동일 기간의 식이섭취량으로 나누어 각 실험군의
식이효율(FER)을 구하였다.
Table 8. Experimental design
Groups Diet composition
ND1) Basal diet
HF2) High fat diet
HF-BL High fat diet + 5% of Barley Leaf powder HF-BH High fat diet + 10% of Barley Leaf powder
1),2)
Modified AIN-93 diet(92).
Table 9. Composition of experimental diet
(g/kg diet)
Diet composition ND HF HF-BL HF-BH
Casein 200.0 200.0 200.0 200.0
L-cystine 1.8 1.8 1.8 1.8
Corn starch 501.2 451.2 351.2 301.2
Sucrose 100.0 100.0 100.0 100.0
Cellulose 50.0 - 50.0 50.0
Barley Leaf
powder - - 50.0 100.0
Lard 100.0 200.0 200.0 200.0
Mineral mix1) 35.0 35.0 35.0 35.0
Vitamin mix2) 10.2 10.0 10.0 10.0
Choline bitartate 2.0 2.0 2.0 2.0
1),2)
AIN-93-MX mineral mixture and AIN-93-VX vitamin mixture(91).
실험동물의 처리 2.
실험동물은 사양시험 종료 후 12시간 절식시킨 후 CO2로 가볍게 마취한 다음 단두 절단하여 혈액을 채취하고 1,150 ×g, 5℃에서 20분간 원심분리 시킨 후 혈청을 분리하여 혈청 지질 함량 및 효소 활성 측정용 시료로 사용하였다. 그리고 간과 지방조직을 적출하여 0.9% 생리식염수로 남아 있는 혈액 및 기타 부착물질을 제거하고 여지로 수분을 제거한 후 중량을 측정한 다음 효소 활성 저하를 예방하기 위해 급속 동결하여 -70℃의
에 보관하였다 deep freezer (MDF-U52V, Sanyo, Japan) .
혈청 및 활성 및 포도당 함량 측정
3. ALT, AST ALP
혈청 중 alanine aminotransferase (ALT), asparate aminotransferase 활성과 포도당의 함량은 혈액생화학적 (AST), alkaline phosphatase (ALP)
검사 자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm, Japan)를 사용하여 측정하였다.
혈청 지질함량 측정 4.
혈청 중 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), HDL-콜레스테롤 함량은 혈액생화학적 검사 자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm, Japan)를 사용하여 측정하였다. LDL-콜레스테롤 함량은 Friedwald식 {총콜레스테롤
콜레스테롤 중성지방
- (HDL- - /5)}(93 에) 의하여 계산하였다.
콜레스테롤의 총콜레스테롤에 대한 비율은 콜레스테롤을
HDL- HDL-
총콜레스테롤로 나누어 계산하였다. 심혈관계질환의 위험도 판정에
이용되는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 {(총콜레스테롤 -
콜레스테롤 콜레스테롤 에
HDL- )/HDL- }(94) 의하여 구하였으며,
심혈관위험지수(cardiac risk factor, CRF)(94)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로 나누어 구하였다.
간조직의 지질 함량 측정 5.
간조직의 중성지방과 총콜레스테롤 함량 분석을 위하여 먼저 Folch 방법 에 의하여 간조직에서 총지질을 추출하였다 적출한 간조직 중 을
(95) . 0.1 g
칭량하여 6 mL CHCl3-MeOH(2 : 1, v/v)을 첨가하여 냉장상태에서 3일간 방치한 후 H2O를 첨가하고 1,150 ×g에서 20분간 원심분리 시킨 후 지질층인 하층부를 취한 다음 총콜레스테롤과 중성지방 함량 분석을 위하여 사용하였다. 총콜레스테롤 함량은 Zlatkis와 Zak의 방법(96)에 의하여 측정하였으며 중성지방함량은, Biggs 등(97)의 방법으로 측정하였다.
지방조직의 지질 함량 측정 6.
적출한 장간막지방조직과 부고환지방조직은 Folch 등(95)의 방법으로
지방을 추출한 후 간조직의 지질 함량 측정과 동일한 방법으로
총콜레스테롤과 중성지방 함량을 측정하였다.
7. 지방조직 LPL 활성
은 지방조직의 세포내액 및 세포외액 모두에 존재한다 따라서
LPL .
지방조직 부위별 LPL 활성 및 LPL이 지방조직내에 어떻게 분포되어 있는지를 알아보기 위하여 다음과 같은 두 가지 방법에 의하여 측정하였다.
가 . Heparin-releasable LPL (HR-LPL) 활성
에 존재하는 을 와
Extracellular fraction LPL Nilsson-Ehle Schotz 방법(83)을 응용한 Fried와 Zechner 방법(98)에 의하여 측정하였다. 지방조직 약( 20~40 mg)을 1% BSA와 heparin(10 mU/mL)를 함유한 0.5 mL MI99(Hanks salts)에 넣은 후 진탕수욕조 24℃에서 45분간 배양하여 효소분석용 시료로 하였다. 효소활성을 위한 기질은 3H-triolein에
과 을 넣고 냄새가 없어질 때 까지 질소가스를
phosphatidylcholine triolein
용액표면에 쐬어준 후, glycerol을 첨가하여 6분정도 sonication시켜 제조했다. 효소반응은 배양시킨 효소분석용 시료 150 μL와 3H-triolein
나. Total extractable LPL (TE-LPL) 활성
이 분석방법은 extracellular fraction 뿐만 아니라 intracellular fraction 까지 즉 microsome 안에 있는 잠재적인 LPL 활성까지도 포함된 지방조직내 총체적인 LPL 활성을 측정하는 방법이다. TE-LPL 활성은 lverius와
의 방법 으로 먼저 인 로 을 추출한
Brunzell (99) detergent deoxycholate LPL
다음 LPL 활성을 측정하였다 지방조직 약. ( 50 mg)은 0.5% deoxycholate을 함유한 ice-cold buffer(0.5% deoxycholate, 0.2 M Tris, 0.25 M sucrose, 를 1% BSA, 10 U/mL heparin, 0.02% nonidet P40, pH 8.3) 0.2~0.3 mL 첨가하여 glass homogenizer로 균질화한 후 6초 동안 짧게 sonication 시켰다.
시료를 eppendorf microcentrifuge를 이용하여 12,000 rpm, 15분간 (4 )℃ 원심분리 시킨 후 TE-LPL 활성을 측정하기 위하여 fat cake 아랫부분인 하층액을 취했다. 이 하층액은 deoxycholate를 함유하지 않은 ice-cold
와 로 희석하였다 희석액 를 첨가하여 에서 시간
buffer 1 : 5 . 150 μL , 37℃ 1
동안 배양시킨 후 HR-LPL 활성 측정방법과 동일한 방법으로 radioactivity를 측정하여 계산하였다.
8. 통계처리
본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS (Statistical Package for Social Science)를 이용해서 통계 분석하였다. 실험군당 평균 표준오차로± 표시하였고 통계적 유의성 검정은 일원배치 분산분석, (one-way analysis of
을 한 후 수준에서 를 이용하여 상호
variance) p<0.05 Tukey's test 검정하였다.
제 절 당뇨효능 실험 5
1. In vivo 에서 당뇨효능 실험
가 제 형 당뇨 . 1
(1)
실험동물
실험동물은 Sprague Dawley계 4주령 웅성 흰쥐 32마리를 중앙실험동물 주 에서 구입하여 조선대학교 실험동물센터에서( ) stainless steel 에 한 마리씩 주일 동안 고형 배합사료 삼양사료 와 물로 적응시킨 후
cage 1 ( )
평균체중 135~140 g인 것을 난괴법에 따라 각 처리구당 8마리씩 4군으로 나누어 4주간 사육하였다.
당뇨유발의 방법으로는 신선한 0.5 M citrate buffer (pH 4.5)에 스트렙토조토신(STZ, S0130, Sigma Co.) 50 mg/kg B.W.을 용해하여 평균 체중 약 200 g인 수컷 쥐의 대태부 근육에 1회 주사하여 실험적으로 당뇨를 유발하였고 정상군은 동량의, 0.5 M citrate buffer를 주사하였다 당뇨유발의. 확인은 streptozotocin 주사 4일 후 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당 측정기(Accu-chek, Roche, Germany)로 혈당을 측정하고 혈당량이 300
이상인 동물을 당뇨가 유발된 것으로 간주하여 주간 사육하였다
mg/dL 4 .
식이조성 (2)
실험군은 Table 10과 같이 정상대조군(N), 당뇨대조군(STZ), 5% 보리순 분말 첨가 당뇨군(STZ-BL) 및 10% 보리순 분말 첨가 당뇨군(STZ-BH)으로 나누어 실시하였다. 실험에 사용된 식이는 AIN-93을 기준(92)으로 Table
과 같이 조제하였고 보리순 분말 첨가량은 식이 무게의 와 로
11 , 5% 10%
하여 첨가하였다.
사육환경 (3)
본 실험에서는 물과 식이는 제한 없이 공급하였고 사육실 온도는
로 유지하였으며 조명은 시간 주기 로 조절하였다
18±2℃ 12 (08:00~20:00) .
최종 체중에서 실험개시 전의 체중을 감하여 실험개시 전의 체중으로 나누어
체중증가율로 표시하였고, 사육기간의 체중증가량을 동일 기간의
식이섭취량으로 나누어 각 실험군의 식이효율(FER)을 구하였다. 음료 섭취량은 매일 측정하여 급여량과 잔여량의 차이로 계산하였다.
Table 10. Experimental design
Groups Diet composition
N1) Normal diet
STZ2) Normal diet
STZ-BL Normal diet + Streptozotocin + 5% of barley leaf
STZ-BH Normal diet + Streptozotocin + 10% of barley leaf
1) Modifid AIN-93 diet(92).
Table 11. Composition of experimental diet
(g/kg diet)
Ingredients
Groups1)
N STZ STZ-BL STZ-BH
Corn starch 400 400 350 300
Sucrose 200 200 200 200
Casein 200 200 200 200
L-cystine 3 3 3 3
Soy bean oil 100 100 100 100
Cellulose 50 50 50 50
Vitamin mix2) 10 10 10 10
Mineral mix3) 35 35 35 35
Choline chloride 2 2 2 2
Barley Leaf powder 0 0 50 100
1)See the legend of Table 10.
2),3)
AIN-93-MX mineral mixture and AIN-93-VX vitamin mixture(92).
실험동물의 처리 (4)
실험동물은 사양시험 종료 후 16시간 절식시킨 후 CO2로 가볍게 마취한 다음 개복한 후 복부대동맥에서 채혈하여 실온에서 30분간 방치하였다. 에서 분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 혈청 지질측정용 1,150 ×g, 5℃ 15
시료로 사용하였다.
혈청 중 포도당 함량 측정 (5)
혈청 중 포도당 함량 측정을 위해서 혈액자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, 를 사용하여 측정하였다
Fujifilm., Japan) .
경구 당 부하 검사 (6)
실험식이 투여 3주째에 12시간 이상 절식시킨 후 꼬리정맥에서
채혈하여 공복 시 혈당을 측정한 후 glucose (1 g/kg B.W.) 용액을 경구투여기로 투여하고 30, 60, 90, 120 및 150분에 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당 측정기(accu-check, Germany)를 이용하여 혈당을 측정하였다.
혈청 중 인슐린 및 펩티드 농도 측정
(7) , fructosamine C-
혈청 인슐린농도는 rat insulin ELISA kit (Crystal Chem. Inc., TL, USA)를 사용하여 정량하였고, 혈청 fructosamine 함량은 Johnson (100)의 방법에 따라 ktoamine에 의해 notrobluetetrazolium (NBT)이 환원되는 정도를
측정하였으며, 흡광도로 나타내었다 인슐린 관련 기능성 지표인. C-펩티드 농도는 rat C-펩티드 ELISA (U-type) kit (Shinayagi Co., Ltd. Gunma,
를 이용하여 측정하였다
Japan) .
혈청 및 활성 측정
(8) ALT, AST ALP
혈청 중 ALT, AST 및 ALP 함량 측정을 위해서 혈액자동분석기(Fuji 를 사용하여 측정하였다
Dri-Chem 3500, Fujifilm., Japan) .
혈청 지질함량 측정 (9)
혈청 중 중성지방(TG), 총콜레스테롤(TC), HDL-콜레스테롤의 혈액생화학적 검사를 자동분석기(Fuji Dri-Chem 3500, Fujifilm., Japan)를 사용하여 측정하였다. LDL- 레스테롤함량은콜 Friedwald식 {총콜레스테롤 -
콜레스테롤 중성지방
(HDL- - /5)}(93 에) 의하여 계산하였다.
콜레스테롤의 총콜레스테롤에 대한 비율은 콜레스테롤을
HDL- HDL-
총콜레스테롤로 나누어 계산하였다. 심혈관계질환의 위험도 판정에 이용되는 동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 {(총콜레스테롤 -
콜레스테롤 콜레스테롤 에
HDL- )/HDL- }(94) 의하여 구하였으며,
심혈관위험지수(cardiac risk factor, CRF)는 총콜레스테롤을 HDL-콜레스테롤로
