서 론 서의 가능성올 평가하게 되었고， 기기의 평가 를 위 해 정 밀 성

대한임상병리사회지

:

제 26 권 제 1 호

1994.

HPLC를 이 용한 VMA , HVA의 동시 정 량과 신경아세포종 선별검사로서의 전망

의료법인 녹십자 의료재단 특수 생화학실 김남용·박은아·문철진·김원득

Key words : Urinary VMA, HV A, HPLC assay, Neuroblastoma screening test

1 .

서 론 서의 가능성올 평가하게 되었고， 기기의 평가 를 위 해 정 밀 성

(precision) ,

정 확성

(accuracy ),

부신수질의

chromaffin

cell과 교감신경말단， 회수율 (recovery) 등을 시험하였다. 또 본 검 중추신경계에서 분비되는 catecholamine의 최종 사실에 의뢰된

310

검체를 대상으로 연령별로 대사산물인

VMA (vanillylmandelic

_{acid) 와}

HV-

3 개 그룹 (0"-' 127R 월，

13"-'

147~ 월， 25"-'36 개월)

A(homovanillic

acid) 는 갈색세포종(

pheochromo-

을 설정，

95 %

신뢰구간 범위내에서 참고치를

cytoma),

신경아세포종 (neuroblastoma) 을 진단 설정하였고， 아울러 신생아와 유아에 대한 신

하는 물질로서 오래전부터 측정되어 왔다1) 이 경아세포종 선별검사로서의 전망을 피력하고자 외에도 내분비질환이나 당뇨병， 신장질환 동에 한다.

서도 이들의 농도가 요 중에서 증가하는 것으로 보고되고 있다.

검사방법으로 pi잃no법(추출비색법)，

diazotized

p-nitroar피me 법，

EIA,

HPLC법 등이 이용되고 있 다2) 이 중 비색법을 사용하는 수기검사는 추 출과정 이 복잡하고 예 민도가 낮아 위 양성 또는 위음성의 판별률이 높은 단점이 있다. 이에 비 하여 HPLC 법은 예민도가 좋고 정밀한 정량분 석이 가능하여 잘못된 진단의 위험성을 크게 줄일 수 있다. 그러나 현재까지 알려져 있는 HPLC 법은 검체의 전처리나 VMA와 HVA의 동시정량면에 있어 대량의 선별검사로서는 한

계를 보였다3)

본 실험실에서는 본래 HPLC가 갖고 있던 장점을 기초로 하여 검체 전처리과정을 단순화 시키고， 동시정량의 분석시간을 크게 단축시킨 Bio-Rad사의

HPLC

system을 도입， 임상검사 에 적용하여 대량의 신경아세포종 선별검사로

II .

실험방법

1.

기 기 및 시 약 (instrumentaion

and materi- als)

사용한 기기는 Bio-Rad사의 신경아세포종 전용분석기로서

HPLC

펌프와 탄소전기화학분 석 기

(glassy carbon electrochemical detector),

입자크기가 5μm 인

C18

역상컬럼으로 구성되어 있 다 . Injector로 Bio-Rad사의

AS - 100 auto-

sampler를 사용했으며， 데이타 분석은

integra- tor

대신 개 인용 컴퓨터에

Chrom -line soft-

ware를 설치， 결과를 처리하였다. 시약으로는 Bio-Rad사의

neuroblastoma

kit을 이용하였는 데， 추출용

phosphate

buffer와

mobile phase

그리고

VMA, HVA

표준용액으로 구성되어

있다.

VMA, HVA

농도를 보정하기 위한

cre-

atinine의 정 량은

Hitachi 7150

자동생 화학분석 기로 측정하였다.

2.

실 험 조건

(experimental condition)

펌프의 유속은

1.0 ml/min., column

oven 의 온도는

35.C,

주입량은 20μl 이며 전기화학검 출기의 조건은 0.72V 의 전압，

20

nA/V 의 감 도

(sensitivity)

에 서 실 시 하 였 다. Autosampler의 조건으로

sample

loop는

20

μ1

(over fill :

60μ1)，

filling

speed는

500

μl/min 이 며 autosampler 의

들어오는지 여부를 평가하였다.

3)

회 수율 평 가 (evaluation

of recovery)

정상범위안에 있는 검체 2 개를 선정하여

1

검체는 저농도를， 1 검체는 고농도를 첨가시켜 회수율을 평가하였다. 평가방법은

% Recovery=

총측 정 치

(total amount)

첨가된 농도 (spike

conc.)

+검체농도 (sample

conc.)

내부온도를 4

⁰

C 로 유지시켜 주었다.

4)

참고치 평가 (evaluation

of reference range)

3.

검체 전처리 (sample

preparation)

정상아들의 참고치를 설정하기 위해 정규분 포를 확인한 후 A그룹은 출생후 5 일부터 12개 아기 기저귀에서 여과지로 요를 채취한 후 월까지， B그룹은 13개월부터 24 개월까지， C그 bacteria 의 증식을 막기 위하여 즉시 건조시켰 룹은 25 개월부터 36 개월까지 3그룹으로 셜정 다. 같은 종류의 여과지를 적당한 크기(약 하여 총 310 검체를 대상으로 신뢰구간

95

%

10

cm

²

) 로 자른 다음 그 무게를 겠다. 잘라낸 범위 이내로 평가하였다.

부분을 물에 담근 후 그 무게를 챈 다음 앞에 서 측정한 값을 빼어 여과지가 함유하는 용액 의 무게를 계산했다. 계산된 무게의 50배의

elution

buffer로 요지로부터 용액을 추출해 낸 후 20μm filter로 거른 후 HPLC 에 주입했다.

Control도 마찬가지로

extraction buf f

er로

50

배 희석한 다음 HPLC 에 주입했다.

4.

평가방법

1)

정 밀 성 평 가방법

(evaluation of preci- sion)

결과의 안정성을 보기 위하여 동일한 겸체 두 종류를 선정하여 일내 (within

run assay),

일간 (between

run assay)

10 회씩 반복 측정하 여 분석하고， 소변

creatinine

농도를 자동생화 학분석 기

(Hitachi

7150) 을 사용하여 측정 한 후 VMA， HVA농도를 보정하여 평가 하였다.

5)

정상아와 비정상아(신경아세포종)의 농도 평가

신경아세포종으로 진단된 환자와 생후 1 년 미만의 정상아간의 농도를 비교， 평가하였다.

m. 결 과

1)

정밀성 평가

두 종류의 겸체(검체

A ,

검체 B) 를 일내변 동분석

(within run

assay) 과 일간변동분석

(be- tween run

assay) 을 실시하기 위해 소변이 묻 혀진 여과지를

10

cm

²

의 크기로 각각 3 개씩 펀 칭하여 용출액으로 추출한 뒤 일내변동은

10

회 반복측정하였고， 일간변동은 1 일간격으로

3

회 측정하여 정밀도를 구한 바 그 결과는 다 음과 같다 (Table

1, 2).

2)

정확성 평가

2)

정확성 평가 (evaluation

of accuracy)

정도관리물질을 증류수로 용해시킨 뒤， 정상，

표준물질로 겸량선을 작성한 후， 시중에 시 비정상 검체를 각각 50배 희석하여 측정， 허용 판되고 있는

VMA, HVA

정도관리물질을 일 범위 안에 들어오는지를 평가한 결과는

Table

정농도로 희석한 후 측정하여 허용 범위안에 3 과 같다.

중앙값올 기준으로 3 회씩 측정한 결과를 평 균하여 실측치로 표기하고 분산 정도를 분포도 로 표기하였다.

1993 년 9 월부터 4 월까지 본 재단에 의뢰된 신경아세포종 선별검사 검체 중 연령표기가 명 확하게 된 정상아

310

겸체뜰 A ， 8， C 그룹으로 나누어 신뢰구간

95

% 범위에서 참고치뜰 셜 정하였다 (Table

4).

3)

참고치 설정

Table 1.

VMA 와 HVA 농도의 일내 변동계수 단 위

:

μg/mg

creatinine

n

검사명 평균치(잦) 표준편차 (SO) 변이계수 (CV，%)

VMA 6.0 0.72 9.1

검체 A

10

HVA 10.5 0.31 2.0

VMA 20.1 0.84 6.7

검체 B

10

HVA 22.7 0.68 1.8

Table 2.

VMA와 HVA 농도의 일간 변동계수 단 위

:

μg/mg

creatinine

days

검사명 평균치(옷) 표준편차 (SO) 변이계수 (CV，%)

VMA 7.5 0.64 13.7

검체 A

3

HVA 8.2 0.67 7.4

VMA 9.9 0.72 12.2

검체 B

3

HVA 10.4 0.80 6.9

Table 3.

분석에 대한 정확성 평가 단위

: mg/l

검사명 중앙값 허용범위 실측치(평율) 표준편차 _분포도

VMA 3.1 2.5-3.7 2.9 0.68 -lS0

Normal

HVA 1.8 1.4-2.2 1.9 0.40 +lS0

VMA 14.6 11.7-17.5 13.2 0.78 -lS0

Abnormal

HVA 15.5 12.4-18.6 16.2 0.72 +lS0

Table 4.

정상아의 정상범위 단위

:

μ:g/

mg crea tinine

Standard Coefficient

Group ^{도。EE 「a} Mean

deviation variation( %) 95% range

A(n= 100) VMA 10.28 6.09 59.19 up to 22.4

출생 5 일 -12 개월

HVA 16.78 8.42 50.17 up to 33.6

B(n= 100) VMA 9.87 5.72 52.34 up to 21.3

13 개월 -247~ 월

HVA 15.20 7.94 49.72 up to 31.1

C(n= 110) VMA 8.52 5.21 54.36 up to 18.9

25 개월 -367~ 월

HVA 13.10 7.04 47.27 up to 27.2

상기 결과 연 령 이 증가할수록 mean 값의 농 도가 낮아지는 것올 볼 수 있다.

4)

회수율 평가

정상범위에 있는 검체의

VMA

농도는

O.

10 mg/l,

HVA 농도는

0.13

mg/l 이 었다. 여 기 에

VMA,

HVA 를 각각

0.2

mg/l블 첨가시켜 측정 한 결과 VMA 는

93.3 %,

HVA 는

90.9

%의 회 수율을 얻었다 (Table

5).

Table 5.

회수율 시험 단위

: mg/l

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Fig. 1.

정상아의

peak

형태

N.

고 찰

VMA,

HVA 의 측정에 있어서 비색법은 특 이도와 예민도가 낮은 반면 HPLC를 이용한 분석은 예민도가 높아 미량의 물질을 정량분석 할 수 있는 방법이다. 그러나 이러한 우수한 기능을 갖고 있음에도 불구하고 연구소내에서 만 그 사용이 보편화되어 있올 뿐 실질적으로 검사업무에 적용되는 경우는 비교적 적은 것이 국내실정이다.

선진화된 임상기술의 발전을 지향함에 있어

5)

정상아와 비정상아의 결과 평가

신경아세포종으로 진단된 예는 총 2200 건의 검사중 1 건이였으며， peak 의 크기와 최종 계산 된 농도값이 정상과 현저하게 다르다는 것올 얄 수 있다 (Fig

1, 2).

환아의 경우 VMA 의 농 도는

259, HVA

농도는

243

μ:g/mg

creatinine

이였는데 정상아들의 정규분포에 의한 평굵치

(Table

4 의 A 그룹)는 VMA 가

10.3

t땅/mg

cre- atinine, HV

A 가

16.8

μg/mg creatinine 이 였다.

...

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도

VMA 4.00

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HVA 7.55

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Fig.2.

비정상아의

peak

형태

서는

HPLC

system 의 구축이 뒤따라야 할 것 으로 생각되며， 또한 이에 병행하여 대량의 검 사를 실시하기 위해 보다 간단한 전처리와 분 석시간의 단축이 요구된다. 본고에서 소개한 신경아세포종 분석기는 이러한 요구를 충족시 키는 일례로서， 이를 이용한 신경아세포종의 조기진단이 용이하다고 생각되며， VMA와 HVA 의 동시정량분석에 대한 기기평가에서 정 밀성， 정확성， 회수율이 우수하다고 판단되었 다.

신경아세포종은 이미 선진국에서는 10여년 전부

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Simultaneous Analysis of VMA and HV A by HPLC and Prospects for The Mass Screening Test of Neuroblastoma

Kim, N.Y., Park, U.H., Moon, C.J., Kim, W.D.

Dept. of Special Chemistry, Green Cross Reference Laboratory

ABSTRACT

Neuroblastoma analyzer which was intro- duced in Korea at 1993 has been appraised its efficiency and feasibility for mass screen- ing test. In the evaluation of precision, each coefficient variation(CV) of within run assay of VMA and HVA was 9.1% and 2.0 %, and that of within day assay of them was 13.7 % and 7.4 %. In the accuracy test, 3.

1 mg/l of VMA and 1.9 mg/l of HV A stan- dard materials showed 2.9 and 1.9 mg/l mean respectively. Recoveries of VMA and HVA were 93.3 % and 90.9 % respectively. For the purpose of establishing a reference range, we set up three groups; A, B, and C group were

composed of 1--12, 13-- 24, 25--36 - months - old newborns individually. The reference rang- es obtained were as follows.

1. In A group, VMA and HV A were below 22.4 and below 33.6 Jl.g/mg creatinine.

2. In B group, VMA and HV A were below 21.3 and below 31.1 Jl.gjmg creatinine.

3. In C group, VMA and HV A were below 18.9 and below 27.2 Jl.g/mg creatinine.

According to our experiments, it showed good results in all aspects. As the neuroblas- toma can be cured if it is detected at early stage of that disease, the neuroblastoma screening test is worth while to perform in all infants.

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