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NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 21, No. 2, 2003…167 정 봉 현
한국생명공학연구원 융합생명공학연구실, [email protected]
90년대까지만 하더라도 세포기능 연구에 대한 분자 생물학적인 접근은 대부분 단일 유전자나 그 유전자가 발현하는 mRNA의 발현조절을 중심으 로 이루어졌으나, 최근에는 유전체나 단백질체 중 심으로 이른바 총체적생물학(hollistic biology)의 개념으로 바뀌고 있는 추세이다. 특히 인간게놈지 도의 완성을 계기로 프로테오믹스 연구에 한층 가 속도가 붙게 됐으며 그 경쟁 또한 치열해지고 있 다. 미국의 경우 국립보건원(NIH)의 연구 예산이 3.4억달러(4천억원)에 달하며, 독일은 3년간 8.7억 마르크(5천억원)를 연구비로 지원하고 있다. 또한 일본에서는 인간게놈 연구에서는 미국에 뒤졌지 만 게놈정보를 실용화하는 포스트게놈 연구에서 는 미국을 앞서기 위해 생명과학분야에 문부과학 성에서만도 8백억엔(8천4백억원)의 연구비를 대 폭 지원하고 있다. 프로테오믹스는 일단
유전자 산물인 단백질을 대상으로 조직 이나 세포, 체액과 같은 개체의 실시간 세포 생리현장에서 얻어진 시료를 대상 으로, 이들을 대량으로 분석하고, 상호기 능관계의 지도를 작성하며, 구조분석을 통하여 궁극적으로 특정 단백질과 이를 만드는 유전자 기능을 동시에 밝히는 기 술이며 단백질 초고속 생산기술은 주요 요소기술 중의 하나이다[그림 1].
현재 포스트 게놈 연구로 많은 생명과 학 분야의 연구자들이 단백질 연구에 집 중하고 있는 이유는 생명체 내의 모든 정 보는 유전자 내에 들어있지만 실제로 세
포 내에서 기능을 하는 주인공은 유전자로부터 합 성되는 단백질이기 때문이다. 또한 단백질이 세포 내에 과다하거나 과소하게 발현하는 경우와 기능 에 이상이 생길 때는 질환을 초래할 수 있기 때문 에 많은 제약회사들도 단백질 연구에 박차를 가하 고 있다. 또한 2003년 1월 4일자 nature지에 실린 기사를 보면 미국 메릴랜드주 Rockville에 있는
‘Large Scale Proteomics’사에서 심장마비로 사 망한 여자로부터 157개의 조직을 공장규모의 분석 작업을 수행하고 각 조직의 단백질 profile을 제작하 여 11만 5천 개의 단백질로 된 human proteome index를 완성한 후 상용화한다고 공표하였다. 이 는 결국 유전체 연구와 달리 직접적인 의약산업의 소재가 되는 프로테오믹스 연구 결과는 상업적으 로 천문학적인 가치가 있음을 알 수 있다.
그림 1. Schematic outline of proteome project.
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과거 프로테오믹스의 기초 학문으로서 단백질 생화학은 매우 느리고 어려운 일로 인식되어 왔다.
그러나 유전자 재조합 기술을 바탕으로 한 근대의 생명공학은 인간에게 유용한 여러 이종 단백질을 미생물로 하여금 대량생산하도록 하여 산업, 식품, 의약분야의 유용단백질을 값싸고 풍부하게 공급 할 수 있는 기초를 마련하였다. 특히 대장균의 경 우 유전학적, 생리학적 기반 연구가 잘되어 있을 뿐만 아니라 유전자 조작기술, 배양기술 등이 매 우 발달되어 있으며, 많은 클로닝 벡터와 돌연변 이 균주를 이용할 수 있다는 점에서 이종 단백질 생산을 위한 재조합 숙주균으로 가장 많이 이용되 고 있다. 현재 진보된 재조합 단백질 생산 기술에 도 불구하고 단백질 연구가 유전자 연구보다 매우 느린 이유는 활성형 단백질의 발현 및 분리정제가 초고속으로 수행될 수 없기 때문이다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 특정 ligand에 affinity를 갖는 carrier를 보유한 fusion partner를 이용하여 재조합 단백질을 발현하면 재조합 단백 질의 용해도를 크게 증가시킬 수 있을 뿐만 아니 라 affinity purification을 이용하여 쉽게 정제할 수 있으므로 초고속 단백질 생산이 가능할 수 있 다. 이러한 단백질 정제 방법은 면역친화성을 이 용한 방법과 마찬가지로 융합단백질과 리간드 사 이에 높은 결합 특이성을 가지므로 한단계 정제만 으로 95% 이상의 고순도 정제가 가능하여 다양한 재조합 단백질 생산 및 정제에 활용할 수 있다. 현 재까지 개발된 친화성 tag로는 기질과의 선택적 친화성을 이용한β-galactosidase, glutathione S- transferase(GST) 등의 효소 tags, IgG와의 친화 성을 이용한 protein A 등의 단백질 tags, 금속친 화성을 이용한 polyhistidine tag, 소수성 결합을 이용한 polyphenylalanine tag, 이온교환수지를 이용할 수 있는 polyalanine tag 등이 있다.
β-galactosidase와의 융합 단백질은 단백질 분
해에 저항성이 있으며, β-galactosidase 활성을 이 용한 colormetric 분석이 가능하고 p-amino- phenyl-β-D-thiogalactosidase(TPEG) 친 화 성 크로마토 그래피를 이용하여 쉽게 정제할 수 있다 는 장점을 갖고 있으나, 융합 단백질이 대장균에 서 inclusion body로 발현될 때는 TPEG 친화성 크로마토그래피의 사용이 제한을 받게되는 문제 점도 있다. 이외에 효소 tag으로 가장 많이 사용되 고 있는 GST tag은 상업화되어 이미 단백질 정 제뿐만 아니라 단백질-단백질간의 상호 작용을 연구하기 위한 방법으로도 활용되고 있다.
재조합 단백질의 분리정제를 위해 널리 사용되 고 있는 protein A tag는 staphylococcal protein A와 immunoglobulin의 constant region간의 선 택적 친화성을 이용한 것으로서 protein A와의 융 합단백질은 IgG-sepharose를 이용하여 분리할 수 있다. Maltose binding protein(MBP)도 많이 사 용되는 단백질 tag으로써 대장균에서 융합 단백질 의 안정적 발현뿐만 아니라 one-step 분리정제도 가능하다.
금속 친화성 크로마토그래피를 이용한 단백질 분리정제는 단백질 표면에 존재하는 histidine, cysteine과 같은 아미노산들과 Cu(II), Ni(II), Co(II)와 같은 금속이온들과의 선택적 친화성을 이용한 것이다. 6 X histidine tag와의 융합 단백 질은 금속 이온과 결합한 후 pH를 낮추거나 imidazole을 사용하여 용출할 수 있다. 금속 친화성 tag은 크기가 작아 융합 후 단백질 활성에 큰 영향 을 미치지 않는 것으로 알려져 있으며 금속 친화성 담체들은 면역 친화성 담체들에 비해 가격이 저렴 하므로 경제성 측면에서도 금속 친화성을 이용한 정제 방법이 유리하다고 할 수 있다[그림 2].
친화성 tag을 이용한 단백질 분리정제에서 가 장 중요하게 고려해야하는 사항 중의 하나가 단백 질에 융합되어 있는 친화성 tag의 제거이다. 대부
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NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 21, No. 2, 2003…169 분의 경우 친화성 tag이 단백질 활성에 큰 영향을
주지 않는 경우에도 안정성 측면에서 친화성 tag 의 제거가 필요하다고 할 수 있다. 따라서, 유용 단백질과 친 화성 tag의 융합시 단백질과 tag 사 이에 효소나 화학물질에 의한 절단부위를 갖는 target linker를 삽입하여 분리 정제 후 단백질과 tag을 절단할 수 있는 유전자 융합 방법이 보편적 으로 사용되고 있다. 화학적인 tag 제거 방법은 사 용되는 화학물질들의 가격이 효소에 비해 비교적 저렴하므로 대규모 조업시 효소적 tag 제거 방법 에 비해 경제성 측면에서 유리하나 절단부위에 대 한 특이성이 낮고 단백질이 화학약품에 의해 변성 될 수 있다는 단점이 있다. 효소적 tag 제거 방법 은 화학적인 방법에 비하여 반응 특이성이 매우 높으며 반응조건이 mild하여 단백질의 변성이 일 어나지 않고 부반응이 없다는 장점을 갖고 있다.
그러나 융합 단백질 절단에 사용하는 효소의 가격
이 높아 대규모 공정에서는 경제성이 문제가 될 수 있다. 또한 효소를 이용하는 방법이 화학적 방 법에 비해 상대적으로 반응 특이성이 높다 할지라 도 절단하고자 하는 부위 이외의 곳에서 절단이 발생할 수 있다. 근래에는 이러한 절단효소 사용 으로 인한 문제점을 해결하기 위하여 self- cleavage mechanism을 가진 단백질인 인테인 (intein)이 tag으로 개발되었다. 단백질 자가접합 (protein self-splicing)이라고 불리는 흔하지 않은 가공과정은 박테리아와 원시적인 진핵세포에서 나타나며 접합(splicing)이라고 하는 것은 필름을 편집하는 것과 비슷한 방법으로, 폴리펩타이드의 인테인이라고 불리는 내부 부분을 제거하고 끊어 진 폴리펩타이드의 각 끝부분을 서로 연결시킨다 [그림 3].
단백질 분해과정(proteolytic processing)과는 달리 단백질 자가접합은 효소의 도움 없이 스스로 일어나는 과정이다. 이러한 개념에서 도입된 인테 인 tag과 융합되어 만들어진 단백질은 티오에스테 를 결합을 통해 인테인 단백질과 연결되어 있기 때문에 DTT(dithiothreitol)과 같이 티올기를 가 진 화합물과 반응시키면 DTT가 인테인을 치환하 여 원하는 단백질이 인테인으로부터 떨어져 나오 게 된다[그림 4]. 또한 DTT를 이용하여 단백질 그림 2. Protein purification by metal ion affinity
chromatography.
그림 3. Protein self-splicing mechanism.
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을 생산하는 방법은 특이적이고 정량적이기 때문 에 앞서 언급된 tag의 화학적 또는 효소적 제거시 발생하는 문제점을 해결할 수 있다.
현재 사용되고 있는 친화성 tag나 인테인을 이 용한 재조합 단백질 정제 방법은 항원-항체 결합 을 이용한 면역친화성 단백질 정제 방법과 마찬가 지로 높은 선택적 친화성을 갖고 있으며, 발현 vector 시스템의 개발을 통해 다양한 재조합 단백 질 정제에 응용할 수 있다는 장점을 지니고 있다.
그러나 친화성 tag나 인테인과 융합으로 인한 단 백질의 활성 및 발현율의 저하, 단백질의 변성, refolding의 문제, 값비싼 DTT의 이용 등 해결해 야할 많은 문제점이 있으나 현재 이러한 문제점들 을 해결하기 위한 많은 연구가 수행되고 있어 앞 으로 친화성 tag나 인테인 tag을 이용한 재조합 단백질 분리정제 기술은 산업적 이용뿐만 아니라 재조합 단백질 정제를 위한 가장 보편적인 방법으 로 사용될 것으로 전망된다.
서론 및 배경
1995년 처음 소개된 ‘proteome(단백질체)’이라 는 용어는 어떤 genome(유전체)으로부터 발현되 는 단백질 대응을 의미한다. 활성 단백질 합성이 유도되는 일련의 조절단계에서 proteome은 genome의 마지막 단계의 생성물로 나타날 수 있 다. Genome은 상대적으로 정체적인 것에 반해 proteome은 대단히 역동적인 실체이다. 어떤 세포 의 단백질 조성은 주위환경, 세포의 생리적 상태
(예를 들어, 세포 대사주기 상 위치), 스트레스, 치 료약 투여, 건강상태, 그리고 질병에 따라 변화한 다. 더구나, 다세포 생명체 내의 다른 형태 및 기 능을 갖는 세포들 간의 genome은 비교적 일정하 게 유지되는 반면에 proteome의 구성은 매우 다 를 뿐만 아니라 어떤 순간에 존재하는 한 세포의 proteome은 genome 일부로부터 발현된 것 임에 도 불구하고 매우 복잡한 성분들로 구성된다. 이 것은 아마도 복제능력을 갖는 가장 간단한 독립적 그림 4. Schematic illustration of the intein-mediated
affinity protein purification.
Proteomics /
백세환·변상요*·한종훈**
고려대학교 생명정보공학과, [email protected]
*아주대학교 화학생물공학부, [email protected]
**포항공과대학교 화학공학과, [email protected]
