▒ 접수 ▸ 2011년 3월 17일 수정 ▸ 2011년 7월 29일 채택 ▸ 2011년 8월 5일
▒ 교신저자 김병주, 경남 양산시 물금읍 범어리 부산대학교 한의학전문대학원 Tel 051-510-8469 Fax 051-510-8420 E-mail [email protected]
홍화가 인체 대장암세포에 미치는 효과
한송이, 김정아, 송호준, 채한, 권영규, 김병주 부산대학교 한의학전문대학원 양생기능의학부
Effects of Carthami Flos on Human Colorectal Adenocarcinoma Cells
Song Ee Han, Jung A Kim, Ho Joon Song, Han Chae, Young Kyu Kwon, Byung Joo Kim Division of Longevity and Biofunctional Medicine School of Korean Medicine, Pusan National University
Objective : The purpose of this study was to investigate the anti-cancer effects of Carthami Flos in some kinds of human colorectal adenocarcinoma cells.
Method : We used two kinds of human colorectal adenocarcinoma cell lines, such as HT-29 and WiDr cells. We examined cell death by MTT assay and observed the morphological changes with Carthami Flos.
Result : We showed that the combination of sub-optimal doses of Carthami Flos and cisplatin noticeably suppresses in HT-29 cells and doxorubicin in WiDr cells. Furthermore, we studied the caspase 3 activity to identify the apoptosis.
Conclusion : Our findings provide insight into unraveling the effects of Carthami Flos in human colorectal adenocarcinoma cells and developing therapeutic agents against colorectal cancer.
Keywords : Carthami Flos, Human Colorectal Adenocarcinoma Cell, HT-29, WiDr
Ⅰ.서론
대장암이 급증하고 있다. 최근 식생활 및 생활습성 의 변화로 그 발생 빈도는 점차 증가하는 추세로 2008년 1년간 대장암으로 진료 받은 환자는 7만 5822명으로 2001년 (2만8000명) 보다 세 배 가까이 늘었다.1) 그럼에도 불구하고 대한대장항문학회가 조 사한 바에 의하면 2005년부터 지난해까지 국내 5대 대학병원에서 대장내시경 검사를 받은 51만9866명 을 조사한 결과, 대장암이 발견된 환자의 절반 이상 (51.6%)은 이미 병기가 3~4기까지 진행된 상태였다 고 한다.2) 평소 대장암 조기 발견을 위해 스스로 할
수 있는 방법은 배변 직후 변 상태를 살펴보는 것이 다. 붉은 혈변, 검은색 변, 점액이 많이 섞인 변을 보는 경우, 변이 연필처럼 가는 경우, 없던 변비나 설사가 계속되는 경우에는 검사를 받아볼 필요가 있다. 대장 암의 가장 대표적 증상은 혈변인데, 이는 치질과 혼동 되는 경우가 많으므로 유의해야 한다. 일반적으로 선 홍색의 맑은 피가 섞여 나오면 치질, 검붉고 탁한 피 가 나오면 대장암일 가능성이 높다. 대장암에 대한 치 료법으로는 외과적 수술요법, 약물요법, 수술요법 등 이 시행되고 있고 최근에는 유전자 치료법이 개발 중 에 있다. 현재의 화학요법은 항암제가 암세포 외에도 정상 세포에도 손상을 초래하는 부작용 때문에 면역 기능저하, 골수 기능 장애, 유전인자 손상 등을 야기 한다.3) 따라서 부작용을 감소시키면서 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내는 항암제를 합성물질이 아닌 천연물질에서 개발하려는 노력이 시도되고 있다.4)
홍화 (紅花, safflower, Carthamus tinctorius L.)는 국화과에 속하는 여러해살이풀로 7-8월에 적황색의 꽃이 피며 9-10월에 열매를 맺는다.5) 꽃은 천연색소 로서 오래 전부터 사용되어 왔으며, safflower yellow, carthamin등의 색소물질과 여러 가지 지방산의 glyceride가 주성분으로 함유되어 있다.6) 홍화씨에는 다가불포화지방산 (linoleic acid)이 75%나 함유되어 있어 혈중지질과 콜레스테롤 농도를 저하시켜 동맥경 화, 고지혈증, 고혈압 등의 순환기질환의 치료에 탁원 한 효과를 보이며, 골다공증, 관절염, 진경약, 콜레스 테롤 저하제의 원료로 사용되기도 하였다.7) 또 항산 화작용8,9), 항염증작용10), 그리고 항암제로의 작용4)도 보고되고 있다. 하지만 항암제로써의 홍화의 효과와 항암제의 효과를 증가시키는 보조제로서의 역할에 관 한 체계적인 연구는 이루어지지 않았다. 이에 본 연구 에서는 홍화에 의한 항암효과와 기존에 알려진 여러 개의 항암제에 대한 병용투여로 항암의 효과를 증진 시키는 유의한 효과를 얻었기에 이를 보고 하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 재료
1) 약재
실험에 사용한 홍화는 한국생명공학연구원 한국식 물추출물은행 (Plant Extract Bank)에서 구입한 후 사용하였다.
2) 대상 세포주
이 실험에 사용한 인체 대장암세포는 서울대학교 암세포주 은행에서 구입한 대장암 세포주 HT-29와 WiDr이며, adenocarcinoma의 Histopathology 특징 을 나타내고 있다.
2. 방법
1) 암세포의 배양
암세포주는 10% fetal bovine serum (Gibco BRL, MD), 1% broad-spectrum antibiotics (Gibco BRL, MD)가 함유된 RPMI-1640 (Gibco BRL, MD) 배지 를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator (Precision Scientific Inc. NY)에서 배양하였고, 세포는 0.1%
Trypsin-EDTA (Sigma, MD)를 이용하여 37℃에서 5분간 처리한 후 회수하였다.
2) 암세포의 형태학적 특징
암세포주의 배지에 홍화추출물 500 ㎍/ml을 투여 하고 72시간 경과 후, inverted microscope (CK2, Olympus optical Co. LTD., Japan)하에서 형태학적 변화를 관찰하였다.
3) MTT assay
세포 생존율 측정은 세포 배양판 (24-well)에 암세 포를 1 ml씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 홍화추출 물을 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 하에 서 72시간 배양한 후, MTT용액 (5 mg/ml)을 배양액 최종 부피의 1/10되게 첨가 하였다. 3시간 후 배양액 을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 ml로 녹여서 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
4) Caspase 3 assay 측정
Caspase 3 assay kits를 BioMol (Plymouth, PA, USA)에서 구입하여 측정하였다. 405 nm의 흡광도에 서 여러 번 측정하였다.
5) 통계 분석
대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 SPSS 16.0 (SPSS Inc, Chicago)의 Independent t-test를 사용하였으며 유의수준 p<0.05를 사용하였 다. 실험결과는 mean ± SD 또는 빈도 (%)로 기재하 였다.
<Fig. 1> Effect of Carthami extract on cytotoxicity in HT-29 and WiDr cells.
HT-29 (A) and WiDr (B) cells were incubated with carthami extract as indicated dose (㎍/ml). After 72 h, cell viability was measured by MTT assay as described in materials and methods. The values are expressed as percent (%) of control and each column represents the mean ± S.D. *P<0.05.
**P<0.01.
<Fig. 2> Microscopic appearances of HT-29 and WiDr cells by Carthami Flos.
A. a) HT-29 cells. b) Experimental group treated by Carthami Flos 500
㎍/ml for 72 hours.
B. a) WiDr cells. b) Experimental group treated by Carthami Flos 500 ㎍/ml for 72 hours.
Ⅲ. 결과
1. 암세포 살상 효과
암세포 살상 효과를 측정하기 위하여 100, 200, 300, 400, 500 ㎍/ml의 농도로 각각 4회씩 시험한 결 과 홍화에 의한 HT-29 (A)에서 300 ㎍/ml 이상에서 암세포 살상 효과를 볼 수 있었으며, WiDr (B)에서는 200 ㎍/ml 이상에서 뚜렷한 암세포 살상 효과를 볼 수 있었다<Fig. 1>. A에 있어서는 100 ㎍/ml에서 95.1 ± 9.1, 200 ㎍/ml에서 83.2 ± 10.1, 300 ㎍/ml 에서 60.1 ± 9.3, 400 ㎍/ml에서 40.3 ± 5.2, 500
㎍/ml에서 20.5 ± 6.3의 결과를 보였다. B에 있어서 는 100 ㎍/ml에서 91.2 ± 8.2, 200 ㎍/ml에서 40.3
± 5.2, 300 ㎍/ml에서 20.3 ± 5.4, 400 ㎍/ml에서 10.2 ± 4.6, 500 ㎍/ml에서 6.8 ± 3.4의 결과를 보였 다. 이러한 결과는 A, B 모두 통계적으로 유의하게 암 세포 살상 효과가 있다는 것을 확인한 결과로 HT-29 는 300 ㎍/ml이상 농도에서, WiDr은 200 ㎍/ml 이상 농도에서 항암작용이 있음을 의미한다. 이러한 결과 로 이후의 항암제와의 병용투여 실험은 HT-29 (A)인 경우는 200 ㎍/ml으로, WiDr (B)인 경우는 100 ㎍ /ml으로 진행하였다.
2. 암세포의 형태학적 소견
홍화가 인체의 대장암 세포주에 미치는 영향을 알아 보기 위해 홍화 투여 72시간 후 inverted microscope 하에서 관찰하였다. 그 결과, 대조군 (A(a) 와 B(a))의
경우 세포 배양 plate에 암세포 특유의 모양대로 부착 되어 있으나, HT-29 (A(b))와 WiDr (B(b))의 암세포 는 손상을 입어 원형 모양으로 축소되며 plate에서 떨 어져 나와 부유되면서 사멸되는 전형적인 세포손상의 소견이 관찰되었으며, 각 암세포주의 약물처리 72시 간 후 형태학적 변화는 <Fig. 2>와 같다. 이러한 변화 로 볼 때 홍화는 인체 대장암 세포주에 대한 항암효과 가 있음을 알 수 있었다<Fig. 2>.
3. 홍화와 항암제의 병용처치 시 대장암 세포주에 미치는 효과
홍화와 항암제의 병용처치 시 대장암 세포주에 미 치는 효과를 알아보기 위해 홍화와 항암제를 함께 투 여하였다. 홍화는 세포의 살상효과가 적은 농도로 맞 추어 HT-29에서는 200 ㎍/ml, WiDr에서는 100 ㎍ /ml을 투여하였고, 항암제로는 cisplatin, ectoposide, doxorubicin, 5-fluorouracil, docetaxel, paclitaxel 을 사용하였다. 먼저 각 세포에서 항암제 단독의 효과 를 관찰하였고, 그 다음으로 홍화와 병용투여 시 효과 를 MTT assay로 관찰하였다. HT-29<Fig. 3>와 WiDr<Fig. 4> 모두에서 홍화와 병용투여 시 항암작 용의 효과가 증가하고 있음을 알 수 있고, 특히 HT-29에서는 cisplatin, WiDr에서는 Doxorubicin 에서 특히 항암작용이 크게 증가함을 알 수 있다.
<Fig. 3> Carthami Flos increases the chemosensitivity of HT-29 cells.
The cells were co-treated with Carthami Flos at 200 ㎍/ml and chemotherapeutic agents, including cisplatin (A), ectoposide (B), doxorubicin (C), 5-fluorouracil (D), docetaxel (E) and paclitaxel (F), at the indicated concentrations prior to MTT assay. This figure show mean ± SEM (n=4). *P<0.05. **P<0.01.
<Fig. 4> Carthami Flos increases the chemosensitivity of WiDr cells.
The cells were co-treated with Carthami Flos at 100 ㎍/ml and chemotherapeutic agents, including cisplatin (A), ectoposide (B), doxorubicin (C), 5-fluorouracil (D), docetaxel (E) and paclitaxel (F), at the indicated concentrations prior to MTT assay. This figure show mean ± SEM (n=4). *P<0.05. **P<0.01.
<Fig. 5> Carthami Flos induces apoptosis in HT-29 cells.
Caspase 3 activities measured by enzyme assays. The specific activity was obtained from three samples per group. CTRL: HT-29 cell; cis: cisplatin;
ect: ectoposide; dox: doxorubicin; 5-fu: 5-fluorouracil; doc: docetaxel; pac:
paclitaxel. *P<0.05. **P<0.01.
<Fig. 6> Carthami Flos induces apoptosis in WiDr cells.
Caspase 3 activities measured by enzyme assays. The specific activity was obtained from three samples per group. CTRL: WiDr cell; cis: cisplatin; ect:
ectoposide; dox: doxorubicin; 5-fu: 5-fluorouracil; doc: docetaxel; pac:
paclitaxel. *P<0.05. **P<0.01.
4. Caspase 3를 통한 암세포 사멸 확인
홍화와 항암제의 병용투여에 의한 세포사가 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위하여 농도별로 세포사멸의 진행 정도를 알아보았다. Caspase는 cystinyl aspartate-specific protease로 세포질에서 pro-form으로 존재하고 특정 위치의 proteolytic 과 정에 의해 활성화된다. 이로 인해 세포의 DNA 복제 및 유전자 발현과 관련된 단백질 및 핵의 구조 유지, 세포의 항상성 유지 등과 관련된 단백질들을 파괴시 키거나 관련된 단백질을 활성화시켜 apoptosis를 유 도하게 된다. Caspase 3 activity를 측정한 결과 홍화 와 항암제의 단독 투여보다도 병용투여 시 caspase 3 activity가 증가함을 알 수 있고, 따라서 병용투여 시 항암의 효과가 크게 상승함을 알 수 있다<Fig. 5, 6>.
Ⅳ. 고찰
대장암은 사회적, 경제적 수준이 높은 사람들, 도시 사람들에게 더 흔한 질병이다. 대장암의 원인으로는 정제된 탄수화물 음식, 육류, 지방이 많은 음식을 많 이 섭취한 식습관이 의심이 되지만, 외부적인 요인은 명확하지 않다.11) 만성 궤양성 대장염, 가족성 대장 폴립, 장결핵 등은 대장암의 위험도를 높이는 것으로 알려져 있다. 석면은 이런 종양을 촉진하는 원인이 된 다. 또 화학물질, 유전적인 성질 등과의 인과관계도 있다. 가장 흔한 증상은 불규칙한 배변, 즉 변비 혹은 설사가 번갈아 나타나는 것이다. 대장 속에 수많은 혹 이 발생하는 가족성 용종증은 유전이 되는 것으로 알 려져 있다. 그대로 내버려두면 대장암으로 변할 확률 이 거의 100%이다. 종양이 생기면 그 부분이 딱딱해
지고 좁아지기 때문에 변통이 순조롭지 않아서 어떤 증세보다도 먼저 변비와 설사가 교대로 나타나는 변 통이상이 생긴다.12) 이러한 대장암 치료에는 수술 요 법, 화학 요법, 방사선 요법 등이 있는데 수술요법이 가장 효과적인 대장암 치료법이며 수술요법이 불가능 한 경우에 방사선요법과 약물요법이 중심이 된다.13) 수술요법은 종양의 크기와 부위, 그리고 다른 장기에 전이되었는지 여부에 따라 수술의 형태와 범위를 결 정하게 된다. 우리나라의 경우 대장암의 수술 후 5년 생존율을 보면, 1기 (암이 대장의 점막하층까지 침윤 된 경우)는 80~100%이고, 2기 (암세포가 장막까지 침범한 경우)는 40~65%이며, 3기 (암세포가 주위 림 프절까지 침범한 경우)는 24~30%이다. 그리고 4기 (다른 장기에 전이가 있을 때)는 5년 생존율이 5%이 하이다. 화학 요법은 2기 이상일 때 수술요법의 보조 적 치료법으로, 한 가지 약물 혹은 여러 가지 약물을 복합적으로 사용된다. 방사선 요법은 수술 요법의 보 조적 치료법으로 쓰인다. 국소적 재발을 감소시키는 효과가 있다. 수술 전에 방사선 요법을 시행하는 목적 을 수술을 하는 동안 원거리 혹은 국소적으로 퍼질 수 있는 암 세포의 수를 감소시키는 것이다.13) 그러나 현 재까지 개발된 항암제의 가장 큰 단점은 항암제의 비 특이적 작용이라 할 수 있는데 정상세포까지 영향을 미치기 때문에 원하지 않는 부작용을 나타내는 경우 가 많다. 항암제가 암세포 외에 정상적인 세포에도 역 시 DNA의 손상을 초래하고 세포가 필요한 영양물질 의 흡수를 차단하여 정상세포의 세포분열 및 성장을 방해하는 부작용을 초래하는 경우가 대부분이며14,15), 이러한 부작용은 소화기계통을 비롯하여 간장장애, 혈액학적 이상, 면역기능 저하, 유전인자 손상 등 다 양하게 나타난다.16)
홍화 (safflower, Carthamus tinctorius L.)는 국화 과 잇꽃속의 일년생 초목으로 아프가니스탄의 산악지 대 또는 에티오피아, 중국, 티베트 등지에서 생산된 다. 특히 한국, 일본, 중국 등지에서 약용목적으로 주 로 재배되고 있으며, 근래에 와서는 미국, 인도 등지 에서 식용유 생산용으로 재배되고 있다. 홍화 꽃의 약 용성분인 carthamin은 약성이 따뜻하고 피를 다스린 다하여 어혈, 통경약의 약재로 한방에서 널리 사용되 어 왔다.17-19) 또한 꽃잎에서 추출한 색소는 식품 및 화장품의 착색료로 사용되고 있으며 종실에는 지방이 다량 (15-37%) 함유되어 있다. 특히 필수지방산인
리놀렌산은 혈중 콜레스테롤 수치를 저하시켜 동맥경 화증의 예방과 치료에 효과가 있으며, 고혈압, 협심 증, 고지혈증20-22) 에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.23)
홍화에 의한 항암효과는 그동안 많이 연구되지 않 은 분야이고, 몇 실험실에서 연구를 진행하였지만24) 다양한 항암제와의 병용투여에 관한 체계적인 연구는 이루어지지 않았다. 본 실험 결과, 일정 농도 이상의 홍화 투여 시 뚜렷한 암세포 살상 효과를 확인할 수 있었고, 인체의 대장암 세포주에서 전형적인 세포손 상의 소견이 보였다. 또한 항암제와 병용투여 시 단독 투여보다 항암작용의 효과가 크게 증가했으며 특히 Caspase 3 activity가 증가하는 것을 확인했는데, 이 는 병용투여 시 apoptosis로 인한 세포사멸과정이 증 가함으로써 항암작용의 효과가 증가함을 알 수 있었 다. 이번 연구로 항암제와의 병용투여 시 홍화에 의한 항암작용 상승효과가 있음을 알 수 있었기에, 대장암 으로 고생하는 많은 환자들에게 도움이 되고 또한 홍 화에 의한 새로운 건강보조식품이 개발되어 삶의 질 향상에 도움이 되길 바란다.
감사의 글
본 논문은 (재)산청한방약초연구소 공동개발사업 의 지원에 의해 수행되었습니다.
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