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(1)

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(2)

2018년 2월 석사학위 논문

애기장대 근관의 경계세포에서 발현되는 세 가지 zinc-finger

단백질 유전자들의 특성 규명

조선대학교 대학원

생명과학과

이 방 헌

(3)

애기장대 근관의 경계세포에서 발현되는 세 가지 zinc-finger

단백질 유전자들의 특성 규명

Characterization of three related zinc-finger protein genes expressed in root cap border cells of Arabidopsis

2018년 2월 23일

조선대학교 대학원

생명과학과

이 방 헌

(4)

애기장대 근관의 경계세포에서 발현되는 세 가지 zinc-finger

단백질 유전자들의 특성 규명

지도교수 송 상 기

이 논문을 이학석사학위 신청 논문으로 제출함 2017년 10월

조선대학교 대학원

생명과학과

이 방 헌

(5)

이방헌의 석사학위논문을 인준함

위원장 조선대학교 교 수 박 현 용 (인) 위 원 조선대학교 교 수 조 태 오 (인) 위 원 조선대학교 교 수 송 상 기 (인)

2017년 11월

조선대학교 대학원

(6)

목 차

LIST OF TABLES ………i LIST OF FIGURES ………ii ABBREVIATIONS ………ⅳ ABSTRACT ………ⅵ 국문초록 ………ⅷ

I. 서론 ……… 1 1. 모델 식물로서의 애기장대의 장점………1 2. 활성표지 도입에 의한 과대발현 돌연변이 선별……2 3. 애기장대에서 뿌리의 발생 과정………3 4. 근관의 발생과정………5 5. 근관의 기능과 생장………6 6. 근관의 최외각 세포의 형성을 조절하는 유전자들의 기능………8 7. 애기장대 뿌리 표피세포의 운명 결정에 관련된 유전자

들 의 특 징 … … … 9

(7)

8. C

2

H

2

zinc-finger protein의 기능………11

II. 재료 및 방법 ………14

1. 재료식물………14

2. 사용한 배지 및 조성………14

2-1. Luria broth의 준비 ………14

2-2. Murashige and Skoog 배지의 준비 ………15

3. 애기장대 게놈 DNA의 추출………15

4. Primer의 제작………16

5. TAIL-PCR 방법 ………17

6. Translational fusion construct 제작………18

6-1. Pfu를 활용한 PCR 방법……… 18

6-2. 클로닝 벡터로의 클로닝 방법……… 18

6-3. Binary 벡터로의 클로닝 방법……… 19

7. Agrobacterium 의 형질전환………24

8. 형질전환의 확인………24

9. Agrobacterium 을 이용한 애기장대 형질전환……24

10. GUS 염색………25

11. Phloroglucinol 염색………25

(8)

12. T-DNA가 삽입된 돌연변이체 선별………25 13. Reverse transcription PCR (RT-PCR) …………26

III. 결과 ………27 1 . 활성표지도입으로 유도된 돌연변이체들의 표현형

관찰………27 2. TAIL-PCR을 이용하여 삽입된 위치 확인 …………29 3. 5x UAS promoter를 이용한 과대발현 표현형 관찰…32 4. Reporter유전자를 이용한 ZAT1 유전자 발현양상…35

5. ZAT1 과대발현 배경하에 다양한 유전자들의 발현양상 조사………39

6. Genotyping을 통한 zat1 돌연변이체 확보 ………43 7 . Z A T 1 및 유 사 단 백 질 의 m u l t i p l e s e q u e n c e alignment………45 8 . Z AT 9 와 Z AT4 유 사 유 전 자 의 과 대 발 현 표 현 형 관찰………48 9. Reporter유전자를 활용한 ZAT9 와 ZAT4 의 발현양상

조사………50

(9)

10. Genoyping을 통한 zat9, zat4 돌연변이체와 다중

돌연변이체의 확보………53

IV. 논의 ………56

V. 참고문헌 ………59

감사의 글 ………65

(10)

i

LIST OF TABLES

Table. 1. List of primers for PCR 20

(11)

ii

LIST OF FIGURES

Figure 1. Model of major stages of Arabidopsis embryogenesis. 4

Figure 2. Schematic diagram of location of root cap. 7

Figure 3. Models of genes that determine the fate of root hair. 10

Figure 4. Model of EAR motif-mediated repression from stress cue in Arabidopsis. 13

Figure 5. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT1 gene under the

control of 5x UAS promoter and ZAT1 promoter. 21

Figure 8. Root phenotype of drd2-D mutants. 28

Figure 9. Gel electrophoresis results of three consecutive TAIL-PCR by using drd2-D

genomic DNA as template. 30

Figure 10. T-DNA insertion site inducing drd2-D phenotype is localized in the promoter

region of At1g02030. 31

Figure 11. The ectopic expression of the ZAT1 gene under various enhancers suppresses the

growth of transgenic seedlings. 33

Figure 12. Misexpression of ZAT1 suppresses the growth of above-ground organs. 34

(12)

iii

Figure 13. Tissue-specific expression pattern of ZAT1 in WT and ZAT1/SMB overexpression background visualized by ZAT1p:GUS and expression patterns of ZAT1

transcripts in various tissues. 37

Figure 14. Expression pattern of ZAT1 visualized by ZAT1pro:GFP5-ER and

ZAT1pro:ZAT1-GFP in WT and smb-3 background. 38

Figure 15. Expression pattern of various reporter genes in the background of WT and ZAT1

overexpression lines. 41

Figure 16. Expression patterns of CEL5p:GUS and SMBp:GUS in root cap. 42

Figure 17. Identification of T-DNA insertion lines for ZAT1. 44

Figure 18. Multiple amino acid sequence alignment among ZAT1 and related protein. 46

Figure 19. Phylogenetic relationship visualized by PAUP4.0 program among the amino acid sequences obtained from ZAT1 and related zinc-finger protein genes. 47

Figure 20. Phenotype of transgenic seedlings overexpressing ZAT9, ZAT4 under the

regulation of Q2610. 49

Figure 21. Expression patterns of ZAT9p:GUS and ZAT4p:GUS in various tissues and expression patterns of ZAT9 and ZAT4 transcripts in various tissues. 51

Figure 22. Expression patterns of ZAT9 and ZAT4 visualized by reporter genes. 52

Figure 23. Identification of T-DNA insertion lines for ZAT9 and ZAT4. 54 Figure 24.RT-PCR analysis of ZAT1, ZAT9, and ZAT4 expression in zat1/2/3 mutants and

phenotype of triple mutant. 55

(13)

iv

ABBREVIATIONS

ABRC Arabidopsis biological research center

BRN1 BEARSKIN1

BRN2 BEARSKIN2

C2H2 Cystein2Histidine2 CaMV Cauliflower mosaic virus

CEL5 CELLULASE5

Col Columbia-0

CPC CAPRICE

DEG1 Degenerative primer1 DEG2 Degenerative primer2 DMSO Dimethyl sulfoxide

drd2-d defective root development2-dominant EAR ERF-associated amphiphilic repression EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EF-1 Elongation factor 1

EGL3 ENHANCER OF GLABRA3

ERF Ethylene response factor ETBR Ethidium bromide GFP Green fluorescent protein

GL2 GLABRA2

GL3 GLABRA3

GUS β-glucuronidase

MES 4-Morpholineethanaesulfonic acid

(14)

v MS Murashige and Skoog NAC NAM, ATAF and CUC PCR Polymerase chain reaction QC Quiescent center

RT Reverse transcription SD Standard deviation SDS Sodium dodecyl sulphate

SMB SOMBRERO

TAIL-PCR Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction TTG1 TRANSPANRENT TESTA GLABRA1

WER WEREWOLF

X-gulc 5-Bromo-4-chloro-3-indoly1-β-D-glucuronide

ZAT1 At1g02030

ZAT9 At3g60580

ZAT4 At2G45120

ZAT10 At1G27730

ZF Zinc finger

(15)

vi

ABSTRACT

Characterization of three related zinc-finger protein genes expressed in root cap border cells of Arabidopsis

Bang-Heon Lee Advisor : Associate Prof. Sang-Kee Song , Ph.D.

Departmant of Life Science, Graduate School of Chosun University

To screen for genes regulating the root development of Arabidopsis, UAS activation tags were introduced into the background of Q2610 where GAL4 transcription factors are highly expressed leading to the random overexpression of genes neighboring to the tags. A dominant mutant developing short and twisted root was isolated and designated as defective root development 2-D (drd2-D). The T-DNA containing the UAS tag was localized at the 133 base- pair upstream of the putative start codon of At1g02030 (ZAT1) by using thermal asymmetric interlace-PCR. ZAT1 encodes a zinc finger (ZF) protein containing three C2H2 ZF motifs. The reverse transcription-PCR (RT-PCR) analysis revealed that the ZAT1 expression was upregulated in drd2-D. In addition, Q2610>>ZAT1 transgenic lines recapitulated the drd2-D phenotype. These results suggest that drd2-D was induced by ZAT1 overexpression. The expression of reporter genes driven by the ZAT1 promoter was observed in the tissues undergoing maturation such as border cell of root cap, endodermis, vasculature, and hydathodes. The border-

(16)

vii

cell specific expression pattern of ZAT1 was not altered in sombrero (smb) accumulating additional root cap layers and SMB-overexpressing mutant suggesting that ZAT1 expression is independent of SMB. WOX5 and CYCB1;1 expression was down-regulated in ZAT1- overexpression lines suggesting that ZAT1 compromises the identity of quiescent center and suppresses cell divisions. On the other hand, SMB and CEL5 expression pattern was not altered in ZAT1-overexpression background suggesting that ZAT1 could not change the identity of root cap tissues. There exist two ZAT1-related genes, At3g60580 and At2g45120 in Arabidopsis named ZAT9 and ZAT4, respectively. To understand their functions, Q2610>>ZAT9 and Q2610>>ZAT4 transgenic lines were prepared and exhibited strong growth defects of seedlings like Q2610>>ZAT1. Both ZAT9 and ZAT4 promoters were active in the root cap border cells.

In addition, ZAT4 promoter was also active in the root hair cells, stomatal guard cells, and pollens.

Interestingly, ZAT9-GFP and ZAT4-GFP expressed their own promoters were also found in the other layers of root cap suggesting that ZAT9-GFP and ZAT4-GFP might be mobile. These shared expression pattern and function of three related ZF genes suggest that they might possess shared roles in the border cell maturation in the root cap. However, zat1 zat4 zat9 triple mutant showed no apparent phenotype in the root.

(17)

viii

국문초록

애기장대 근관의 경계세포에서 발현되는 세가지 zinc-finger 단백질 유전자들의 특성 규명

이방헌 지도교수 : 송상기 생명과학과 조선대학교 대학원

애기장대의 발달을 조절하는 신규 유전자의 선별하기 위하여 근단에 특이적으로 GAL4 전사인자를 발현하는 Q2610 인핸서 트랩 라인에 UAS 활성표지를 도입하 여 무작위적으로 인접한 유전자의 과대발현을 유도하였다. 형질전환체 중에서 뿌리 가 짧고 뒤틀리며 표피 세포의 패턴에 이상이 나타난 식물을 선별하였고, 이를 defective root development2-D (drd2-D)라고 명명하였다. Thermal asymmetric interlace-PCR (TAIL-PCR)을 활용하여 UAS 활성 표지를 포함한 T-DNA가 AT1G02030 (ZAT1) 유전자의 잠정적인 개시 코돈에서 133bp 상류 지역에 위치한 것을 확인하였다. ZAT 1은 세 개의 C2H2 유형의 zinc finger (ZF) 모티프를 포함하는 ZF 단백질을 암호화하고 있었다. RT-PCR을 수행한 결과 drd2-D의 배경하에서 ZAT1의 발현은 높은 수준으로 향상되었다. 또한, Q2610>>ZAT1 형질전환 식물을 제조한 결과 drd2-D의 표현형이 재현되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 drd2-D의 표현형이 ZAT1의 과대발현에 의해

(18)

ix

유래한 것임을 제시한다. ZAT1의 프로모터에 의해 조절되는 리포터 유전자들은 근관의 최외각 경계세포, 내피 세포층, 관다발 세포층 그리고 수공 등 성숙이 진행 되는 조직에서 발현되었다. 근관의 세포층이 증가한 sombrero (smb)돌연변이와 SMB가 과대발현된 돌연변이 식물에서 근관의 최외각 층에 특이적인 ZAT1의 발 현 패턴은 변화하지 않았으며, 이러한 결과는 ZAT1의 발현은 SMB에 비의존적이 라는 것을 의미한다. ZAT1 과대발현 배경하에서 WOX5와 CYCB1;1 유전자의 발 현이 약화되었는데 이는 ZAT1이 정지중심부의 정체성을 약화시키고 세포분열을 억제한다 것을 의미한다. 반면에 ZAT1 과대발현 배경하에서 SMB와 CEL5 리포 터 유전자의 발현 패턴이 유지되었는데 이는 ZAT1의 과대발현이 근관세포의 정 체성을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다. 애기장대에는 두 개의 ZAT1 유사 유 전자인 At3g60580와 At2g45120가 존재하며, 각각 ZAT9와 ZAT4라고 명명되 었다. 이들 유사 유전자들의 기능을 이해하기 위하여 Q2610>>ZAT9와 Q2610>>ZAT4 과대발현 형질전환식물을 준비하였으며 이들은 Q2610>>ZAT1과 마찬가지로 유식물의 생장을 강하게 억제하였다. ZAT9과 ZAT4의 프로모터는 공 통적으로 근관의 경계세포에서 발현되었으며, ZAT4의 경우 뿌리털세포, 자엽과 본 잎의 기공세포, 그리고 꽃가루에서도 발현되는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도 자신 의 프로모터에 의해서 발현된 ZAT9-GFP와 ZAT4-GFP는 근관의 다른 세포층 에서도 관찰되었으며 이러한 결과는 ZAT9와 ZAT4가 이동할 수 있음을 암시한다.

세 가지 관련된 ZF 유전자들이 공통된 발현 패턴과 기능은 세 유전자들이 근관의 최외각 세포의 성숙 과정에 공통된 역할을 담당할 것이라는 것을 제시한다. 그렇지 만 zat1; zat4; zat9 삼중돌연변이의 경우 뿌리에서 명확한 표현형을 나타내지 않았다.

(19)

1

I. 서론

1. 모델 식물로서의 애기장대의 장점

애기장대(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh)는 한 세대 기간이 짧고, 많은 수의 종자를 얻을 수 있으며, 상대적으로 유전체의 크기가 작아서 돌연변이를 용이하게 생성할 수 있다. 따라서 애기장대는 식물의 분자유전학적인 연구의 모델 식물로 활 용된다(Somerville and Koornneef, 2002). 애기장대에서 일어나는 발달과정의 유전 학적인 경로를 이해하기 위해서는 특정 유전자에 대한 기능상실 돌연변이를 획득하 는 것이 필수적이다. 그렇지만 애기장대를 포함한 대부분의 식물은 유전체의 많은 부분이 중첩되어 있어서 하나의 기능이 다수의 유전자들에 의해서 공동 수행되는 경우가 많다(Arabidopsis Genome, 2000). 기능이 중첩되는 유전자들의 경우에는 일반적인 유전학적 방법에 의한 기능상실 돌연변이에 의한 기능 탐색은 매우 어렵 다. 한편, 애기장대의 대부분의 유전자들에 대해서 T-DNA가 삽입된 돌연변이 집 단들이 확보된 바 있기 때문에 각각의 단일돌연변이들을 확보한 다음 상호 교배하 여 유사유전자들의 기능이 모두 소실된 다중 돌연변이를 제조하는 역유전학적 (reverse genetics)방법이 활용될 수 있다(Alonso et al., 2003; Sessions et al., 2002).

(20)

2

2. 활성표지 도입에 의한 과대발현 돌연변이 선별

하나의 기능이 다수의 유전자들에 의해서 공동으로 수행되는 경우에는 일반적 인 정유전학적(forward genetic)방법을 통하여 신규의 돌연변이를 탐색하기 어렵다.

약한 표현형이라도 식별되는 경우 역유전학적(reverse genetics)방법이 활용될 수 있지만 아무런 표현형이 확인되지 않은 상태에서 역유전학적인 접근은 용이하지 않 다. 유전자의 기능 중복을 극복하여 새로운 유전자의 기능을 탐색하기 위하여 활성 표지 방법이 활용되었다. Cauliflower mosaic virus (CaMV)에서 유래한 35S 인핸 서는 대표적인 활성표지이다(Weigel et al., 2000). 그렇지만 35S 인핸서는 식물의 모든 기관에서 항시적으로 높은 수준으로 발현하기 때문에 배발생 치사성, 유식물 치사성, 또는 불염성을 유발하여 자손을 생성하지 못할 수도 있다. 최근에는 이러한 단점을 극복하고자 조직특이적으로 활성표지를 도입하는 방법이 개발되었다. 효모에 서 유래한 GAL4 전사인자는 UAS cis 요소에 특이적으로 결합하여 하류에 위치한 유전자의 전사를 촉진한다. 전사활성이 강화된 GAL4 (GAL4-VP16)를 조직특이적 으로 발현하는 애기장대 enhancer trap의 유전체에 UAS요소가 5회 연속으로 반복 된 활성표지(5x UAS)를 무작위적으로 도입하면 조직 특이적으로 특정 유전자를 발 현시킬 수 있으며 이에 따른 표현형을 관찰할 수 있다(Gardner et al., 2009; Waki et al., 2013).

(21)

3

3. 애기장대에서 뿌리의 발생 과정

식물의 지상부의 대부분은 정아분열조직(shoot meristem)에서 유래하며 지하 부의 대부분은 근단분열조직(root meristem)에서 유래한다. 두 분열조직은 식물의 배발생과정 중에서 심장형 배 단계에서 형성된다. 수정 이후에 접합자는 정단세포와 기저세포로 분열하는데 정단세포는 분열의 통해서 대부분의 실제의 배본체(embryo proper)를 형성하며 이는 이후의 대부분의 식물조직의 기원이 된다. 한편 기저 세 포의 경우 수회의 분열을 통해서 배병(suspensor)을 형성하여 주로 배에 영양분을 공급하게 된다. 흥미롭게도 기저세포에서 유래한 최상단 세포만은 실제의 배 (embryo proper)에 편입되어 근단분열조직의 정지중심부와 중축근관(collumella root cap)세포의 기원이 된다. 이 세포는 hypophysis라고 부르며 이 세포는 비대칭 적인 분열을 통해서 렌즈형태의 세포를 상층부에 형성하게 되는데 이 세포가 근단 분열조직에서 미분화 세포들의 성숙을 억제하는 정지중심부로 발달한다(Figure 1).

정지중심부에는 중심주 시원세포, 피층/내피 시원세포, 표피/측근관 시원세포, 중축 근관세포의 시원세포가 위치하며 이들은 stem cell의 역할을 수행하여 미분화된 세 포를 지속적으로 공급한다(Benfey and Scheres, 2000; Cederholm et al., 2012;

Scheres, 2007; Van Norman et al., 2011).

(22)

4

Figure 1. Model of major stages of Arabidopsis embryogenesis.

From the egg cell to cotyledon stage, proceed to the picture above. Colors indicate for hypocotyl (light green), cotyledons (dark green) and root (yellow). At the heart stage, root meristem and shoot meristem are created (Cederholm et al., 2012).

(23)

5

4. 근관의 발생과정

근관은 정지중심부(quiescent center, QC)의 하단에 위치한 두 종류의 시원세포에 서 유래한다(Figure 2). QC 아래에 위치한 애기장대에서 epidermis/LRC initial와 columella initial에서 각각 측면근관(lateral root cap)과 중축근관(columella root cap)이 발달한다(Dolan et al., 1993; Karve et al., 2016). 이 세포들이 줄기세포영 역에서 이탈하면 분화를 개시하는데, 특히 중축근관세포는 분화되면 전분립이 축적 되는 특징을 나타낸다. 이러한 분화된 중축근관세포는 statocyte라고 부르며 중력을 감지하는 역할을 수행한다(Sievers et al., 1995). 중축근관세포가 근관의 최외각으 로 이동할 때 세포소기관은 급속하게 변화하기 시작하여 많은 액포와 골지체가 세 포내에서 형성되고, 소포체막이 뿌리에서 멀리 있는 피질부위에서 핵의 주변 부위로 재배치된다. 따라서 분화된 중축근관세포는 statocytes에서 분비세포로 전환된다.

근관의 성숙에서 마지막 단계는 border cell의 분리이며 이 과정은 개별세포로 진행 되지 않고 조직된 층단위로 분리되는 특성을 보인다(Kamiya et al., 2016; Vicre et al., 2005). 측면근관세포는 예정세포사멸(programmed cell death) 및 잔존하여 살 아있는 세포의 자율적인 분리에 의해 이루어지고(Fendrych et al., 2014), 중축근관 세포는 살아있는 세포의 층과 하나 또는 두 개의 중축 방향으로 방출된다(Kumpf and Nowack, 2015).

(24)

6

5. 근관의 기능과 생장

식물은 고착생활을 하기 때문에 생물학적 스트레스와 비생물학적 스트레스를 견뎌야 하는데, 비생물학적 스트레스는 고온, 가뭄, 고염 등이 있고, 생물학적 스트 레스는 병원균 감염, 초식성 생물의 섭식 등이 있다(Mittler, 2006). 근관은 이러한 환경 스트레스에 끊임없이 반응하는 대표적인 기관이다. 근관은 뿌리조직의 최외각 층에서 존재하며 근단분열조직을 보호하는 기관이다(Iijima et al., 2003). 또한, 근 관은 분열 조직을 둘러 싸는 두 개의 세포 유형인 중축근관과 측면근관으로 구성되 고 토양에서 중력방향으로 지속적으로 생장을 한다(Blancaflor et al., 1999;

Monshausen and Sievers, 2002). 식물의 뿌리는 생장과정에서 토양과 같은 기질과 의 마찰로 인해 물리적인 저항을 받게 된다. 이러한 물리적인 접촉에 대한 방향성을 제공하기 위해서 근단은 중력과 접촉을 감지를 하여 옥신을 재분배하는 것으로 알 려져 있다(Abas et al., 2006). 근관은 토양 환경과 접촉하고 있어서 점액성 물질을 분비하여 마찰력을 감소시키고(Blancaflor et al., 1998), 토양에서 병원균과 생물학 적 스트레스에 대해 보호하기 위해 2차대사물과 항균성 화합물을 생성한다 (Cannesan et al., 2012; Driouich et al., 2013; Hawes et al., 1998; Vicre et al., 2005; Watson et al., 2015).

(25)

7

Figure 2. Schematic diagram of location of root cap.

Colors indicate for quiescent center (light yellow), columella initials (dark green), epidermis/LRC initials (white), lateral root cap (blue) (Karve et al., 2016).

(26)

8

6. 근관의 최외각 세포의 형성을 조절하는 유전자들의 기능

식물의 전사 조절 인자 중에서 가장 큰 계열 중 하나인 NAC (NAM, ATAP, and CUC) 전사인자는 주로 발달, 노화, 목질 형성, 및 스트레스 반응과 관련된 전사 조 절에 중요한 역할을 수행한다고 제안되었다(Kim et al., 2016; Nakano et al., 2015;

Shao et al., 2015). 애기장대의 근관 형성 과정에는 NAC 전사인자인 FEZ, SOMBRERO (SMB), BEARSKIN1 (BRN1)과 BEARSKIN2 (BRN2)가 중요한 역 할을 담당하고 있으며, 이 유전자들은 근관 세포층의 숫자를 조절하며, 최종적으로 는 세포벽의 변형을 포함한 분화를 통한 세포의 성숙과정도 조절한다(Pereira- Santana et al., 2015). Root cap initials에서 FEZ는 우선적으로 발현되어 근관 세포 를 형성하는 세포의 분열을 촉진하는 반면, SMB는 분화된 근관세포에서 발현되고 FEZ의 발현을 억제하는 기능과 근관의 성숙을 조절하는 기능을 수행한다고 알려져 있다(Bennett et al., 2010; Willemsen et al., 2008). SMB는 분화된 columella root cap initial 및 epidermis/LRC initial 세포 전체 영역에서 발현되지만, BRN1 및 BRN2는 중축 근관에서 강하게 발현되며(Bennett et al., 2010), 근관의 분화와 관 련된 유전자의 발현을 조절한다(Kamiya et al., 2016). 근관 최외각 세포의 분화과 정에서 세포벽의 분해는 필수적이며 다양한 분해 효소를 필요로 한다(Durand et al., 2009; Hawes and Lin, 1990; Vicre et al., 2005; Wen et al., 1999). 세포벽의 주성 분인 셀룰로오스의 분해는 CELLULASE5 (CEL5) 유전자의 산물에 의해 이루어지 고(Karve et al., 2016), CEL5의 발현은 BRN1, BRN2와 SMB의 의해 조절이 되지 만 구체적인 조절 기작은 명확하게 밝혀지지 않았다.

(27)

9

7. 애기장대 뿌리 표피세포의 운명 결정에 관련된 유전자들의 특징

애기장대 뿌리의 표피는 뿌리털이 생성되는 세포와 생성되지 않는 세포로 구성 되어 있다. 세포의 운명 결정은 위치 의존적인 방식으로 N-position에 위치하는 세 포는 무모세포로 운명이 결정되고, 하부에 존재하는 한 개의 피층세포와 접촉하는 반면, H-position에 위치하는 세포는 유모세포로 운명이 결정되고, 하부에 존재하는 두 개의 피층세포와 접촉한다(Dolan et al., 1993; Galway et al., 1994). 이러한 뿌 리 표피세포의 운명은 GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3) (Bernhardt et al., 2003), WEREWOLF (WER) (Lee and Schiefelbein, 1999), MYB23 (Kang et al., 2009), TRANSPANRENT TESTA GLABRA1 (TTG) (Galway et al., 1994; Walker et al., 1999), GLABRA2 (GL2) (Masucci et al., 1996), CAPRICE (CPC) 등의 다양한 유전자들에 의해서 결정된다. WER가 주로 N-position의 표피 세포에서 GL2의 발현을 직접 유도하여 무모의 세포운명을 촉 진하고, GL3/EGL3 복합체가 이 과정에서 필요하다(Lee and Schiefelbein, 1999).

또한, 이 복합체는 N-position의 세포에서 CPC의 발현을 유도하고 CPC 단백질은 H-position으로 이동하여 유모세포의 운명을 결정한다(Lee and Schiefelbein, 2002; Ryu et al., 2005; Simon et al., 2007). 이러한 과정에서 WER와 CPC는 GL2 발현을 조절하여 뿌리털 유무의 운명을 결정하기 위해 경쟁한다고 알려져 있다 (Song et al., 2011)(Figure3).

(28)

10

Figure 3. Models of genes that determine the fate of root hair.

The upper part of the figure is model that promotes GL2 expression. WER, like EGL3/GL3, promotes GL2 and inhibits root hair in N cell. The under part of the figure is model that suppresses GL2 expression. WER promotes CPC expression and inhibits GL2 expression in H cells, thus determining the fate of root hair.

(29)

11

8. C

2

H

2

zinc-finger protein의 기능

Cys2/His2-type (C2H2) zinc finger protein은 ETHYLENE RESPONSE FACTOR-associated amphiphilic repression (EAR) domain을 포함하고 있고, 비 생물학적 스트레스 조건에 대해 애기장대의 방어반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Kazan, 2006; Ohta et al., 2001). EAR motif는 보조인자의 도 움을 받아 염색질을 비활성화시켜 표적 유전자들의 발현을 억제하는 기능을 수행한 다(Knee et al., 2000)(Figure 4). 애기장대에서 EAR motif를 포함한 C2H2 zinc finger protein gene family에는 AT1G02030 (ZAT1) ,AT1G27730 (ZAT10), AT3G60580 (ZAT9), AT2G45120 (ZAT4), AT2G17180 (DUO1-ACTIVATED ZINC FINGER 1, DAZ1), AT4G35280 (DAZ2) 등 다수의 유전자들이 존재한다 (Kagale et al., 2010). 이 유전자들 중에서 ZAT10의 발현은 가뭄, 삼투압 및 염분 스트레스에 대한 내성을 증가시키고 생장의 억제를 유도하는 것으로 밝혀졌다 (Mittler et al., 2006; Sakamoto et al., 2000). ZAT10은 EAR motif를 함유하고 있 으며, 비생물적인 스트레스에 대한 방어 유전자의 전사를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Lee et al., 2002; Ohta et al., 2001; Sakamoto et al., 2004). ZAT10의 발현은 가 뭄 스트레스, 삼투압 스트레스와 염분에 대한 식물의 증가된 내성과 생장 억제를 초 래하는 것으로 밝혀졌고(Mittler et al., 2006; Sakamoto et al., 2004), 이러한 결과 는 ZAT10이 비생물적인 스트레스에 반응하여 식물의 방어반응을 조절하는데 중요 한 역할을 하는 것을 시사한다(Mittler et al., 2006).

본 연구에서 애기장대의 뿌리의 발달 과정을 조절하는 신규의 유전자를 확보하 고자 UAS-GAL4 활성표지의 도입에 의해서 defective root development2-D (drd2-D) 돌연변이를 선별하였다. drd2-D의 표현형은 C2H2 유형의 zinc finger 단백질을 암호화하는 At1g02030 (ZAT1)의 과대발현에 의해서 유도된다. 아직까 지는 ZAT1 유전자에 대한 상세한 연구 결과가 보고된 바 없기 때문에 ZAT1 유전 자 및 유사유전자인 ZAT4/ZAT9의 과대발현 표현형과 조직 특이적인 발현양상을

(30)

12 조사하여 그 기능을 이해하고자 시도하였다.

(31)

13

Figure 4. Model of EAR motif-mediated repression from stress cue in Arabidopsis.

When Plant received stress or hormone signal, EAR motif is phosphorylated and through interaction with SAP18, HDA19 was stimulated. HDA19 promote chromatin deacetylation, as a result, released chromatin repress the target gene transcription. The EAR motif also stimulates HDA19 through a mechanism of action with TPL, this is not known how to stimulate but, this pathway also repress the target gene transcription (Kagale and Rozwadowski, 2011).

(32)

14

II. 재료 및 방법

1. 재료식물와 생장조건

애기장대(Arabidopsis thaliana) 야생형은 Columbia-0를 사용하였으며, 뿌리 생장에 결함이 있는 돌연변이체인 rgd-2를 사용했다. 또한, zinc finger family에서 암호화 지역에 T-DNA가 삽입된 식물(SALK_009776, Wisceq_DsLox477-480D18들을 Arabidopsis Biological Research Center (ABRC, Ohio)에서 주문하여 사용하였고, GABIseq_181A01은 Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)에서 주문하여 사용하였다. 애기장대를 무균상태에서 배양하기 위해서 종자를 0.7%의 NaOCl 수용액에 의해서 10 분간 표면살균을 시킨 뒤 Clean bench에서 파스퇴르 피펫을 이용하여 멸균된 증류수로 5회 세척하였다. 파스퇴르 피펫을 이용하여 0.7% gelrite (Duchefa) 를 고형화된 1/2 MS 배지에 파종한 다음 2일 동안 4℃에서 배양한 후 22℃

에서 24시간 광주기 조건하에서 수직으로 세워 배양하였다. 흙에서 배양한 경 우 Osmocote 14 – 14 - 14 약 1 g/pot를 함유하는 흙 : 펄라이트 : 질석의 1 : 1 : 1 혼합물 (Sunshine Mix #5, Sungro)에서 심어 4℃ 배양상에서 5일간 배 양한 후 22℃ 24시간 광주기 조건하에서 배양시켰다.

2. 사용한 배지 및 조성 2-1. Luria broth의 준비

2 L 용량의 삼각플라스크에 1 L의 증류수와 25 g의 Luria broth (tryptone, yeast extract, NaCl) 혼합물을 첨가한 후 흔들어 녹였다. 녹은 플

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15

라스크에 agarose powder를 1.5% 넣은 뒤 입구를 호일로 막고 autoclave 진 행하였고 60℃ 항온수조에서 식힌 뒤 0.2 μm의 필터를 통하여 멸균된 적절 한 항생제를 첨가하였고, petri dish에 약 50~60개정도에 분주하였다. 상온에 서 말린 뒤, 다음 날 비닐에 밀봉하여 4℃에서 보관하였다.

2-2. Murashige and Skoog 배지의 준비

2 L 용량의 삼각플라스크에 1 L 증류수를 넣고, sucrose 10 g과 MES 0.2 g을 녹인 뒤, 1 M KNO3 5 ml, 1 M KH2PO4 2.5 ml, 1 M MgSO4 2 ml, 1 M Ca(NO3)2 2 ml, 20 mM FeEDTA 2.5 ml을 넣어주었다. 소량의 1 M KOH를 첨가하여 배지의 pH를 5.8로 맞춰주었다. Gelrite 6 g을 첨가하고 알루미늄 호일로 플라스크를 덮은 뒤 autoclave를 진행하였고, 60℃ 항온수조에서 식힌 뒤, square dish에 50 ml씩 clean bench에서 분주하였다. 상온에서 말린 뒤, 다음 날 비닐에 밀봉하여 4℃에서 보관하였다.

3. 애기장대 게놈 DNA의 추출

애기장대의 잎 조직을 액체질소를 이용하여 막자 사발에서 갈아준 뒤 10 mg ∼ 30 mg 정도 샘플을 1.5 ml microcentrifuge tube에 넣은 후 액체질소 에서 30초동안 냉각시켰다. 샘플이 담겨있는 튜브에 cell lysis 용액을 300 μ l 첨가 한 후 65℃ 항온수조에서 60분동안 반응시켰다. RNaseA (4 mg/ml) 1.5 μl를 넣고 혼합시킨 뒤, inverting 후 37℃ 항온수조에서 30분 동안 반응 시켰고, 상온에서 5분 동안 식힌 후 protein precipitation 용액을 100 μl 첨 가하고 vortexing을 1분 동안 진행하였다. 그 후 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 시행한 뒤 상층액을 다른 튜브에 옮겨주고 100% isopropanol

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16

300 μl 첨가한 후 50회 동안 inverting을 실시하였다. 10000 rpm에서 1분간 원심분리를 시행한 후 상층액은 제거하고 WB (80% ethanol) 500 μl 첨가한 뒤 inverting 후 10000 rpm에서 1분간 원심분리를 하고 상층액을 제거하였 다. 한번 더 washing 후 남은 ethanol을 파이펫으로 완전히 제거 후, 15분동 안 상온에서 건조시킨 후 DNA hydration 용액에 20~100 μl에 녹여 vortexing을 시행하고 추출하였다.

Genotyping을 하기 위한 genomic DNA 추출할 때에는 기존의 알려진 신 속한 식물 DNA 추출 방법을 사용하였다(Edwards et al., 1991). 1~2개의 잎 을 Eppendorf tube에 넣고 200 μl의 extraction buffer (200 mM Tris Hcl pH 7.5, 250 mM Nacl, 25 mM EDTA pH 8.0, 0.5% SDS)를 넣었다. Blue pestle을 사용하여 식물조직을 마쇄한 다음 vortexing을 시행한 후에 얼음에 두었다. 그 후, 4℃에서 14000 rpm 조건으로 5분 동안 5분간 원심분리를 시 행하였고, 상층액 150 μl와 isopropanol 150 μl를 섞은 후 상온에서 2분간 반응하였다. 다시 14000 rpm, 상온에서 2분간 원심분리를 시행하였고, 상층액 을 제거한 뒤, 70% ethanol을 첨가 후 14000 rpm, 상온에서 원심분리를 진행 하였다. 15분간 건조한 후, 멸균된 증류수 50 μl에 녹여 DNA를 추출하였다.

4. Primer의 제작

T-DNA 삽입지역을 찾기 위한 thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (TAIL-PCR)에 사용되는 degenerative primer (Liu and Whittier, 1995)들을 제작하였다. 또한, 발현 벡터나 리포터 발현을 위한 binary vector에 특정한 유전자 및 프로모터들을 삽입할 수 있도록

(35)

17

제한효소 장소를 첨가하여 프라이머들을 설계하였으며, genotyping을 하여 homozygous 식물을 선별하기 위한 프라이머를 설계하였다. 최종적으로 Macrogen에 의뢰하여 primer를 주문하였다(Table 1).

5. TAIL-PCR 방법

TAIL-PCR은 Liu와 Whittier (1995)의 방법을 사용하여 아래와 같이 3단계에 걸쳐서 진행하였다. pBIB-UAS vector (Waki et al., 2013)의 left border에 상보적인 pBIBLB372와 degenerative primer인 DEG1을 사용하였고, Taq polymerase를 사용하여 PCR 생산물 20 μl를 제작하였다.

1차 반응조건은 93℃에서 1분간, 95℃에서 1분동안 반응한 뒤, 94℃에서 30초, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분 30초간 5회 동안 진행하였고, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 25℃에서 72℃까지 0.2℃/sec 조건으로 3분동안 반응시켰다. 그 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초간, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초동안 반응하였고, 94℃에서 30초간, 44℃에서 1분간, 72℃에서, 2분 30초간 15회 진행하였고, 72℃에서 5분간 반응하였다. 2차 반응조건은 1차 생산물을 1/50로 희석시켜서 사용하였고, 미리 제작한 pBIBLB262, DEG1 primer를 사용하였고, Taq polymerase를 사용하여 1차 생산물 20 μl를 만들었다.

반응시간은 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초간, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초간 진행하였고, 94℃에서 30초간, 44℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초동안 12회 진행하였고, 72℃에서 5분간 반응하였다. 마지막으로 3차 반응조건은 2차 생산물을

(36)

18

1/10로 희석시켜서 사용하였고, 미리 제작한 pBIBLB172, DEG1 primer와 Taq polymerase를 사용하여 3차 생산물을 50 μl로 만들었다. 반응시간은 94℃에서 30초간, 44℃에서 1분간, 72℃에서 2분 30초동안 20회 진행하였고, 72℃에서 5분간 반응하였다.

6. Translational fusion construct 제작 6-1. Pfu를 활용한 PCR 방법

Columbia 식물에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 특정한 primer (Table 1)와 Nanohelix사 제품의 buffer와 polymerase를 사용하여 94℃에서 3분동 안 반응하였고, 94℃에서 30초간, 52℃ 30초간, 72℃ 1분동안 25회동안 반응 하였고, 마지막으로 72℃에서 5분동안 반응시켰다.

6-2. 클로닝 벡터로의 클로닝 방법

PCR product를 pJET vector에 ligation 시킨 후 상온에서 overnight으로 반응시켰다. 다음날 ligation product 5 μl에 competent cell 100 μl를 첨가해 얼음에 10분동안 반응시킨 후, 42℃ 항온수조에서 45초 반응시킨 후 바로 얼음에 2분동안 방치하였다. LB 액체배지를 500 μl를 첨가한 후 37℃

배양기에서 20분동안 배양한 후, 37℃ shaking incubator에서 40분동안 배양하였다. 그 후, ampicillin이 함유된 LB 고체배지에 도말하였고, 37℃

배양기에서 overnight동안 배양하였다. Colony를 주형으로 PCR을 진행하여 insert DNA를 확인한 후, LB 액체배지 3 ml에 colony 한 개를 이쑤시개를 이용하여 넣어준 뒤 37℃ shaking incubator에서 overnight 시켰다.

Nanohelix사의 plasmid prep용 kit를 이용하여 plasmid DNA를 추출한 후

(37)

19

37℃ 항온수조에서 특정한 제한효소로 절단하여 insert DNA을 확인하였다.

그 후, 염기서열을 분석하여 이상 유무를 확인한 후, 37℃ 항온수조에서 특정한 제한효소로 절단한 후 전기영동을 진행한 뒤, Nanohelix사의 gel purification kit를 이용하여 삽입된 DNA를 추출하였다.

6-3. Binary 벡터로의 클로닝 방법

삽입할 DNA의 끝 부분에 존재하는 같은 특정한 제한효소를 이용하여 reporter 유전자들이 삽입되어 있는 pCB308, pCB302 vector를 절단하고 염기서열이 이상이 없는 삽입할 DNA와 ligation을 시킨 후 상온에서 overnight을 시켰고, 5x UAS promoter가 삽입되어있는 pCB302는 삽입할 DNA의 끝 부분에 존재하는 같은 특정한 제한효소를 이용하여 절단한 후 염기서열이 이상이 없는 DNA와 ligation 시킨 뒤 상온에서 overnight 시켰다(Figure 5, 6, 7). 다음날 ligation product 5 μl에 competent cell 100 μl를 첨가하여 얼음에서 10분 동안 반응시킨 후, 42℃ 항온수조에서 45초 반응시킨 후 바로 얼음에 2분동안 방치하였다. LB 액체배지를 500 μl를 첨가하고 37℃ 배양기에서 20분 동안 배양한 뒤 37℃ shaking incubator에서 40분 동안 배양한 후 kanamycin이 첨가되어 있는 LB 고체배지에 도말 하였고, 37℃ 배양기에서 overnight동안 배양하였다. Insert DNA를 확인하기 위해, colony를 주형으로 colony PCR을 진행하였고, band가 있는 colony를 LB 액체배지 3 ml에 colony 한 개를 이쑤시개를 이용하여 넣어준 뒤 37℃ shaking incubator에서 overnight동안 배양하였다.

Nanohelix의 plasmid prep용 kit를 이용하여 plasmid DNA를 추출한 후 특정한 제한효소로 37℃ 항온수조에서 절단하여 insert DNA를 확인하였다.

(38)

20

Table 1. List of primers for PCR

Target gene Primer Sequence

ZAT1

Forward 5`-AGGATCCATGGAAGAGAGGCATAAGTG–3`

Reverse 5`-CTCTAGATTAAAAAACCGACGAGGCCAT–3`

ZAT1promoter

Forward 5`-CTCTAGACACTTGGCGTCTTCTGCAGA-3`

Reverse 5`-AGGATCCTTCCTCAATTTACCAAAACAGAG-3`

ZAT1coding

Forward 5`-AGGATCCATGGAAGAGAGGCATAAGTG-3`

Reverse 5`-CTCTAGAAAAAACCGACGAGGCCATCTC-3`

GFP5ER

Forward 5`-GGATCCATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTT-3`

Reverse 5`-CTCTAGATTAGAGTTCGTCGTGTTTGTAT-3`

smRSGFP

Forward 5`-ACTAGTATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3`

Reverse 5`-CTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3`

ZAT9

Forward 5`-GGATCCATGGAGAGTTACAAGTGCAG-3`

Reverse 5`-ACTAGTTCATTGAAACACCACAGAGAC-3`

ZAT9promoter

Forward 5`-GTCTAGAGCCTAGAGTTGTTGTCGCTC-3`

Reverse 5`-GGATCCAGTAAAGAGAAGTGGAATCTACA-3`

ZAT9coding

Forward 5`-GGATCCGAGAGTTACAAGTGCAGGGTT-3`

Reverse 5`-ACTAGTTCATTGAAACACCACAGAGACTTC-3`

ZAT4

Forward 5`-GGATCCATGGAGAGATACAAGTGTAGAT-3`

Reverse 5`-ACTAGTCCATTCATCAAACACCAAAGAA-3`

ZAT4promoter

Forward 5`-CTGCAGAATGTGAGATTATATAGTAGTTTGA-3`

Reverse 5`-GGATCCTTTTCAACACGACAAAAATTACAG-3`

ZAT4coding

Forward 5`-GGATCCATGGAGAGATACAAGTGTAGAT-3`

Reverse 5`-CTCTAGACCATTCATCAAACACCAAAGAA-3`

SynLB3 5`-TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC-3`

LBb1.3 5-`ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3`

Wis_LT6 5`-AATAGCCTTTACTTGAGTTGGCGTAAAAG-3`

GABI_kat_o8409 5`-ATATTGACCATCATACTCATTGC-3`

GABI_kat_o8474 5`-ATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTT-3`

pBIBLB372 5`-GCAGCTGGCACGACAGGTTTC-3`

pBIBLB262 5`-GCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3`

pBIBLB172 5`-GTCGACAGATCTCATGCCTGCA-3`

DEG1 5`-WGCNAGTNAGWANAAG-3`

DEG2 5`-AWGCANGNCWGANATA-3`

(39)

21

Figure 5. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT1 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT1 promoter.

A, A diagram showing the construct for the expression of the ZAT1 gene under the control of 5x UAS promoter. B, A diagram for the recombinant DNA construct to express of ZAT1-GFP translational fusion (B) and GFP5-ER (C) under the regulation of ZAT1 promoter.

A

B

A

C

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22

Figure 6. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT9 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT9 promoter.

A

B

A

C

(41)

23

Figure 7. A diagram showing the construct for the expression of the ZAT4 gene under the control of 5x UAS promoter and ZAT4 promoter.

A

B

A

C

(42)

24

7. Agrobacterium 의 형질전환

적당한 용기에 액체질소를 담은 뒤, -80℃ deep freezer에서 agrobacterium competent cell 100 μl를 꺼내 얼음 위에서 15분 동안 녹였다. DNA 5 μl와 혼합 한 뒤 얼음에서 15분간 반응시켰다. 그 후, 액체질소에 5분간 반응시킨 뒤 37℃

항온수조에서 5분간 반응시켰다. 이 과정을 한번 더 진행한 후 얼음에 2분간 반응시킨 후 액체 LB를 500 μl를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 배양시켰다. LB 항생제(100 μg/ml kanamycin, 100 μg/ml gentamycin) 고체배지에 200 μl를 도말한 후 배양기에서 2일동안 배양하였다.

8. 형질전환의 확인

LB 고체 항생제(100 μg/ml kanamycin, 100 μg/ml gentamycin)배지에서 배 양된 colony를 3 ml LB 액체 항생제배지에 접종한 뒤 28℃에서 16~20시간 동안 배양하였다. Plasmid DNA kit를 사용하여 완충용액에 녹인 뒤 0.5 μg 정도의 양을 취하여 제한효소로 절단 한 후 전기영동으로 삽입된 유전자를 확인하였다.

9. Agrobacterium 을 이용한 애기장대 형질전환

애기장대의 형질전환은 floral dip method (Clough and Bent, 1998)를 활용하여 시행하였다. LB 항생제(100 μg/ml kanamycin, 100 μg/ml gentamycin)배지에 이 쑤시개를 사용하여 Agrobacterium colony를 접종 한 뒤, 16~20시간 정도 28℃에 서 shaking incubator에서 배양하였다. 항생제가 포함된 80 mL LB배지에 40 ml를 옮겨 16~20시간 배양한 후, 형질전환 할 식물의 silique과 open flower들을 제거 하였다. 배양액을 두 개의 50 mL conical tube를 사용하여 Biofuge사의 swing

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25

rotor를 이용하여 4800 rpm 12분동안 상온에서 진행하였다. 상층액을 제거한 뒤 infiltration media (50 g/L sucrose, 1.75 g/L MgCl2)를 각 tube마다 25 mL씩 첨가 후, 5~10분동안 재 현탁시켰다. silwet (208.3 μl/L) 첨가 후 infiltration media에 재현탁 시킨 용액을 혼합시켜 준 후 애기장대 식물을 뒤집어 5~6초 동안 골고루 묻혀주었다. 묻지 않는 곳에는 마이크로 피펫을 이용해서 묻혀 준 뒤 22℃에서 어 두운 곳에서 16~20시간 동안 습한 상태로 놓아둔 뒤 식물을 정상적으로 22℃ 24 시간 광주기 조건에서 생육시켰다.

10. GUS 염색

X-Gluc 용액 (100 mM NaH2PO4 (pH7.4), 5 mM Potassium ferricyanide, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 5 mg/ml X-gluc)을 이용하여 GUS 염색을 수행 하였다(Lee and Schiefelbein, 2002). 1/2 MS 배지에서 생장한 식물체를 X-gluc 용액이 담긴 ep-tube에 상온에서 적정한 시간동안 반응시킨 후 관찰하였다.

11. Phloroglucinol 염색

20% HCl은 D.W 37.5 ml와 농축된 HCl (10.18 M, dens=1.16 kg/l) 62.5 ml를 혼합하여 100ml로 만든 후 식물의 조직을 20% HCl으로 염색하고 관찰하였다.

12. T-DNA가 삽입된 돌연변이체 선별

ZAT1의 돌연변이를 선별하기 위해서 SALK_009776 (zat1-1)를 사용하였다.

SynLB3와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형

(44)

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밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다.

ZAT9의 돌연변이의 선별은 Wisceq_DsLox477-480D18 (zat9-1)를 사용하였다.

WisLT_6과 RP primer로 PCR을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형 밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다. ZAT4의 돌연변이를 선별하기 위해서는 GABIseq_181A01 (zat4-1)를 사용하였고, LBb1.3, RP primer 로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 전기영동을 진행하여 돌연변이 band를 얻었고, LP primer와 RP primer로 PCR을 진행한 후 전기영동을 진행하여 야생형 밴드를 얻었다. 2가지 결과를 비교하여 homozygous 돌연변이 종자를 선별하였다.

13. Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

QIAGEN사의 식물용 RNeasy kit를 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 야생 형 및 돌연변이 유식물에서 RNA를 추출한 다음, RNA를 Eppendorf사의 biophotometer를 사용하여 정량하였다. 정량한 1 ug의 RNA를 취한 다음, Invitrogen사의 DNaseI을 처리해서 게놈 DNA를 분해하였다. 이 반응은 상온에서 15분간 진행되었으며 EDTA 용액을 첨가한 후 65℃의 heating 블록에 10분간 옮 겨주어 반응을 종결시켰다. cDNA의 합성은 Agilent사의 Accuscript^TM cDNA합성 kit를 사용해서 제조사의 설명서를 따라 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 1st strand cDNA를 제조하였고 이를 주형으로 사용하여, 유전자 특이적인 primer 조합을 사 용해서 94℃에서 3분간, 72℃ 5분간 30회 PCR 반응을 수행하였다.

(45)

27

III. 결과

1. 활성표지도입으로 유도된 돌연변이체들의 표현형 관찰

애기장대의 뿌리 발달을 조절하는 새로운 유전자들을 선별하기 위하여 뿌리 말단의 전역에서 GAL4-VP16 전사인자를 높은 수준으로 발현하는 Q2610 배경에 5x UAS 활성표지(Waki et al., 2013)를 도입하였다. 약 3000여개의 형질전환된 T1

식물체들을 hygromycin B 항생제 배지에서 선별하여 표현형을 관찰한 결과 야생형과 다른 표현형을 가진 다수의 형질전환 식물들을 선별할 수 있었다(Song, 2016). 이러한 식물들 중에서 짧고 뒤틀린 뿌리를 형성하며 뿌리 표피세포의 패턴이 손상된 돌연변이를 선별하였으며, 이를 defective root development2- dominant (drd2-D)로 명명하였다. 야생형 식물과 비교하였을 때, drd2-D homozygous 식물의 경우, hemizygous 식물에 비하여 더욱 뿌리가 짧고 극심하게 튀틀린 형태로 생장하였다(Figure 8A). 뿌리 표피세포의 패턴 형성의 표지 유전자로써 non-hair cell 위치에 특이적으로 발현되는 GL2p:GUS와 CPCp:GUS 리포터 유전자를 drd2-D hemizygous 배경에 도입하여 뿌리 표피세포의 발달 양상을 조사하였다. 야생형 배경에서는 두 종류의 리포터 유전자들은 발현 세포열과 비발현 세포열에서 규칙적으로 발현되었으나 drd2-D 배경에서는 규칙적인 발현 패턴이 사라지고 상대적으로 무작위적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Figure 8B). 이러한 결과는 drd2-D 원인 유전자의 과대발현이 정상적인 뿌리 패턴 형성을 저해하는 것을 의미한다.

(46)

28

Figure 8. Root phenotype of drd2-D mutants.

A, drd2-D hemizygous and homozygous seedlings showing twisted root and random hair patterning phenotype together with WT at 4 day after germination. B, Compromised root hair patterning of drd2-D seedlings visualized by marker gene expression of GL2p:GUS and CPCp:GUS together with WT controls. Scale bar (upper panels) = 0.5 mm, scale bar (lower panels)

= 0.05 mm.

A

B

WT

drd2-D hemizygous

drd2-D

homozygous

(47)

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2. TAIL-PCR을 이용하여 삽입된 위치 확인

drd2-D의 T-DNA 삽입 위치를 찾기 위해 게놈 DNA를 추출해서 LB primer (LB172, LB262, LB372)와 degenerated primer (DEG1)을 활용하여 TAIL-PCR을 진행하였다. LB372부터 LB172까지 3번에 걸쳐서 차례로 PCR을 진 행한 결과, PCR을 진행함에 따라 PCR 산물의 크기가 2차 반응에 비하여 감소하는 3차 반응 생산물이 합성되었으며, 그 크기는 약 600 bp로 확인되었다(Figure 9). 3 차 PCR 결과로 생성된 DNA 밴드를 gel purification을 통해서 순수 분리하였고, pGEM-T-easy vector에 클로닝한 다음 sequencing을 시행하였다. 그 결과 pBIB-UAS 벡터에서 유래한 5개의 UAS 활성표지가 존재하는 것을 확인하였고, T-DNA는 애기장대의 At1g02030 (ZAT1) 유전자의 잠정적인 개시 코돈에서 133bp 상류 지역에 위치한 프로모터 영역에 삽입된 것을 확인하였다(Figure 10A).

RT-PCR 분석을 통해서 drd2-D에서는 Q2610과 비교하여 ZAT1의 전사 수준이 증가된 것을 확인하였다(Figure 10B). 이러한 결과들을 통해서 drd2-D의 표현형 이 ZAT1의 과대발현에서 유래하였을 것이라고 추정할 수 있었다.

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Figure 9. Gel electrophoresis results of three consecutive TAIL-PCR by using drd2-D genomic DNA as template.

The PCR product at the third reaction was shorter than that at 2nd reaction. The DNA was visualized with ethidium bromide. DNA was amplified by TAIL PCR by using border-specific primers (LB372, LB262, LB172) together with random primers DEG1. M is 1 kb (+) DNA ladder marker.

1 2 3

M M

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Figure 10. T-DNA insertion site inducing drd2-D phenotype is localized in the promoter region of At1g02030.

A, The T-DNA insertion site inducing drd2-D phenotype was determined by the sequencing analysis of the TAIL-PCR product. The underlined sequences are the 5x UAS enhancers. The underlined T letter in boldface indicates the Arabidopsis flancking sequence where T-DNA is inserted. B, 4-day-old seedlings were used for the extraction of total RNA. For the amplification of ZAT1 and EF1 transcripts, 25 cycles of PCR was performed.

A

B

ZAT1

EF1

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3. 5x UAS promoter를 이용한 과대발현 표현형 관찰

ZAT1 유전자의 과대발현이 진정으로 drd2-D 표현형을 유도하는가를 재확인 하기 위해서 ZAT1 유전자를 5x UAS 프로모터에 의해서 조절되는 발현벡터에 클 로닝한 후, 애기장대에 도입하였다. 형질전환된 UASp:ZAT1 애기장대 식물들을 Q2610 enhancer trap line과 교배하여 F1 세대에서 표현형을 관찰하였다. 발아 후 4일이 경과한 Q2610>>ZAT1 식물들의 경우 야생형에 비하여 확연하게 뿌리의 생 장이 억제된 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 drd2-D의 표현형이 ZAT1 유 전자의 과대발현에 의해서 유도되었음을 암시한다. 한편 다른 조직에 특이적으로 발 현되는 enhancer trap 라인들과의 교배를 통해서 ZAT1에 의한 조직 특이적인 생 장억제를 유도하였다. J1721>>ZAT1`의 경우, 발아 초기 때부터 극심하게 생장이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 J1721이 옥신에 반응하는 전사인자를 암호 화하는 MONOPTEROS (MP) 유전자 인접지역에 위치하여 MP와 유사하게 발현되 는 것을 고려할 때(Gagne et al., 2010) 배발생과정에서부터 ZAT1이 높은 수준으 로 발현되어서 발달과 생장이 크게 저해된 결과라고 설명할 수 있다.

J2301>>ZAT1, Q0990>>ZAT1, Q2500>>ZAT1의 유식물의 경우 야생형과 비교하 였을 때, 각각 뿌리가 뒤틀리고 뿌리털의 패턴이 망가진 표현형을 볼 수 있었다 (Figure 11). 이러한 결과들을 종합해 보면 강약에 차이가 있지만 ZAT1이 여러 종 류의 enhancer trap line에 의해서 과대발현되었을 경우에, 야생형에 비해 뿌리의 생장과 발달이 크게 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, J0571>>ZAT1 경우는 유식물에서 뿌리 패턴에 이상이 발생하였지만 상대적으로 뿌리의 생장이 지속되었 다. 지상부에서는 잎의 확장이 억제되었고, silique 주름지고 매우 짧게 발달하였다.

phloroglucinol 염색으로 리그닌 축적을 조사한 결과 J0571>>ZAT1 식물체의 지 상부에서 야생형과 비교하여 강하게 리그닌이 축적되는 것을 관찰할 수 있었다 (Figure 12).

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Figure 11. The ectopic expression of the ZAT1 gene under various enhancers suppresses the growth of transgenic seedlings.

The ectopic expression of zinc finger protein gene by Q2610 enhancer recapitulated drd2-D phenotypes. F1 seedling of UASp:ZAT1 crossed to J0571, J1721, J2301, Q0990, and Q2500.

Seedlings were observed at 4 day-after germination. Scale bars = 0.5 mm

WT Q2610>>ZAT1 J0571>>ZAT1 J1721>>ZAT1 J2301>>ZAT1 Q0990>>ZAT1 Q2500>>ZAT1

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Figure 12. Misexpression of ZAT1 suppresses the growth of above-ground organs.

Transgenic plants misexpressing J0571>>ZAT1 exhibit reduced leaf expansion (A), development of short siliques (B), and increased lignin accumulation (C), as visualized by phloroglucinol staining. Scale bar (left panel) = 1 cm, scale bars = 0.5 mm.

WT

J 0 5 7 1 > > ZA T1 WT

A

C

B J0571>>ZAT1

line #2 line #3

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4. Reporter 유전자를 이용한 ZAT1 유전자 발현양상

ZAT1 유전자의 발현 위치를 조사하기 위해 β-glucuronidase (GUS)를 암호 화하는 GUS 유전자의 발현이 ZAT1의 프로모터에 의해서 조절되는 ZAT1p:GUS 를 제조하여 애기장대에 도입하였다. ZAT1p:GUS는 근단의 외각 세포층, 관다발 세 포층, 성숙과정의 내피세포층, 수공에서 발현되었다(Figure 13A). ZAT1p:GUS의 발현이 ZAT1 또는 근관의 형성에 중요한 역할을 담당하는 SMB에 의해서 조절되 는지를 알아보기 위하여 교배를 통해서 각각 drd2-D (Q2610>>ZAT1)와 drd4-D (Q2610>>SMB) 배경에 도입하여 발현양상을 관찰하였다. 특히, drd4-D의 경우 근관세포의 층이 야생형에 비하여 증가하는 표형형을 나타낸다. ZAT1p:GUS는 두 활성표지 도입 돌연변이 배경하에서도 주로 근관의 최외각 세포층에서만 한정적으 로 발현되었으며(Figure 13B), 이러한 결과는 ZAT1의 발현이 ZAT1이나 SMB의 과대발현에 의해서 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. ZAT1 유전자의 발현양상 을 RT-PCR을 통해서 조사한 결과 다양한 조직과 기관에서 발아 후 5일째 유식물 의 뿌리에서부터 어린 화서의 조직에 이르기까지 발현되고 있음을 확인할 수 있었 다(Figure 13C).

ZAT1 프로모터의 발현위치를 보다 명확하게 파악하기 위해서, green fluorescent protein (GFP)를 암호화하는 GFP 유전자의 발현이 ZAT1의 프로모터 에 의해서 조절되는 전사융합(transcriptional fusion) construct인 ZAT1p:GFP5- ER과 번역융합(translational fusion) construct인 ZAT1p:ZAT1-GFP를 제조하여 애기장대에 도입하였다. 공초점 현미경을 통해서 유식물의 근단을 관찰한 결과, 근 관의 최외각 층에서 특이적으로 GFP5-ER이 발현되었으며, 측면근관에 비교하여 중축근관에서 상대적으로 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. ZAT1-GFP에서 도 근관 최외각 세포층의 핵에서 관찰되었으며, 내피의 성숙과정에서도 발현되는 것 을 확인하였다(Figure 14A). 근관 세포층의 증가가 ZAT1의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해, 근관의 세포층이 증가하는 표현형을 가진 smb-3 돌연변이에서

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ZAT1p:GFP5-ER과 ZAT1p:ZAT1-GFP의 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, smb-3에서 근관의 세포층이 증가하였음에도 불구하고 GFP는 근관의 최외각 세포 에서만 특이적으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 14B). 이러한 결과는 ZAT1 프로모터의 활성이 SMB에 대해서 비의존적이라는 것을 의미한다.

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Figure 13. Tissue-specific expression pattern of ZAT1 in WT and ZAT1/SMB overexpression background visualized by ZAT1p:GUS and expression patterns of ZAT1 transcripts in various tissues.

A, ZAT1p:GUS reporter gene expression was found in the mature root caps, vascularture, endodermis and hydathodes. B, Border cell-specific expression of ZAT1p:GUS expression in drd2-D (Q2610>>ZAT1) and drd4-D (Q2610>>SMB) where the number of root cap layer was increased. 4 day-old seedlings were used to observe the ZAT1p:GUS expression in roots while 2 week-old plants were for the ZAT1 expression in above-ground tissues. Scale bars = 0.05 mm. C, RT-PCR was performed with the cDNA synthesized by using total RNA isolated from various tissues of Col-0 plants such as roots of 5, 7, 9, 11 day-old-seedlings, leaves of 2 and 3-week-old plants and young inflorescence (YI). EF1 was used as a control for 25 cycles of reaction.

A B

drd2-D (Q2610>>ZAT1)

drd4-D (Q2610>>SMB)

WT

ZA T1 p: GUS

ZAT1 EF1

Root Leaf YI

C

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Figure 14. Expression pattern of ZAT1 visualized by ZAT1pro:GFP5-ER and ZAT1pro:ZAT1-GFP in WT and smb-3 background.

A, ZAT1-GFP translational fusion was localized in the nucleus. B, In the sombrero-3 mutant background where the layers of columella root caps are increased, ZAT1 reporter gene expression is still restricted in the outermost cell layer. Arrow heads indicate the quiescent center (QC).

Parentheses indicate layers of columella cells from initials to borders. Arrows indicate endodermis.