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우유 유지방구 유래 lipase 의 활성에 미치는 첨가물의 영향
김거유·권일경·고준수
강원대학교 축산가공학과
Effects of Additives on The Activity of Lipase From Fat Globules in Milk
G.Y. Kim , I. K. Kwon , J.S. Goh Department of Animal Products Science ,
Kangwon National University
ABSTRACT
Kim. G.Y. I. K. Kwon. J.S. Goh. 1996. Effects of additives on the activity of lipase from fat globules in milk. Ann. Anim. Resources S ci. 7 : 66 -71
The effect of bovine serum albumin(BSA). heparin. protamine sulfate. NaCl and apolipoprotein C- II (apo C- II) on the activity of lipase was investigated. using coconut oil and homogenized milk as substrates. Buttermilk was used as an enzyme source. The effects of BSA and heparin on the activity of lipase differed each other depending on the reaction temperature and the used substrates. When homogenized milk was used as substrate. the addition of protamine sulfate increased the activity of lipase at all reaction temperatures. However. the activity of lipase decreased with the addition of protamine sulfate when coconut oil was used as substrate at 3TC. The addition of 1. 3 M NaCl decreased the activity of lipase to the substrates of coconut oil and homogenized milk at all reaction temperatures. The activity of lipase increased with the addition of apo C- II for all substrates and at the given reaction temperatures. When 6.5% BSA was addéd into coconut oil or homogenized milk. activation of lipase by apo C-II depended upon substrate types and reaction temperatures
Key words :Lipase, Activity, Milk fat globules, Buttermilk
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우유 유지방구 유래 lipase의 활성에 미치는 첨가물의 영향
1 . 서 론
우유중에는 지방을 가수분해하여 유리지방산을 생산하기에 충분한 양의 lipase가 함유되어있다.
Lipase는 대부분이 케이신 마이셀과 결합해 있으며 (Anderson , 1982: Downey와 Murphy ,l 970) , 소량의 lipase가 유지 방구에 결합해 있다 (Castberg 등， 1975). 유지 방구에 결합해 있는 lipase는 케 이신 마이셀에 결합해 있는 lipase 와 통일한 것으 로 추정 되 고 있으나 (Castberg등， 1975) , 불분명 한 점이 많다. 신선한 원유를 냉각하게 되면 많은 lipase가 유지방구에 결합하여 지방분해를 일으키 게(자연발생적 지방분해)된다. 자연발생적 지방분 해는 유지방구에 결합해 있는 lipase 또는 냉각에 의하여 유지방구에 결합한 lipase 에 의하여 영향 을 받는다고 할 수 있다. 우유 지방분해의 중요한 원인중 하나인 lipase 에 관한 연구는 주로 탈지유 에 함유되어 있는 lipase의 성질에 관한 연구가 대부분으로， 지방구와 결합해 있는 lipase의 특성 에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 따라서， 자 연발생적 지방분해의 메카니즘을 이해하기 위해서 는 무엇보다도 유지방구에 결합해 있는 lipase의 특성을 이해할 필요가 있다. 따라서， 본 연구는 세척 유지방구로부터 조제한 버터밀크를 효소원으 로하여 각 첨가물이 lipase의 활성에 미치는 영향 에 대하여 검토하였다.
II. 재료 및 방법
1. 버터밀크의 조제
지 방율 30 - 35% 의 크림 3Q 를 500mQ원심 분 리 용 튜브에 250mQ씩 분주한 다음 Sucrose를 첨 가(0 .25 M) 하여 용해시킨 후， 크림과 동량의 0.05M NaCl용액을 크림위에 조용히 첨가하여 4
℃에서 하루밤 정치하였다.
원심분리 (3000 rprn , 4 "C, 30rnin) 에 의하여 크림을 분리한 다음， 크림의 2배량의 인공유청
(Jenness와 Koops , 1962) 에 크림을 분산시켜 원심분리를 다시 실시하였다. 세척크림을 인공유 청에 분산시켜 3Q 로 만든후 교반을 실시하여 버 터입자와 버터밀크로 분리하였다. 버터밀크를 다 시한번 원심분리하여 잔존하는 소량의 지방을 제 거하였다.
2. 기질 및 첨가물의 조제
기질은 야자유와 시판의 균질화유(시유: 유지 방 3.6 ， 살균 140 "C 2초)를 사용하였다. 야자유를 기질로 사용할 경우， 유화안정제로 arabic
gurn(wako社)을 사용하여 金 등(1 992) 의 방법 에 따라 유화하였다. 0.2M NaCl을 함유한 0.16M tris-HCl완충액 (pH 8.5) 에 blood serurn alburnin ( BSA: 半井化學)을 필요한 농 도의 2배로 조제하였다. 동일 완충액에 NaC l, protarnine sulfate , heparin을 각각 4M ,
3rng/mQ , 40 IU가 되도록 용해하였다. 이들 첨가 물 용액을 기질유화액과 동량 혼합하여 기질용액 으로 사용하였다. 대조구에는 첨가물 용액 대신 tris-HCl 완충액 을 첨 가하였다. Apolipoprotein C- II (apo C- II: Cosrno-Bio社)는 Bengtsson 과 o li vecrona (1982) 의 방법을 참고로하여 5M guanidiniurn chloride를 함유한 0.02M tris-HCl 완충액 에 용해 (500μg/mQ) 하였다. 대조 구에는 필요한 농도의 apo C-II 대신 5M guanidiurn chloride를 함유한 동일 완충액 을 동 량 첨가하였다. 유지방을 기질로 사용할 경우는 균질화 우유에 각 첨가물을 야자유 기질과 동일 농도가 되도록 직접 첨가 하였다.
3. 효소 활성의 측정
효소 활성의 측정은 金 등(1 994) 의 방법에 따 라 실시하였다. Lipase 활성의 표시는 각 첨가물 대신 첨가물을 용해한 완충액을 첨가한 활성을 대 조활성 (1 00%) 으로 하였다. 반응온도는 3TC 에서 20분， O.C 에서 60분간 실시하였다.
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1II. 결과 및 고찰
세척지방구로부터 조제한 버터밀크를 lipase의 효소원으로 하여 야자유와 유지방을 기질로 사용 하여 37t 에서 20분간 반응시켰을때， 각 첨가물 의 영향을 대조구에 대한 비율로써 table 1 에 나 타내었다. BSA첨가에 의하여 야자유를 기질로 사 용하였을 때는 대조구에 비하여 활성이 저하하였 으며， 기질이 유지방일 경우에는 활성이 증가하였 다. Heparin의 첨가에 의해서는 야자유의 경우 활성의 큰 변화는 나타나지 않았으나， 유지방을 기 질로 사용하였을 경우 활성이 증가하였다.
Protamine sulfate첨 가에 의 해서 는 야자유의 경 우 대조구보다 활성이 저하하였으나. 유지방을 기 질로 사용하였을 경우에는 활성이 증가하였다.
1.3M의 NaCl 첨가에 의해서는 야자유， 유지방 모두 활성이 저하하였다.
반응온도 ot 에서 1 시간 반응시켰을 때， 각 첨 가물의 영향을 table 2에 나타내었다. 반응온도 37
0C 의 경우와는 반대로 BSA첨가에 의하여 야자 유의 경우에는 활성이 증가하였으며， 유지방에서 는 활성이 저하하였다. Heparin의 첨가는 야자유 를 기질로 사용하였을 경우 활성이 증가하였으나，
유지방의 경우에는 큰 활성의 변화는 나타나지 않 았다. protamine sulfate의 첨가는 야자유， 유지 방에서 모두 활성을 증가시켰다. NaCl의 첨가에 의해서는 사용한 두가지 기질 모두에서 활성이 저 하하였다. Lipase는 지방을 지방산， diglyceride ,
monoglyceride로 분해 한다. Lipase 에 의 하여 유 리된 지방산은 기질의 지방입자의 표면에 남아있 어 lipase의 기질에 대한 접근을 방해한다 (Bengtsson과 Olivecrona , 1979). 따라서 , BSA 같은 지방산 수용체가 효소작용을 위하여 필 요하게 된다 (Bengtsson과 Olivecrona , 1980).
본 실험에서와 같이 효소원으로서 버터밀크를 사 용하였을 경우， BSA첨가에 의한 영향은 기질과 반응옹도에 따라 차이가 있었다. 실험에 사용한 버터밀크에는 버터밀크의 조제과정중에 생성된 유 리상태의 지방산이 어느정도 함유되어 있다. 따라 서 , 본 실험의 결과에서와 같이 사용한 기질과 반 응온도에 따라 상이한 결과가 나타난것은 유리상 태의 지방산 함양과 첨가한 BSA농도와의 균형，
또는 반응온도에 따른 기질의 물리화학적 변화의 차이가 원인으로 생각할 수 있다. Lipase활성에 대 한 heparin의 영향에 관해서는 연구자들 사이에 견해가 상이하다. Heparin은 lipase활성을 증가 시키거나 (Fielding과 Higgins , 1974) , 혹은 활 성을 저해 (Miller와 Smith , 1973) 한다고 한다.
한편， heparin은 lipase활성에 거의 영향을 미치지 않는다고 하는 보고도 있다 (Fielding등， 1977).
Table 1과 Table 2의 결과에서와 같이 heparin
의 영향은 반응온도와 기질에 따라 상이하였다.
이 러 한 결과로 부터 heparin은 lipase활성 부위 에 대한 영향보다도 기질에 대하여 크게 영향을 미친 다고 생각된다. 따라서， lipase의 활성에 미치는 heparin의 영향이 연구자간에 일치하지 않는것은
Table 1. The effect of additives on the lipase activity at 3TC for 20 minute.
BSA Heparin Protamine sulfate NaCl
Substrate
(2%) (1 3IU) (0.098%) (1 .3M)
Coconut oil 81 105 86 17
Milk fat 146 125 135 17
• Lipase activity of control was taken as 100%
• BSA: blood serum albumin.
• Parentheses indicate the concentration of additives in reaction mixture
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우유 유지방구 유래 1ipase의 활성에 미치는 첨가물의 영향
각 연구자가 사용하는 기질의 차이가 원인으로 생 각된다.
Protamine sulfate는 lipase의 활성저해제로 알려져 있다 (Korn. 1955a). 그러나， 본 실험에서 는 protamine sulfate 에 의한 활성저해효과는 반 응온도 3TC 야자유의 경우에만 나타났다 (Table 1).
이 와같이 protamine sulfate가 lipase 활성 에 미 치는 영향은 반응온도와 기질에 따라 차이가 나타 났으므로 protamine sulfate를 lipase 활성 저 해 제로 분류하는것은 좀더 검토가 필요하다고 사료 된다.
고농도의 NaCl 에 의한 활성저해는 우유 유래 lipase의 특징중 하나이다. 본 실험에서도 반응온 도， 기질에 관계없이 1. 3M NaCl의 첨가는 lipase 활성을 저해하였다. 그러나. Riley와 Robinson
(1 974) 은 lipase 활성에 대한 NaCl의 영향은 측 정방법， 효소의 순도 및 기원등에 따라 매우 차이 가 있다고 하였다.
우유 lipase의 활성화 인자로 알려져 있는 apo C-II 가 lipase의 활성에 미치는 영향을 table 3 에 나타내었다. Apo C- II 첨가는 반응온도 및 기 질에 관계없이 lipase의 활성을 증가시켰다. 그러 나 apo C- II 와 BSA를 함께 첨가 하였을 경우，
apo C- II 에 의한 활성화 효과는 기질 및 반응온 도에 따라 차이가 나타났다. Apo C-II 에 의한 lipase의 활성화 메카니즘에 대한 일치된 연구 결 과는 없다. 그러나， 정상유에 혈청을 첨가하면 지 방분해가 일어나며， 혈청에 의한 효소활성화 효과
는 혈청에 함유되어 있는 단백질 성분인 apo C- H 에 의한 것으로 알려져 있다 (Bengtsson과 Olivecrona. 1979). BSA와 같은 지방산 수용체 를 apo C- II 와 함께 첨가하였을 경우， 반응옹도 3TC 에서 야자유를 기질로 사용하였을 경우에는 활성의 증가가 apo C- II 단독 첨가때 보다 낮았 다. 이와같은 결과는 유지방을 기질로하여 반응온 도 OOC 의 경우에도 같은 결과가 나타났다. 이와같 이 BSA첨가에 따라 활성화 인자인 apo C- II 가 lipase 활성에 미치는 영향이 기질과 반응온도에 따라 상이한 것은 반응옹도에 따른 기질의 물리화 학적 변화와 함께 효소반응 생성물인 유리지방산 의 양과 첨 가한 BSA농도와의 균형 에 따라 차이 가 나타난 것으로 생각된다. 또한， 균질화한 시유의 유지방을 기질로 사용하였을 경우는 유지방 이외 에도 케이신 및 유청단백질 등이 공존해 있다. 따 라서 이러한 유성분들이 지방산 수용체로서의 역 할을 일부 담당하여(若演 와 齊購. 1989) BSA첨 가에 의한 활성의 큰 변화가 없거나， 반대로 활성 증가율이 감소하는 결과를 나타낸것으로 생각할 수 있다.
효소반응의 결과 생성된 유리지방산 양보다 첨 가한 BSA의 농도가 높을 경우， 과잉의 BSA는 유지 방구 표면을 피복하여 (Posner와 Morrison.
1979) 지방분해효소의 기질에 대한 접근을 방해
하여 활성을 저하시킨다고 할 수 있다.
본 실험에서 각종 첨가물이 lipase활성에 미치 는 영향은 사용하는 기질， 반응온도에 따라 차이
Table 2. The effect of additives on the lipase activity at QOC for 1 hour.
BSA Heparin Protamine sulfate NaCl
Substrate
(2%) (13IU) (0 .098%) (1 .3M)
Coconut oil 179 134 128 14
Milk fat 54 93 217 4
• Li pase activity of control was taken as 100%
• BSA: blood serum albumin.
• Parentheses indicate the concentration of additives in reaction mixture
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Table 3. The effect of additives on the lipase activity.
Apo C- II apo C- II + BSA
Substrate Treatment
(0.033%) (0.033%) (6.5%)
37
0C 20min 190 114
Coconut oil
ooC 60min 155 142
37t 20min 158 168
Milk fat
ot 60min 467 135
ι-
