방법의 검토

J‘

y

대한입상병리사회지 : 제 10권 제 l 호 1978

혈 청 중

측정 을 위 한 간단，

신속한

방법의 검토

(The Study of Simple, Rapid, Kinetic method for serum creatinine determination)

중앙대학교 의과대학 부속 성섬병원 임상병리과 박 일 진·서 덕 규

1 . 서 론

Creatinine 은 Creatine의 분해 산물(무수물)로서 근육 내에서 쉽게 혈액중으로 이행하여 뇨중으로 배설된다.

Creatinine의 뇨중배 설 량은 같은 사람이 라면 거 의 매 일 매일 배셜량이 일정하고 단백질 섭취량에 영향받지 않 는다. 또한 Creatinine의 배 셜 은 신사구체 에 서 만 이 루 어 지 며 재 흡수를 하지 않음으로 Creatinine이 혈 액 중에 침체되는 일은 신사구체의 병변을 나타내는 지표가 된 다. 그러므로 이러한 칠환의 진단 예후 경과의 판단에 자주 이용되고 있는 점은 우리가 다 아는 사실이다.

더우기 근래에는 인공신장실에서의 검사가 시시각각 있어서 자주 실시되는 검사종목이 되었다.

Creatinine의 측정 법 으로서 는 basic picrate reaction (Jaffe반응) 이 이 용되 어 왔는데 이 Jaffe반응을 시 키 는 데에도 수많은 변볍 1-16) 이 창안되어 여러종류의 변법 이 이용되어 왔다.

이 picrate reaction 을 시 키 는데 있 어 서 단벡 이 반응 에 관여 한다 하여 제 단백 후에 Jaffe반응을 시 키 므로서 이 문제를 해결하여 왔으나 제단백액으로 반응을 시킨 다 하여도 그 특성에 관해서는 전적으로 공연되기에 는 미홉한 점이 있었고 또한 단백을 제거하는 문제에 관해서도 문제가 없었던것 만은 아닌 것 같다.

Picrate 반응의 mechanism에 관해 서 는 아직 미 해 결 된 점 이 있 지 만 Carbonyl group의 에 놀화는 이 반웅에 필요한 것으로 보고 있다. 그러므로 혈액중 및 뇨중에

존재 하는 Creatinine 이 외 의 물질 이 반응하며 특히 Ke tone Substances도 이 반응에 작용한다. 단백 은 이

picrate 반웅에 참여 하며 혼탁과 혈 청 자체 의 색 이 관여 함으로 picrate reaction을 둔화시 키 는 요인 이 되 어 왔 다.

그러 므로 non-creatinine chromogen을 제 거 하기 위 해 Lloyd’s 시 약이 사용되 어 좀더 정 확한 방볍 이 라고 생 각되긴 했어도 조작이 번거롭고 그렇게 정확하지도 못 하다고 평가되었었다.

이 와같은 non-creatinine chromogens는 대 개 Creatinine

보다 picra te reaction이 늦게 일 어 나며 pure- crea tinine

이 20.-30분에 최고치에 달하는데 비해 전거의 블질은 그 후에도 말색이 얼어난다고 볼 수 있어 reaction- Kinetic measurement로 발색과정중 초기에 일야나는 부분의 말색을 측정에 이용하면 장시간에 걸쳐 일어냐 는 발색측정법보다 좀더 나은 측정법이 될 수 있는 가 능성 을 Böhmer^l2)와 COOk^I3) 가 발표했 다.

반응원리로서 혈청중에는 pure crea tinine보다 훨싼 일 찍 반응하는 J affe-positive compounds (예 를들면 ac eto acetate) 와 또한 늦게 반응하는 물질들을 분밸 측 정하는 원리이다.

이 방법 은 정 확한 spectrophotometer만 사용하면 1/

2 ，...， 2분만에 매 우 신속하고 제 단백 없 이 직 접 picrate 반웅을 시키며 복잡한 조작과정을 줄이므로서 정확성 과 튜이성이 있는 좋은 빙-법￡로 생각되며， 또한 Crea tinine 측정 이 정 도관리 상 이 상적 인 허 용오차가 C.v - 2 3 -

12% 란 점도 측정법장의 관섬의 대상이 된다고 사료되 어 컴토의 대상으로 하여 보았다.

J[ • 검사재료 및 방법

1978년 2월에서 3월까지 성심 병원에 내원한 환자중 무작위적으로 택한 공복환자 혈청 41예에 대한 혈청을 분리하여 시험에 사용하였다(연령 16세 --61세) 측정방 법 으로는 Folin-Wu의 방볍 과 Butler， A.R의 W orthington

변법을 택하였다.

A. Butler의 W orthington 변 법 17)

1) 사용기구

CD Perkin-Elmer의 Oigital Spectrophotometer Cole- mann 55형 을 사용했 으며 이 기 계 는 0.0. 0.001 이 측정가능한 것이다.

(2) 20⁰C 및 37⁰C를 유지 할 수 있 는 Heating bath 또 는 Block.

2) 시약

CD Sodium hydroxide 348mMol/L 용액

(2) Picric acid-Buffered 용액

Picric acid 49. 0 mMol/L Sodium Carbonate 67.0 mMol/L Sodium Bicarbonate 7.3 mMoljL

@ Alkaline-picrate 정-액

1) 액과 2) 액을 동량섞어 실온 갈색명에 보관하 면 l 주간 사용할 수 았다.

(Alkaline-picra te 용액 의 515nm에 서 의 흡광도는 증류수를 맹 검 으로 하여 0.133-0.148의 범 위 내 의 시약이었으며 0.320 이상이 되는 것은 폐기되어야 한다)

@ Creatinine standard solution, lmg/lml creatinine.

1. Omg/100ml, 2.0mg/l00ml, 4.0mg/l00ml, 6.0mg /100ml, 8.0 mg/l00ml, 100mg/l00ml, 12. Omg/l00ml

농도로 희석사용하였다.

3) 측정방법

CD 4.0ml의 Alkaline-picra te 용액 을 10mm Cuvette

에 넣고 미리 37⁰C 에 가온한다.

(2) 0 time에 검체혈청 0.2ml를 넣고 37⁰C를 유지시 킨다.

@ 20초 후에 515nm에 서 의 0.0. 를 읽 는다 (A20⁾ 이어 80초에서의 0.0. 를읽는다 (Aso)

@ 흡광도 변화를 계 산한다.

4 二 Aso^-A20

@ Creatinine의 각종농도의 Standard Solution 에 대 해서도 L1A를 구한다.

용치 않는 경우)

4A，겸체 XStandard mg/l00ml

L1A, 표준 =mg/l00ml검 체 (J) Quality control을 위 하여 control serum 에 관해

서도 질시한다.

@ 12mg/l00ml 이상되는 컴체에 대해서는 희석후

실시하고 결과에 희석배수를 곱한다.

<ID Standard calibration curve를 그려 사용해 도 좋

다.

B. Folin-Wu 볍 ¹⁾

01 방법에 있어서는 홉광도 측정에 있어서 Bausch

& Lomb 회 사의 Spectronic 20을 사용하여 측정 하였 다.

방법…생략

m. 결 과

총41 예 의 공복시 혈 청 에 대 한 Folin-Wu법 과 Butler

의 Worthinton 변법 의 성 적 은 Table 1 과 같다.

즉， Folin-Wu 법 의 성 적 과 Butlerl Worthinton변 법과의 차이는 낮은 농도에서는 차이가 있어도 높은농 도에서의 성적은 거의 비슷하여 별차이가 없었다.

두방법간의 회기직션은 Kinetic 방법은 Y 로하고 Fo lin-Wu 방법을 X 로하였을때의 식은 Y= I. 085X-0.174 이였고 상관계수 r=0.966였다 (Fig 2).

표준농도의 Creatinine에 대 한 37⁰C 및 20⁰C에 서 의 L1A=A80^-A20의 흡광도는 Fig.1 과 같다. 즉각종농도 에 서 의 흡광도는 거 의 일 직 선 이 어 서 Creatinine conc-

entration과 L1A/min의 0.0. relationship은 12mg/l00ml 까지 일직선이었다.

Folin-Wu 법 에 서 는 Alkaline-picrate reagent의 안전 성이 불량하였으나 Butler의 Worthinton 변법에서의

Alkaline-picrate reagent는 안정 성 이 있 어 서 실 온에 서 1 주간 보관하여도 맹검시약의 흡광도는 약간씩 장승하 여도 측정치에는 아무런 변화를 일으키지 않았다.

Basic alkaline-picrate reaction에 서 는 Aceto-aceta te

가 Creatinine 보다 일찍 반응하여 발색 되 므로 creat-

inine의 각종농도 검체에 대한 o ^{sec. 에서} 20 sec. 까지 의 흡광도 변화와 A20에서 Aso까지의 흡광도 변화에 대한 도표는 Table 2. 와 같다.

Table 3는 non creatinine chromogen과 creatinine

농도와 L1A=Aso^-A20^{(1 분치} ) 및 L1A=AI800 - Aso (30, 분치)， L1A=A3600^-Aso(60분치)의 도표이다.

Iv. 고 찰

@ 겨1 산은 다음식 에 서 구한다 (Calibration curve를 사 1) Worthinton 변 볍 에 서 는 Technicon Auto Analyzer - 2 4 -

J

、1

법 (X) 과 본법 인 Kinetic 방법과의 관계에 있어서 7=0.999, n=43 Y =0. 988X -0.001의 장관 관계 가

있 다고8) 말하고 았 다.

필자들은 Kinetic법 과 Folin-Wu 법 간에 있 어 서 n=

41, 7=0.966, Y=1. 085X-0.174의 관계를 보여 전 자의 성적에는 뒤지나 이것은 Folin-Wu법의 신임도 가 문제시 되지않나 생각이된다. 그러나 상당히 좋 은 상관관계를 보였다.

A

흔히 crea tinine의 발잭 은 짙 지 가 못하여 비 색 상의 오차가큰 Spectronic 20 과 Digital spectrophotomete 간

의 Reading 요차는 낮은 농도일수록 커진다고 사료

된다. 그러묘로 낮은 농도에서의 두방법사이의 차이 는 더욕 커진다고 볼 수 있다.

2) 우리는 흔히 사용되는 기계중에 일정온도를- 유지시 킬 수 있 는 기 구로써 Water bath나 heating block 이 있어서 37⁰C가 가장 많이 사용되는줄 안다. 근래의 최신기체 들은 rate analyzer에 싣온， 25⁰C, 30^oC, 32⁰C 37⁰C의 각종온도가 조절되도록 장치되어 있어 서 펀리하나， 현제의 우리섣정으로서는 실온과_ 37⁰C

가 가장 펀리하다.

그러 므로 필자도 37⁰C와 20⁰C로 섣시 하여 보았다.

20⁰C 란 우려나라의 실온에 가까운 온도이긴 하나 사 계철에 따라 많은 질온변화릎 일으키므로 불펀한 온 도이며 37⁰C는 우리 주위에서 가장 쉽게 접하는 온 도여 서 37⁰C가 적 당하며 또한 Fig_1 에 서 와 같이 20 。 C보다는 37⁰C의 .dA 가 좋았고 또한 Beer의 법 칙에 잘 적응이 되었다.

4) 신 속 basic picra te reaction 은 특펠 히 aceto acetate

에 작용한다고 한다. Table2에 서 보이 는 바와 같이

Crea tinÍne Concen tra tion 과 .dA=A20^{-A。 간에 는 비} 례관계가 정확히 성립되진 않았으냐 (Case ， 5) 어느 정도 비례관계가 있는 것으로 보아 0~20초 내에도

pure creatinine의 말색 이 진행중인 것으로 풀이된다 고 보겠 다. 그러 므로 aceto acetate 물질 이 일 찍 반응

。l 끌난후에 rate reaction 을 측정 하므로서 pure cre-

atinine의 농도를 만족스럽 게 비 색 할 수 있 는 환경 이

、t

된다고 해석한다.

5) Table 3 는 lower basic picrate reaction 을 보이 는 것으로서 Crea tinine concen tra tion과 O.D. 와는 전연 상관관체가 없는 것으로 나타났다. 즉， non creati- nine chromogen 이 나 basíc picra te reaction에 관여 하는 protein 이 라고 인정 된다.

6) 정 도관리 상 crea tinine의 변 동계 수 (C.V.) 는 그다지 좋지않은 측정법이 많은 것으로 되어 있다. 이정을 고려 하여 우리 는 Butler의 W crthington 변법 을 사용

하여 이점에 대한 반복측정상의 변동계수를 구하였 드니 4.55%의 변동계수를 얻어 비교적 양호한 성적 을 얻었다.

V. 결 론

Crea tinine 측정 법 의 근래 의 지 견 을 검 토하여 rate Kinetic method가 Folin-Wu법 에 비 킬 만한 또한 좀더 개척된 이론에 합당한 방법이라고 생각되며 단시간내 에 blank가 따로 필요치 않은 측정법이며 응급시 또는 사구체질환 환자와 신장투석환자의 성적관리에 합당한 방법이라 여겨진다.

Table 1. Comparison of Kinetic method and Folin- Wu method.

1^,-, 1. IKinetic method' Folin-Wu method No. I _| Sex I _| Age I I mg/d1 ! mg/dl

1. 1 F 1 4이 0.91 1. 3

2. 1 F 46i o. 61 1. 1

M M M F M M M F F M M M M F F M M F M M F M M F M F M F M F 3 4 5 6 7 8 9

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1.0 0.9 0.9 1.1 0.9 0.5 0.6 0.8 0.8 1.0 0.8 1.6 0.4 10.9 0.6 2.6 14.6 14.4 3.6 4.3 10.2 5.7 9.6 2.4 15.4 8. 7 10.1 4.3 13.8 9.6

5 5 3 5 3 0 3 2 6 6 8 6 8 2 0 5 2 6 3 4 5 7 0 5 0 4 6 7 7 6

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8 1 8 2 4 3 4 3 4 1 5 2 4 4 5 3

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디μ

'J1c

(o.p.l 220 .210

190 200

180 170

33. M 32 7.6 5.6

34. M 38 10.8 11. 2

35. M 61 16.8 16.8

36. F 32 3.4 3.8

37. M 32 9.4 9.0

38. F 22 3.4 3.5

39. M 61 14.4 14.4

40. M 52 14.4 14.6

41. M 61 20.4 20.8 ¹⁶⁰

20'’C

150

J

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펙

때 l

jl0 I 어}

5. 875:t5. 611

Table 2. The relationship between Creatinine conce- ntration, L1_{A=A20 -Ao}(rapid reaction, probab1y due to aceto acetate sub.) and L1A=Aso-A20 (1-2 min.

reaction, probably due to creatinine)

No jconc

Creat퍼i짧I

12mg%" (conc’ ^」

Figure 1. Effect of temperawre on the change in absorbance per minute.

mg/òl!

22

10

n二 41

r= 1,043 y= 1,0S5x - 0,174 090

060

:::Jf

UKIJ OíO

050

040

1. 2.4mg/100ml. 0.071 0.042

2. 2.6mg/100ml. 0.047 0.045

3. 3.6mg/100ml. 0.069 0.064

4. 4.3mg/100ml. 0.081 0.076

5. 4.3mg/100ml. 0.306 0.076

6. 5.7mg/100ml. 0.094 0.102

7. 7.6mg/100ml. 0.135 0.135

8. 8.7mg/100ml. 0.170 0.155

9. 9.6mg/100ml. 0.167 0.171

10. 9.6mg/100ml. 0.173 0.172

11. 10.lmg/100ml. 0.169 0.182

12. 10.2mg/100ml 0.191 0.183

13. 13. 8mg/100ml. 0.239 0.244

14. 14.4mg/100ml. 0.226 0.257

15. 14.6mg/100ml. 0.257 0.260

16. 15.4mg/100ml. 0.239 0.275

. 、*

. ÷

20

12

10 18

16 {〕gZω응 ν;ι:「ζ

22 mg/dl

Figure 2. Comparison of Kinetic method and Fo1in- Wu method for creatinine.

- 2 6 -

18 20 6 8 10 12 14 16

Folin.Wu Method mg/dl

4

v

Ref: 9) Folin, 0., and Wu, H.:A system of blood analysis^,

1) Folin,O., and Wu, H.: J. Boil. Chem.‘38:81, 191 J. Biol. Chem. 38:81, 1919.

9. 10) Henry, R. J.: Clincal chemistry; principles and

2) Folin,O., and Doisy, E. A.: Biol, Chem. 28:349, technics, New York,: 1964, Harper & Row, Publish

1916. ers.

3) Benedict, F. R.: J. Boil. Chem. 82: 1, 1929. 11) Clin. Chim. Acta, 41 (1972) 209-217.

4) Peters, J. H.: J. Biol. Chem. 146: 179^, 1942. 12) H. Bartels and M. Böhmer^, ClinChem, Acta, 32 5) Creatinine methodlogu notes, methodologu notes, (1972) 81.13)

N-llb, Tarrytown, N. Y., Technicon Corp. J. G. H. Cook, Clin. Chem. Acta 32⁽¹971)485.

6) Chasson, A. L., Grady, H. ]., and Stanley, M. 14) Ellis, G., and Goldberg, D. M.: Clin. Biochem.

A.: Amer. J. Clin. Path. 35: 83, 1961. 4: 175, 1971.

7) Folin, 0.: on the determination of creatinine and 15) Nachlas, M. M., Davidson, M. B., Goldberg, ].

creatine in urine, J. Boil. Chem. 17: 469, 1914. D., and Seligman, A. M.: J. Lab. Clin. Med. 62: 1 8) Folin, 0., and Deisy, E. A.: Impure picric Acid 48, 1963.

as a source of erron in creatine and creatinine 16) Jung, K.: Clin. Chim. Abta36:231, 1972.

determinations, J. Biol. Chem. 28:349, 1917. 17) Worthinton creatinine reggent Bulletin (1976)

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