Size Distribution of Silica Dioxide Nanoparticles after Calibrated Sonication and Cytotoxicity in Cultured A549 Cells

DOI 10.17480/psk.2017.61.6.309

실리카 나노입자의 분산조건에 따른 입도분포 변화 및 A549 세포독성

이한들¹⁾ · 박주영¹⁾ · 박광식^# 동덕여자대학교 약학대학

(Received November 15, 2017; Revised December 15, 2017; Accepted December 20, 2017)

Size Distribution of Silica Dioxide Nanoparticles after Calibrated Sonication and Cytotoxicity in Cultured A549 Cells

Handule Lee, Juyoung Park, and Kwangsik Park^# College of Pharmacy, Dongduk Women’s University, Soeul 02748, Korea

Abstract — Size and/or size distribution is a very important factor in the cellular toxicity test of nanoparticles. Therefore, it is necessary to fulfill the requirement of standardized dispersion protocol when toxicity potencies of different types of nanoparticles are compared. In this study, different conditions including ethanol pre-wetting, concentration of bovine serum albumin in media, and measurement instruments were investigated to see the impact on the dispersity of silica nanopar- ticles after calibrated sonication. As results, the concentration of bovine serum albumin seemed to mostly influence the dis- persion of silica nanoparticles. No significant difference was shown in cytotoxicity of cultured A549 cells among silica (SiO₂), zinc (ZnO), silver (Ag), ceria (CeO₂) and titanium (TiO₂) nanoparticles when they were dispersed by same amount of energy after calibrated sonication.

Keywords nanoparticles, size distribution, sonication, cytotoxicity

서 론 (Introduction)

나노산업의 발전에 따라 나노입자의 사용은 급속도로 확장되 고 있다. 나노산업에 응용되는 주요 소재는 탄소나노튜브, 세라 믹, 덴드리머, 풀러렌, 금속, 나노와이어, 양자점 등 매우 다양하 다. 이들은 진단, 디스플레이, 약물전달시스템, 태양전지, 나노센 서, 환경촉매 및 나노의약품 등 다양한 용도로 사용되고 있으며 나노입자의 사용이 증가함에 따라 환경 및 인체에 미치는 위해 성도 증가하고 있다.^1,2)최근에는 단기간 노출에 의한 급성독성 뿐만 아니라, 저농도 장기간 노출에 따른 만성독성, 생식발생독 성 및 발암성 연구가 광범위하게 진행되고 있다.^3,4)

한편, 나노입자는 화학물질과 달리 동일 성분(원소)으로 제조 한 경우라도 입자의 크기, 전하, 표면화학 등에 따라 그 독성이 크게 달라질 수 있다. 이는 나노입자의 입경이 작아질수록 표면 적은 증가하며 따라서 생체물질과의 반응성이 증가하기 때문이 다.^5,6)또한 나노입자에 다양한 물질을 부착시켜 표면화학을 변화 시킨 경우에도 독성은 크게 변할 수 있다는 것이 확인되었다.^7,8) 그러나 이러한 가능성에도 불구하고 아직까지 나노입자의 분산이 나 표면화학을 고려하지 않고 독성시험을 수행하는 경우가 많다.

이러한 이유 때문에 OECD 등 국제기구에서는 나노입자의 정확 한 독성평가를 위한 새로운 시험지침을 제정 중에 있으며 아울 러 유럽연합에서는 나노렉 (NANoREG) 프로그램을 운영함으로 써 나노분산의 표준화와 독성의 상관성을 규명하고자 노력 중에 있다.^9,10)

본 연구에서는 유럽연합의 나노렉 프로그램이 종료됨에 따라, 그간 나노렉에서 제시된 분산 표준화 기법을 재검토하고 분산조 건의 표준화가 궁극적으로 미치게 되는 독성시험의 영향에 대해 검토하고자 하였다. 이를 위해 소니케이터의 출력에너지를 일정 하게 고정시킨 후 나노렉에서 제시된 바 있는 에탄올 전처리

Short Report

#

Corresponding Author Kwangsik Park

College of Pharmacy, Dongduk Women’s University, Soeul 02748, Korea

Tel.: 02-940-4522 Fax.: 02-940-4195 E-mail: [email protected]

1)

이한들, 박주영은 공동 1저자로서 본 논문에 동일하에 기여하였음

제45대 대한약학회 회장 전인구교수님

(동덕여자대학교 약학대학)의 정년퇴임을 축하드립니다.

(ethanol pre-wetting), 혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 의 농도, 분산용매의 필터 여부, 측정기기 기종의 차이 등 여러 개 별인자가 실제 나노입자의 분산 데이터에 얼마나 기여하는지를 규명하고자 하였다. 이러한 시도는 나노입자의 독성시험을 수행 하는 여러 연구실에서 독성시험용 나노물질을 분산처리 할 때 참 고할 수 있는 유익한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

실험 방법 (Experimental Methods)

실리카 나노입자

시험에 사용한 실리카(SiO₂) 나노입자는 유럽연합에서 설립한 JRC-IHCP(Joint Research Center-Institute for Health and Consumer Protection) 또는 Fraunder사로부터 제공받았다. 그 가운데 실리카 나노물질(NM200)은 갈색병에 봉입된 건조분말상 태로 제공받았으며 제조 당시의 평균입경은 18.3 nm로 공시되었 다. 시료를 입수하였을 당시는 제조당시의 평균입경이 유지되기 보다는 그 이상 크기의 응집체로 존재하고 있는 것으로 추정되 었다. 독성시험에 사용된 은(Ag), 아연(ZnO), 티타늄(TiO₂), 세리 아(CeO₂) 나노물질도 동일한 경로를 통해 입수되었다.

소니케이터 캘리브레이션

소니케이터 캘리브레이션은 나노렉에서 제시한 방법에 준하여 시험하였다.^10,11,12)간단히 설명하면, 비커에 탈이온수 500 mL를 채운 후 소니케이터 프로브를 수면 아래 2.5 cm 깊이에 위치시 키고 총 8분 30 초간(510 초간) 소니케이터를 작동하였다. 이때 사용한 소니케이터는 500 W의 파워, 최대 주파수 20 kHz인 Vibra-Cell^®(Model VC 505, Sonics&Materials, CT, USA) 제품 을 사용하였으며 사용한 프로브의 직경은 13 mm(Model CV334) 이었다. 서로 다른 크기의 출력으로 소니케이터를 작동시키면서 30초 간격으로 500 mL 탈이온수내에서의 온도변화를 기록하였 다. 이때 온도 측정의 일관성을 위해 온도측정계는 프로브 하단 의 중앙점으로부터 1 cm의 거리에 위치하도록 세팅하였다. 초음 파 진폭(amplitude)은 사용된 소니케이터 최대 출력의 20%, 25%, 30%, 35%, 40%로 5개로 구분하여 조정하였다. 탈이온수의 온 도(절대온도 K) 상승 값을 초음파 시간으로 나눈 기울기 값을 바 탕으로 아래의 식에 따라 각각의 진폭별로 Pac 값을 산출하였다.

초음파 에너지 7,056 J을 공급하기 위한 초음파 시간(단위: 분)은 7,056 J 값을 산출된 Pac 값으로 나누어 구하였다.

나노입자 현탁액의 제조

고체형의 응집된 나노입자를 in vitro 시험계에 노출시키기 위 해서는 적절한 분산과정이 필요하다. 이때 분산도는 사용하는 시 험용 배지의 특성에 따라 달라질 수 있으며 아울러 동일한 시험 용 배지라 할지라도 나노입자의 분산과정 및 조건에 따라 현저 히 달라질 수 있다. 나노렉 프로그램에서 채택된 분산 프로토콜 은 목적에 따라 크게 두 방법이 존재한다.^11,12)두 방법을 비교해 보면 고체형 나노입자가 친수성이 아닌 경우에는 물보다 소수성 이 큰 에탄올을 사전에 처리하기도 하는데 이때 에탄올 전처리 여부가 서로 다르다. 또한 분산용매 중에 BSA의 농도, 그리고 고체형 나노입자의 소니케이션 용매인 BSA용액의 막여과(0.2 μm) 유무 등이 크게 다르다. 따라서, 본 시험에서는 두 방법의 서로 다른 조건에 따라 나노입자의 분산도가 얼마나 영향을 받는지 비 교하고자 하였다.

에탄올 pre-wetting 여부에 따른 입자 분산도의 차이점을 파 악하기 위해 미리 실리카 나노입자 15.36 mg을 재어 넣은 20 mL 부피의 바이알(20 mL Scint-BμLk galss pp-lock+Alu-foil, WHEA986581, Wheaton Industries Inc.)에 30 μL의 에탄올을 첨 가하여 고체입자를 적신 경우(pre-wetting) 경우와 그렇지 않은 경우로 구분하였다. 에탄올을 첨가한 시료의 경우에는 에탄올이 입자에 충분히 묻도록 손가락 끝으로 툭툭 쳐준 후 970 μL의 BSA함유 분산 용매를 넣고 1분 정도 흔들어 주었다. 에탄올을 사전에 처리하지 않은 시료는 처음부터 1 mL의 BSA함유 분산 용매를 넣고 살짝 흔들어 주었다. 그 후 두 시료에 대해 5 mL의 BSA함유 분산 용매를 추가로 첨가하고 잘 섞어준 후 농도 2.56 mg/mL가 되도록 제조하였다. 총 6 mL의 실리카 현탁액에 대해 초음파를 실시하고 입도분산을 측정하였다.

현탁용매의 BSA농도에 따른 입자 분산도의 차이점을 파악하 기 위해, 100 mL의 탈이온수에 BSA(A9418, SIGMA-ALDRICH, St Louis, MO, USA) 2 g을 넣고 녹인 후 냉장고에서 하룻밤 동 안 방치하였다. 이렇게 제조한 2% BSA 용액을 0.2 μm 필터 (25AS020AS, ADVANTEC^®)를 이용하여 걸러낸 것과 걸러내지 않은 두 종류의 용액을 만들었다. 이 후 필요에 따라 BSA 최종 농도를 1% 또는 0.05% 농도가 되도록 탈이온수로 희석한 후 이 용액을 실리카 나노입자의 현탁액의 용매로 사용하였으며 이때 현탁액 중 실리카 나노입자의 농도는 2.56 mg/mL가 되도록 하 였다.

측정기기 기종별 입도분포 측정

나노입자의 입경크기 및 분산도는 일반적으로 Dynamic Light Scattering(동적빛산란, DLS)방법으로 측정하는데 본 시험에서는 측정기기의 기종에 따라 결과 값의 차이가 존재할 가능성에 대 해 검토하였다. 측정에 사용된 기기는 Zetaplus(Brookhaven Instruments Corporation, NY, USA)와 ELS-Z(Otsuka Electronics, Pac(Watt) = (ΔT/Δt) × MCp

[ΔT/Δt; 시간대비 온도상승의 기울기 값, T; 절대온도 K값, t; 시간단위

초, M: 물 500 mL 중량 값, Cp; 액체의 비열 (물의 경우 4.18 J /g*K)]

Osaka, Japan) 두 모델을 사용하였다. 측정을 위해 위에서 제도한 실리카 나노입자 2.56 mg/mL 현탁액에 대해 소니케이션을 실시 하였으며 초음파분쇄 과정 중 발생되는 열을 제거하기 위해 시 료를 함유한 바이알을 85~90%가 얼음으로 된 얼음물에 잠기도 록 세팅한 상태로 실시하였다. 소니케이션은 캘리브레이션 후 확 인된 시간과 진폭을 적절히 선택하여 수행하였다. 초음파분쇄를 실시하고 5분간 실온에 방치한 후 25^oC를 기준으로 DLS 측정 을 실시하였다. 나노렉에서는 나노입자의 독성을 비교할 경우, 실리카 나노입자 현탁액을 초음파분쇄기로 분산하였을 때 입자 의 평균크기가 210 nm에서 270 nm 사이에 존재하며 다분산지 수(Polydispersity Index, P.D.I)가 0.46 이하로 나오는 분산조건 을 설정하여 독성시험을 수행할 권고한 바 있다.

세포독성시험

나노입자의 세포독성시험은 배양 A549 세포에 대해 실시하였으 며 MTS(CellTiter96™ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, WI, USA) 방법에 의하여 실시하였 다.¹³⁾ 96-well plate에 7.5 × 10⁴cells/mL 농도로 세포를 분주하 고 37^oC, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 양성표준물질 로서 황산카드뮴(CdSO₄, Sigma-Aldrich) 및 평가대상 나노입자 를 처리하였다. 나노입자의 배지중 최종 농도는 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 10 ppm, 1 ppm으로 조절하였다. 시험물질을 24 시간 노 출시킨 후 배양중인 96-well plate를 배양기에서 꺼내어 시험물 질을 모두 제거하고 페놀레드가 없는 RPMI-1640 배지에 희석 한 MTS 시험 용액을 각 well당 120 μL씩 넣어주었다. 배양기에 서 60분 동안 배양한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결 과 (Results)

소니케이터 캘리브레이션

500 mL의 탈이온수에 소니케이터의 프로브를 위 방법에 따라 세팅한 후 진폭을 각각 20%, 25%, 30%, 35% 및 40%로 상승 시키면서 총 8분 30초(510 초간) 부터 소이케이션을 실시하였을 때 탈이온수의 온도가 상승하는 정도를 Fig. 1에 나타내었다. 그 림에서 보는 바와 같이 진폭을 상승시킴에 따라 온도 상승폭도 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 온도 상승의 정도를 직선상에 표시하고 시간당 온도상승의 변화를 직선의 기울기로 나타낸 후 이때 작용하는 에너지 값인 Pac 값을 위 방법에 따라 산출하였다. 이때 나노렉 프로토콜에서 제시한 대로 7,056 J의 에 너지를 투입하는데 필요한 진폭당 소니케이션 시간은 7,056 J을 Pac 값으로 나누어 산출하였고 그 결과를 Table I에 제시하였다.

Table I은 7,056 J의 에너지를 방출시키기 위해서는 진폭 20%인 경우 초음파를 10분 동안 실시하여야 하며 30%로 진폭을 상승 시킬 경우 7.3분 동안 초음파를 실시하여야 가능하다는 의미이다.

입자분포에 미치는 에탄올 Pre-wetting 및 BSA의 영향 고체분말의 실리카 나노입자를 에탄올로 pre-wetting 시킨 경 우와 그렇지 않은 경우로 구분하고, 용매중의 BSA농도를 0%, 0.05%, 1%, 2%로 달리하여 현탁액을 제조한 후 소니케이션을 실시하였을 때의 입도분포를 측정하였다. Table I의 결과를 바탕 으로 진폭 20% 일 경우에는 소니케이션 시간은 10분, 진폭 30%

일 경우에는 7.3분(실제로는 8분)을 실시하였으며 DLS 방법으로 나노입자 분포도를 측정하였다. 이때 사용한 기기는 Zetaplus 모 델을 사용하였고 필요시 ELS-Z로 측정한 값과 비교하였다.

그 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 실리카 나노입자의 경우 에탄올을 사전에 적시어 소수성을 제공하는 경우와 그렇지 않은 경우 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 실리카 나노입자에 에탄올을 pre-wetting하고 BSA가 함유되지 않은 탈이온수로 현 탁액을 제조한 후 진폭 20%에서 소니케이션을 실시한 경우 평 균입자크기는 316.7±21.62 nm로 나타났다. 일정한 진폭에서 현 탁액중의 BSA농도가 1% 및 2% 일 경우에는 평균입자는 상승 하는 것으로 나타났다. 한편, 진폭을 30%로 고정하고 소니케이 션 한 경우에도 유사한 경향성을 보여주는 것으로 확인되었다.

Fig. 1 −The increase of water temperature after sonication with 13 mm tip at 20%, 25%, 30%, 35% and 40% amplitude.

Temperature was monitored every 30 second in 500 mL deionized water sonicated for 510 seconds and the slope was calculated.

Table I − Amplitude and time of sonication used to provide 7,056 J for the preparation of nanoparticles suspension

Amplitude (%) Slope (×10

) Pac Time (min)

20 57.7±55.1 12.1±1.2 10.0±0.6

25 60.7±12.1 12.7±2.5 9.7±1.9

30 79.3±9.3 16.6±1.9 7.3±0.6

35 103.3±5.7 21.6±1.2 5.6±0.3

40 120.0±6.1 25.1±1.3 4.8±0.2

다만, BSA 농도가 1% 인 경우 에탄올을 pre-wetting한 경우 입 도 분포가 더 크게 나타나는 것으로 확인되었는데, BSA의 농도 에 따른 경향성은 나타나지 않은 것으로 보아 농도차에 따른 입 도분포의 영향을 정확히 예측할 수 는 없었다. 나노렉 프로그램에 서는 7,056 J의 에너지를 방출하여 소니케이션 할 경우 본 시험에 사용한 실리카 나노입자의 평균크기는 210 nm < Zave < 270 nm 으로 나타날 것으로 예측하였는데 본 시험에서는 이 기준 영역

밖에 존재하는 것으로 나타났다.

DLS기법으로 측정된 나노입자의 크기는 intensity, volume, number로 구분하여 표현되며 계산된 결과 값은 각각 다르다. 본 시험에서는 number distribution으로 측정된 결과값을 표시하였 으며 크기별 분포 패턴을 보여주기 위해 각각의 표현방법에 따 른 결과 값을 Fig. 3에 제시하였다.

한편, 나노렉에서 제시된 두 개의 서로 다른 프로토콜은 BSA

Fig. 2 − Effect of ethanol pre-wetting on the mean zeta-average diameter of silica nanoparticles

Silica nanoparticles (powder form) were suspended in BSA solution (0.05%) with/without ethanol pre-wetting as described in method.

The suspension was sonicated at 20% amplitude for 10 min and 30% amplitude for 8 min, respectively and the mean zeta-average diameter was measured by DLS.

Fig. 3 − Size distribution of silica nanoparaaticles in 0.05% BSA solution after sonication at 20% amplitude for 10 min (A) and at 30% amplitude for 8 min (B).

Size distribution was measured by DLS with ELS-Z model. Three preparations of nanoparticles suspension were measured and

representative photo was provided.

용액의 막여과를 실시하는 경우와 그렇지 않은 경우로 나뉘는데 이러한 과정이 나노입자의 입자분포에 영향을 주는 지 파악하고 자 하였다. 진폭 20%로 10분간 및 진폭 30%로 8분간 소니케이 션을 수행하였으며 이때 0.05% 및 2% BSA 용액의 막여과 유무 에 따른 서로 다른 조건에서 입자분포를 측정하였다. 그 결과, Fig.

4에서 보는 바와 같이 일부 조건에서 막여과에 따른 입자분포차 이가 나타나는 것을 확인하였다. 그러나 진폭의 크기에 따른 일 관성이 존재하지는 않았다.

측정기기 기종에 따른 입자분포의 차이

동일한 크기분포를 같는 나노입자라 하더라도 각 실험실간 나 노입자를 측정하는 기종에 따라 그 결과 값이 달라질 가능성이 있다. 이는 나노입자의 독성과 그 입자크기의 상관성을 평가하 는데 장애요소가 될 수 있으며 실험실간 나노입자 독성을 비교

하는 데 어려움을 초래할 수 있다. 본 시험에서는 동일 나노입자 에 대한 동일한 분산 조건으로 소니케이션을 실시하고 서로 다 른 2종의 측정기기로 그 측정값을 비교하고자 하였다. 그 결과, Fig. 5에서 보는 바와 같이 기종에 따라 측정된 평균입자의 크기 는 서로 다를 수 있는 것으로 확인되었으며 경우에 따라 통계적 으로 유의한 차이가 나타났다. 20%로 진폭크기를 조정한 경우 소니케이션 시간이 짧은 경우 두 기종의 측정값 차이는 더 크게 나타나는 것으로 확인되었으며 진폭 30%로 설정된 경우에도 유 사한 경향성을 보이는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 측 정기기는 알려진 입자분포를 갖는 표준나노물질에 대해 주기적 으로 캘리브레이션을 시행하여야 함을 시사하고 있다.

세포독성

나노물질의 세포독성시험을 상호비교하기 위해서는 세포독성

Fig. 4 − Effect of membrane filtration of BSA solution on the average mean particle size of silica nanoparticles

Silica nanoparticles were suspended in BSA solution (0.05% and 2%) with/without ethanol pre-wetting as described in Method. The suspension was sonicated at 20 % amplitude for 10 min and 30% amplitude for 8 min, respectively and the average mean size was measured by DLS.

Fig. 5 − Difference of the mean zeta-average diameter of silica nanoparaticles by measuring with different instruments

Silica nanoparticles were suspended in BSA solution (0.05%) with ethanol pre-wetting as described in method. The the suspension

was sonicated at 20% amplitude for 10 min and 30% amplitude for 8 min, respectively and the mean zeta-average diameter was

measured by two different model of DLS instrument. A: Zetaplus model, B: ELS-Z model.

이 잘 알려진 양성대조물질의 사용은 필수적이다. 이는 시험에 사용한 세포의 출처, 계대수(passage), 배양조건 등에 따라 독성 의 크기가 다르게 나타날 수 있기 때문에 양성대조물질의 세포 독성 결과를 가늠하여 시험물질에 대한 결과의 신뢰성을 판단하 고자 함이다. 본 시험에서는 나노렉에서 사용하는 양성대조물질 인 황산카드뮴을 사용하였다. 각 나노물질은 농도 의존적이며 통 계학적으로 유의미한 독성을 나타내는 것이 확인되었다(결과 미 제시).

세포독성을 평가하기 위해 사용된 나노물질은 5 종으로 세리 아, 은, 티타늄, 아연 및 실리카 나노입자 등이었다. 이때 은 나 노입자는 액상으로 제공받았으며 은 나노입자를 제외한 4종은 외관상 고체분말 형태로 제공받았다. 고체분말형태로 제공된 나 노입자는 위 방법에 따라 동일한 분산조건으로 현탁액을 제조한 후 동일 크기의 에너지를 출력하도록 세팅된 소니케이션을 실시 하였다. 동일에너지로 분산시킨 각각의 나노입자에 대해 배양 A549세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

그 결과 각각의 나노입자는 농도의존적으로 세포독성을 발현 하는 것이 확인되었다(Table II). 실리카 나노입자의 세포독성시 험 결과 100 ppm에서는 세포생존율이 62.8%, 50 ppm에서는 85.7%로 나타났다. 티타늄 나노입자의 경우 100 ppm에서는 64.9%, 50 ppm에서는 79.3%로 나타났다. 결과 값에서 보듯이 동 일한 조건으로 분산된 나노입자의 독성은 동일농도에서는 독성 값이 크게 차이가 나타나지 않은 것으로 나타났다.

고 찰 (Discussions)

나노입자에 대한 독성시험은 화학물질의 독성시험과는 달리 몇 가지 새로운 중요한 관점이 대두된 바 있다. 화학물질은 동일 물질인 경우 동일한 물리화학적 특성과 생체 반응을 갖게 된다.

그러나 나노물질의 경우에는 동일 소재로 제조한 입자라 할지라 도, 입자의 크기, 분포, 표면화학, 응집체 형성 등 물리적 특성에 따라 완전히 새로운 생체반응을 나타내게 된다.^14,15)또한 독성시 험에서의 용량단위도 단순히 질량 단위 외에 표면적 단위, 입자 수 단위 등이 더 중요한 영향을 갖게 될 수 도 있다.¹⁶⁾

이와 같은 특성으로 인해 특정 나노물질에 대한 규제관리 기 준을 설정하는 것은 화학물질에 대한 기준을 설정할 때 보다 더 욱 복잡한 프로세스를 거치게 된다. 더구나 나노물질의 독성을 시험할 경우 중량단위에 의해 산출된 LC50 등의 독성 값은 같 은 중량단위 일지라도 입자분포의 특성에 따라 완전히 달라질 수 있기 때문에, 나노입자간 독성을 비교하기 위해서는 입자분포에 대한 표준화가 매우 중요하다.

나노렉 프로그램에서도 이러한 배경을 바탕으로 독성시험대상 나노물질에 대한 분산도 표준화기법을 제안한 바 있다. 즉, 각 실 험실에서 사용하는 소니케이터가 일정한 에너지를 출력할 수 있 도록 진폭과 소니케이션 시간을 설정하기 위한 캘리브레이션 프 로토콜을 제시한 것이다. 프로토콜에 따라 설정된 진폭과 시간 으로 소니케이션을 할 경우 각 시험물질 분산에 필요한 에너지 를 동일하게 공급하게 되며, 이때의 분산도를 기준으로 독성시 험 값을 생산하고 비교하는 것이 가능해 진다.

본 연구에서는 앞서 말한 유럽연합의 나노렉 프로그램에서 제공 하는 나노입자 분산에 사용하는 두 개의 서로 다른 프로토콜^11,12) 에서 제시된 설정조건의 차이점을 분석하고 각 조건을 소니케이션 방법에 적용한 후 측정 결과 값을 비교하였다.

Table I은 7,056 J을 출력하기 위한 진폭별 초음파 시간을 나 타낸 것이며 본 시험에서는 20%진폭으로 10분, 30% 진폭으로 8 분간 초음파를 실시하였다. 이때 실리카 나노입자의 크기는 거 의 같은 수준인 것으로 나타났다(Fig. 2). 나노렉 프로토콜에서는 고체분말형 나노입자에 대해 에탄올 pre-wetting의 여부를 두고 있는데, 이는 나노입자의 소수성 정도에 따라 영향이 있을 수 있 을 것으로 보인다. 각종 나노물질의 표면화학이 다르고 경우에 따라서는 소수성의 크기가 현저히 차이나는 경우도 있는데, 이 때 표면화학의 소수성이 큰 나노입자의 경우, 에탄올 pre-wetting 은 분산도를 증가시킬 것으로 예측된다. 본 시험에 사용한 실리 카 나노입자의 경우 Fig. 2에서 보듯이 에탄올 pre-wetting에 대 한 차이가 크지 않았다.

한편, 유기물의 존재는 나노물질의 분산을 증가시킬 수 도 있 고 응집을 촉진시킬수도 있는데 Fig. 2의 결과에서 볼 때 대체적 으로 BSA농도를 증가시킴에 따라 평균 크기는 증가하는 것으로

Table II − Cytotoxicity of nanoparticles in cultured A549 cells treated with nanoparticles for 24 h

Mean±SD

0 1 10 25 50 100 (ppm)

Silica 100.0±2.5 90.4±7.6 90.6±6.6 87.4±9.8 85.7±7.4

62.8±12.8

Ceria 100.0±4.4 92.2±5.2 90.5±8.2 86.4±9.3 81.3±6.2 63.3±10.8

Titania 100.0±0.9 96.6±2.2 89.4±3.2

85.0±5.3

79.3±1.5

64.9±13.4

Silver 100.0±1.4 97.3±2.1 95.0±2.2 89.7±0.3

86.6±1.8

73.2±2.7

Zinc 100.0±0.8 88.4±12.1 83.0±11.4 83.1±12.0 77.6±3.6 65.2±20.0

Statistical difference : *;p<0.05, **;p<0.01, ***;p<0.001

나타났다. 이는 BSA의 특정 아미노기 등 기능단이 실리카 나노 입자의 응집을 촉진시켰기 때문으로 판단된다. 나노렉 프로토콜 에서는 BSA용매를 막여과 시키지 않는 경우와 막여과를 시키는 경우로 나누어 볼 수 있는데, 해당 방법에서는 막여과를 시키는 것에 대한 실험적 의미를 기술하지 않았다. 0.2 μm 이상의 입도 가 큰 입자물질은 막여과에 의해 걸러지는 데 만약 BSA의 용해 도가 좋아 불용성 물질이 생성되지 않는 경우라면 막여과는 불 필요한 과정으로 생각되었다. 본 실험에서 BSA용액에 대해 막 여과를 수행한 것과 그렇지 않은 경우를 비교하였는데, 특이할 만한 결과를 도출하지는 못하였다. 통계적으로 차이가 있기는 하 나 의미를 부여할 만한 사항을 찾을 수 없었다.

Table II는 동일 조건으로 소니케이션을 실시한 나노입자를 배 양 A549세포에 24 시간동안 노출시킨 후 생존율을 측정한 것이 다. 결과에서 보는 바와 같이 시험에 사용한 나노입자의 독성 크 기는 입자의 종류와 따른 큰 차이를 보이지 않았다. 분산도의 크 기는 나노입자마다 차이는 있지만 그 차이가 독성의 크기를 좌 우할 만큼 크지 않았는데 따라서, 독성의 차이도 크지 않은 것으 로 판단된다.

결 론 (Conclusion)

실리카 나노입자를 분산하기 위한 소니케이터 캘리브레이션을 수행하였으며 진폭의 크기를 상승시킬 경우 초음파 시간이 단축 되는 것을 확인하였다. 이때 진폭과 시간에 따라 서로 다른 나노 입자에 대해 동일 에너지를 사용하여 나노입자를 분산시킬 수 있 었다. 나노렉 분산 프로토콜의 조건으로 에탄올 전처리 여부, BSA의 농도, 막여과 등이 제시되었는데, 이 가운데서 BSA농도 가 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 특히, 각 측정기종 마다 측정값의 차이가 존재할 가능성이 확인된 바 측정기기는 일 정기간마다 표준입도물질을 사용하여 캘리브레이션을 수행할 필 요성이 있다는 것이 확인되었다. 아울러 본 실험에 사용한 나노 입자를 동일에너지로 분산시킨 후 세포독성시험을 한 결과 독성 의 차이는 크지 않은 것으로 나타났다.

감사의 글

이 논문은 2016년도 동덕여자대학교 학술연구비 지원에 의해 수행된 것임

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