제 9 주
혼성화
(Hybridization)
1. 이론적 배경
• 혼성화(분자교잡, hybridization)
– 이중사슬 핵산의 변성으로 만들어진 단일사슬의 핵산이, 상보적인 염기서열을 가진 또 다른 종류의 핵산과의 상호작용에 의해 이중가닥 핵산을 생성하는 현상
• 혼성체(hybrid)
– 혼성화를 통해 생성된 이중사슬 핵산
• DNA-DNA
• DNA-RNA
• 탐침자(probe)
– DNA, RNA, cDNA, oligonucleotide 등에 방사성 동위원소나 발색, 발광물질을 표지 – 혼성화를 통해 다른 핵산 가닥의 특정한 염기서열 부위에 결합부위를 확인
• 목표 유전자가 존재하고 반응하는 상태에 따라 분류
– 고형 지지대 혼성화(solid-support hybridization)
• 니트로셀룰로오스, 나일론, 유리판, 세포나 조직
• 검사가 편리
– 액상 혼성화(liquid phase hybridization)
• 목표 유전자와 탐침자의 반응이 모두 용액 속에서 진행
• 빠른 반응과 높은 민감도
• 혼성화는 진단분자생물학의 다양한 분야에 응용
– Southern blot hybridization – Northern blot hybridization – Western blot hybridization – In situ hybridization
– Suspension array
2. 핵산 블롯 혼성화
1) 서던 블롯 혼성화(Southern blot hybridization)
– 1975년 Southern에 의해 개발된 검사법
– 단일사슬의 DNA가 상보적인 다른 단일사슬의 DNA와 결합하여 이중사슬 DNA를 형성
• 제한효소 지도 검색, 염색체 이상, 결손 등의 유전자 검색, 유전적 다형성 표지에 의한 개인식별 등
– 최근에는 PCR 검사로 많이 대체됨
– 큰 유전자나 변이 유전자에 대한 검색에서는 유용하게 적용
2) 노던 블롯 혼성화(northern blot hybridization)
– RNA 분석에 사용 – RNA 변성제
• 단일사슬인 RNA의 2차 구조 형성을 방지
• Glyoxal/DMSO, formaldehyde, formamide
– RNase 불활성화
• 세균, 세포 및 땀, 눈물 등의 분비물에도 포함
• DEPC-treated water
– RNA는 유전자의 발현의 정도, 임상적 진단, 치료 판정에 응용
3. 웨스턴 블롯
• Western blot
– 항원결정기(epitope)와 반응하는 항체의 성질을 이용
• 단백질 복합물 중 특정 단백질을 확인하는 방법
• Immunoblotting 이라고도 함
– 1979년 H. Towbin에 의해 개발됨
– 전기영동을 통하여 단백질을 크기별로 분리
• SDS-PAGE
– 단백질을 막으로 전이
• 모세관 전이, 확산 전이, 전기영동 전이
– 특정 단백질 황원에 대해 반응하는 항체를 이용하여 단백질을 검출
