자성 미세입자에의 항체 고정화 방법이 면역결합반응에 미치는 영향
최효진**·황상연·장대호·조형민·강정혜·성기훈*·주재범*·이은규† 한양대학교화학공학과생물공정연구실, *응용화학과
425-791 경기도안산시상록구사 1동 1271 (2005년 12월 5일접수, 2006년 2월 3일채택)
Effect of Antibody Immobilization Method to Magnetic Micro Beads on its Immunobinding Characteristics
Hyo Jin Choi**, Sang Youn Hwang, Dae Ho Jang, Hyung Min Cho, Jung Hye Kang, Gi Hun Seong*, Jae Bum Choo* and Eun Kyu Lee
†Bioprocessing Research Laboratory, Department of Chemical Engineering,
*Department of Applied Chemistry, Hanyang University, 1271, Sa 1-dong, Sangnok-gu, Ansan 426-791, Korea (Received 5 December 2005; accepted 3 February 2006)
요 약
자력을이용한분리기술의장점을이용하여여러가지불순물들이섞여있는현탁용액으로부터자성입자를이용 하여목적단백질만을얻어낼수있는기술의가능성에대하여알아보고자하였다. 자성입자를이용하는경우에는
(1) 자성입자표면에리간드고정화, (2) ligand(리간드)와목적물질과의특이적결합, (3) 자력을이용한자성입자의
분리, (4) 목적물질의탈착그리고 (5) 자성입자의재사용순서로진행되어여러단계의공정을단순화시킬수있
다. 이러한자성입자를이용한방법은효율성, 단순성, 까다롭지않은조건, 자동화의용이성, 비용의저렴함으로인 해관심이증대되고있다. 본연구에서는표면이카르복실기로처리된자성입자에 IgG 항체를고정화시킨후 IgG
를목적단백질로하여이를분리해내고자하였다. 이를위하여자성입자표면에다른물질과의비특이적결합이
일어나지않을조건에대하여확인해보았으며, IgG 항체를배향성고정화시켜자성입자가목적단백질과보다효
과적으로결합하여목적단백질인 IgG만을선택적으로분리해낼수있는지에대하여알아보았다. 높은 pH를사
용할경우비특이적흡착을줄일수있었으며, IgG 항체고정화된자성입자를사용할경우목적단백질인 IgG와
선택적으로반응함을알수있었다. IgG 항체의고정화에서 Fc지역 C-terminus에인접해있는탄수화물부분을이
용하여배향성을준경우, IgG 항체내의아민기와고정화시키는비배향성고정화방법보다항원과의결합능력이
약 2배높았다.
Abstract– Recent technical advances in the biorecognition engineering and the microparticle fabrication may enable us to develop the single step purification using magnetic particle, because of its simplicity, efficacy, ease of automation, and process economics. In this study, we used commercial magnetic particles from Seradyn, Inc. (Indianapolis, USA). It was ca. 2.8 micron in diameter, consisted of polystyrene core and magnetite coating, and its surface had carboxyl groups. The model, capture protein was IgG and anti-IgG was used as the ligand molecule. We studied the different sur- faces (‘nude’, ester-activated, and anti-IgG coated) for their biorecognition of IgG. At a high pH condition, we could reduce non-specific binding. Also anti-IgG immobilized magnetic particle could capture IgG more selectively. We attempted ‘oriented immobilization’ of anti-IgG, in which the polysaccharides moiety near the C-terminus was selec- tively oxidized and linked to the hydrazine-coated MP, to improve the efficacy of biorecognitive binding. Using this method, the IgG capturing ability was improved by ca. 2 fold. From the binary mixture of the IgG-insulin, IgG could be more selectively captured. In summary, the oriented immobilization of oxidized anti-IgG proved to be as effective as the streptavidin-biotin system and yet simpler and cost-effective. This immobilization method can find its applications in protein biochips and biotargeting.
Key words: Magnetic Particles, Biorecognition of IgG, Oriented Immobilization, Surface Modification
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
**Current address: Celltrion Quality Control Group, Incheon, Korea.
1. 서 론
생물분리공정의여러단계의공정을단순화시키기위한접근방 법가운데하나는자력을이용한자기분리(magnetic separation) 기술 이다. 자기분리기술의주요이점가운데하나는점성용액이나현탁 액에서직접목적물질의분리작업이가능하다는것이다. 자기분리 기술은고체입자를포함한여러가지생물물질들이섞인현탁액 내에서온화한조건으로목적물질을분리해낼수있다는장점을가 지고있다[1]. 이외에도스케일업가능성(scalability), 효율성, 단순 성, 자동화의용이성, 비용의저렴함등으로연구가증가하고있다.
미세자성입자는단백질, 펩타이드, 효소의고정화, 생물분리기술, immunoassay, 약물전달, 바이오센서등에폭넓게사용되고있다.
자성입자를이용한생물물질의선택적분리는다음의과정에따
라진행된다. (1) 목적물질과의결합력이강한리간드물질을자성입
자표면에위치시키고, (2) 혼합용액상에서리간드물질이목적물질
만을인식하여결합하고, (3) 자력을이용하여자성입자만을분리해낸
뒤, (4) 분리해낸자성입자에서목적하는물질을리간드물질로부터
탈착시키게된다. 이때, 목적물질만을특이적(specific)으로분리해내 기위하여목적물질과특이적으로반응할수있는리간드물질을자 성입자표면에부착시키는데, 자성입자표면의기능기를활성화한 뒤 리간드를결합시키고반응하지않은활성잔기를막아줌으로써리간
드물질을자성입자표면에위치시킬수있다(Fig. 1).
리간드의고정화단계는고체상에기초한생물분석기술이나바이 오센서연구에결정적인부분이다. 항체고정화의경우공유결합에 의한고정화반응이후종종항원과의결합능력이감소하는경우 가있다. 이러한문제점을극복하기위하여항체를배향성고정화 시킨다. 배향성고정화는단백질의활성부위에서떨어져있는잘
알려진부위를통하여고정화시키는방법이다. 항체의배향성고정 화방법가운데하나는당단백질의탄수화물부분을이용하여고 정화시키는것이다. 항체의경우그들의 H-chain(Heavy chain)에적
어도하나이상의 N-linked 탄수화물을가지고있으며 IgG의경우
CH2 domain의 Asn297 지역에하나의 N-glycosylation 부분을가지
고있다[2]. 항체의탄수화물부분을이용하여고정화시킬경우단
백질구조의안정성뿐아니라활성부위로의접근성도용이함을알 수있다[3, 4].
본연구에서는자성입자를이용하여목적단백질의분리정제과정 을단순화하고자하였다. 목적물질인 IgG를선택적으로분리해내 기위하여자성입자에 IgG 항체를고정화시키고, 고정화과정에서 일반적으로사용되고있는아민을이용한고정화방법과탄수화물 부분을이용한방법을이용하여각각의경우 IgG와의결합능력을 비교해보았다. Surface plasmon resonance biosensor(SPR)를이용 하여비배향성고정화와배향성고정화에의한결합능력차이를확 인하였다. 또한, IgG 항체를고정화시킨자성입자를사용하여 IgG만 을선택적으로분리해내기위한조건을찾았으며자성입자를이용 하여분리공정의단계를줄일수있는가능성에대하여확인하였다.
2. 실 험
2-1. 실험재료
본실험에서사용된자성입자는 CM-MP(carboxyl modified magnetic particle)로서 Seradyn, Inc.(Indianapolis, USA)에서구입하였다. 지
름이 2.8 µm이며, 폴리스티렌코어에자철석을코팅시킴으로써자
성을나타내며표면은카르복실기를기능기로가지고있다. 모델물 질로사용한 mouse IgG polyclonal 항체와 mouse IgG, BSA(Bovine
Fig. 1. Schematics of IgG purification by using anti-IgG coated magnetic particles.
serum albumin)는 Sigma-Aldrich(St. Lois, USA)사에서구입하였다.
단백정량을 위한 Bradford dye와 SDS-PAGE 시약은 Bio-Rad
(Hercules, USA)사에서구입하였다. 배향성고정화를위하여사용
된 streptavidin과 biotin은 Pierce(Rockford, USA)사에서구입하였 으며이두가지모두 hydrazide 기를가지고있다. 인간인슐린은
(주)종근당바이오에서공급받았다.
2-2. NHS-EDC를이용한자성입자에mouse-IgG 항체의고정화 표면이카르복실기를갖는자성입자의표면에 IgG 항체를고정화 시켰다. 자성입자 1mg을 50mM MES(2-(N-morpholino ethanesulfonic acid, pH 6.1) 버퍼로 3번세척하고, 230 mL의 50 mg/mL의 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 같은부피의 10 mg/mL EDC(1-ethyl-3- (3-dimethylamino-propyl) carbodiimide)를넣어 30분동안을반응시 켜줌으로써표면기를 NHS로활성화시켰다. IgG 항체결합에대한
pH 영향을연구하기위하여 1 mg/mL의 IgG 항체를 10 mM sodium acetate(pH 3.5, 4.5, 5.5) 버퍼, 10 mM MES(pH 6.5) 버퍼, 10 mM PBS(phosphate buffered saline, pH 7.5) 버퍼를이용하여 IgG 항체 를 100µg/mL로희석한뒤각각 1 mL을취하였다. 자성입자가들 어있는마이크로튜브에희석시킨 IgG 항체를넣고교반시키면서상 온에서반응시켰다. 반응후원심분리기를이용하여상등액만을취
하고남아있는 IgG 항체의양을 UV로측정하여고정화된 IgG 항
체의양을결정하였다. 자성입자에남아있는활성기인 ester 중간체 를막아주기위하여 1 M의 ethanolamine(pH 8.0)을넣고 15분동안 반응시킨후각각의버퍼로세척하였다.
2-3. IgG 항체의탄수화물 부분을이용한고정화
자성입자 1 mg을취하여 0.1 M MES(pH 4.8) 버퍼를이용하여
3번세척하였다. 0.1 M MES(pH 4.8)에 0.5 M acipic dihydrazide를 넣고교반하며반응시킨뒤자성입자가들어있는마이크로튜브에
1 mL을넣어준다. 그뒤 3 mg의 EDC를넣고 3시간동안교반시 키며반응시킨후 3차증류수, 1 M NaCl, 3차증류수순으로세척
하였다. IgG 항체의탄수화물부분을산화시키기위하여 1 mL
의 0.1 M sodium phosphate(pH 7.0) 버퍼에 1 mg의 IgG 항체 를 용해시킨 후 10 mg의 sodium m-periodate를넣고 30분간 상온에서반응시켰다[5]. 반응후 desalting column(Sephadex G- 25)를이용하여남아있는 sodium m-periodate와산화된 IgG 항 체를분리해냈다[6]. 최종적으로 0.1 M sodium phosphate(pH
7.0) 버퍼를이용하여자성입자를 세척한후 산화시킨 IgG 항체
50µg 첨가하여상온에서하루동안가볍게교반하였다. 반응후
0.1 M sodium phosphate(pH 7.0) 버퍼, 3차증류수, 1 M NaCl, 3차 증류수순으로세척하였다.
2-4. Biotin-streptavidin을이용한 IgG 항체고정화
자성입자에 streptavidin을고정화시키기위하여 1 mg의자성입 자를 50 mM MES(pH 6.1) 버퍼로 3번 세척한 후 2 mg/mL의
streptavidin hydrazide 용액 200µl와 10 mg의 EDC를 넣어하 루동안반응시켰다[7]. Biotin 수식공정은 1 mg/mL의 IgG 항 체를산화시킨뒤 1 mg/mL의 biotin hydrazide 용액을넣고 1시 간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응을 멈추기 위하여 0.01 M sodium phosphate(pH 7.4) 버퍼를이용하여 4oC에서하루동안 투석시켰다[7].
2-5. 고정화된 IgG 항체와 IgG의 결합반응
고정화시킨 IgG 항체와 IgG 간의결합을확인하기위하여 IgG
항체가고정되어있는 1 mg의자성입자에 100µg의 IgG를넣어교 반시키면서상온에서반응시켰다. 반응뒤 30분, 60분, 1시간후, anti- IgG와 IgG 간의결합반응을분석하였다.
2-6. IgG 탈착을 위한최적조건
고정화된 IgG 항체와결합한 IgG를분리하기위하여탈착조건
을찾아보았다. 고정화된 IgG 항체와결합한 IgG에각각의탈착
버퍼를 1 mL씩넣고 2분동안반응시켰다. 탈착을위해사용한버
퍼는 1M sodium chloride, 200 mM sodium carbonate(pH 11.5), 100 mM sodium bicarbonate(pH 9.2), alkaline SDS(0.2 M Tris base/1.0
％ SDS), 100 mM sodium citrate(pH 3.0), 100 mM glycine(pH 2.0), 250 mM sodium hydroxide, 100 mM hydrochloric acid, 100 mM glycine(pH 2.3)+1％ DMSO 이다. 원심분리기를이용하여상층액만 을취하여탈착된 IgG양을확인하였다.
2-7. pH에 따른비특이적 흡착
(1) 표면에아무런처리하지않은카르복실기표면(‘nude’)과 (2) NHS/EDC를이용하여표면을활성화시킨후 1 M의 ethanolamine (pH 8.0)을이용하여 blocking시켜하이드록실기를나타내는표면에 비특이적결합으로흡착되는 IgG와 BSA의양을확인해보았다. 1 mg의자성입자에 25, 50, 100, 200, 400µg의 IgG와같은양의
BSA를 1 mL의부피가되도록각각버퍼와혼합하였다. pH의영
향을확인하기위하여 50 mM sodium acetate(pH 3.5, pH 5.5) 버 퍼, 50 mM sodium phosphate(pH 7.5) 버퍼, 50 mM sodium bicarbonate(pH 9.5) 버퍼를이용하였다. 1시간동안교반시키며반 응시킨후상등액만을취하여전체의양에서 UV로측정한상등액 에남아있는 IgG와 BSA의양을감하여흡착된 IgG와 BSA의양 을측정하였다.
2-8. IgG 항체자성입자의재사용
자성입자에고정화된 IgG 항체와결합한 IgG를탈착시켜회 수한 뒤, 100µg/mL의 IgG를 1 mL 넣어주어 가볍게 교반시 키며 반응시켰다. 반응후 원심분리를통하여상등액만을취하 여 남아있는 IgG의 양을측정함으로써 반응한 IgG 양을정하 였다. 탈착과정과결합과정을반복하여진행하면서재사용된자
성입자 표면의 IgG 항체와반응하는 IgG의 양의변화를관찰
하였다.
2-9. 이상혼합물(binary mixture)에서의선택적결합
Amine-coupling을이용한비배향성고정화, 배향성고정화, biotin- streptavidin을이용하여 30~35µg의 IgG 항체가고정된자성입자가 들어있는마이크로튜브에 50 mM sodium bicarbonate(pH 9.5) 버 퍼에녹아있는 60µg의 IgG와인슐린을넣고 1시간동안상온에서 교반시키며반응시켰다. 원심분리후자성입자를동일한버퍼를이 용하여세척하였다. 고정된 IgG 항체와반응한샘플들은 non-denaturing SDS-PAGE를이용하여확인하였다. 이때, 20％ acrylamide gel을사 용하였으며 gel은 coomassie brilliant blue 염색법을이용하였다. SDS-PAGE 이미지 정량분석을 위해서 densitometer(Total Lab, Durham, USA)를이용하였다.
2-10. Surface plasmon resonance를이용한 IgG 항체비배향성 고정화SPR biosensor는 Biacore AB사(Uppsala, Sweden)의 Biacore 3000
시스템을이용하였다. 센서칩으로는 CM5 칩을이용하였다. 이칩 표면은 carboxymethyl dextran 층으로도포되어있으며 4개의 flow cell이있다. 음전하를띄고있는 dextran 층에리간드의고정화효 율을향상시키기위해양전하의 coupling buffer를이용하여정전기 력을유도한다(preconcentration test). pH 3.5, 4.5, 5.5의 10 mM
sodium acetate를리간드와혼합하여주입하여최대로결합하는최
적의 pH 조건을결정하였다. Dextran 층의 carboxyl기를활성화시
켜항체표면의 amine기와공유결합을촉진시키기위하여, 0.2 M
EDC(N-ethyl-N'-dimethylaminopropyl carbodiimide)와 0.05 M NHS (N-hydroxysuccinimide)를 7분동안흘려주어반응성이좋은 NHS ester로활성화시켰다. Preconcentration test를통해결정된 pH의 10 mM sodium acetate에리간드(IgG 항체항체) 최종농도 20µg/ml이 되도록첨가한후에활성화된 flow cell 2(fc 2) 위로 5µL/min의유 속으로고정화하였다. IgG 항체가결합하지않은 NHS ester를 1 M ethanolamine을 7분동안흘려주어 blocking 시켰다.
2-11.Surface plasmon resonance를이용한 IgG 항체배향성 고 정화CM5칩의카르복실기를 0.2 M EDC와 0.05 M NHS를 5µL/min
으로 3분동안흘려주어 NHS ester기로활성화시켰다. 그후아민 기로수식하기위하여 5 mM adipic acid hydrizide를 5µL/min으로
7분간흘려주었다. 그후아민기로바뀌지않은 NHS ester기를 1 M ethanolamine으로 5µL/min의유속으로 7분간흘려주어 blocking시 켰다. 그후자성입자에쓰인산화된 IgG 항체와동일한방법으로 산화시킨항체를최종농도가 20µg/mL가되도록 10 mM sodium acetate(pH 3.5)에녹여 5µL/min으로비배향성항체와동일한양을
flow cell 4에고정화하였다. 그후항체의결합(Schiff base)을안정 화하기위하여 0.1 M sodium cyanoborohydride를 2µl/min로 20분 간흘려주었다.
2-12. SPR을이용한IgG 항체의고정화농도에따른결합력비교
10.8 mg/mL IgG를최종농도가 321.3, 160.7, 80.3, 40.2, 20.1, 10.0, 5.0, 2.5µg/mL이되도록 0.01 M PBS(pH 7.2)에녹여 30µL/min의 속도로 fc(flow cell)1에서부터 4까지 흘려주었다. 각 실험은
2분결합구간(association time), 3분해리구간(dissociation time)을 주어 5번반복실험하였다. 시료마다다음시료를주입하기위해
250 mM NaCl+12.5 mM NaOH를 2분간 30µL/min으로흘려주어 재생(regeneration)하였다.
3. 결과 및 고찰
3-1. IgG 항체고정화에효과적인 pH 선정
카르복실기를갖는자성입자를 NHS와 EDC를이용하여활성화
시킨표면에 IgG 항체고정화를위한최적 pH를찾기위하여 pH
3.5부터 7.5까지시험해보았다. pH 4.5부터 6.5까지는 IgG 항체와
자성입자간의고정화가무리없이진행되는것으로보이나 pH 3.5
의경우에는거의반응이일어나지않았다. 따라서이연구에서진행 되는 IgG 항체의 amine-coupling 고정화는 pH 4.5에서진행하였다.
3-2. 자성입자에고정화되는최대 IgG 항체양
NHS와 EDC로표면을활성화시킨 1 mg의자성입자에 10 mM sodium acetate(pH 4.5) 버퍼에녹아있는 IgG 항체의양을증가시키 며넣어줌으로써고정화되는최대량을확인해보았다. Fig. 2에서 나타나듯이 1 mg의자성입자에약 70µg의 IgG 항체가붙는다. 이 결과는 Langmuir model에적용할수있다.
q/qm= (Kd× Cs)/(1 + Kd× Cs)
여기서 q는반응한단백질의양(g/mg-MP), qmax는최대단백질반 응량(µg/mg-MP), Cs는용액상의단백질의농도(µg/mL) 그리고 Kd
는평형상수(mL/µg)이다[8]. 위의식에의하여 qmax는 105µg/mg,
그리고 Kd는 0.014 mL/µg로나타났다.
3-3. IgG항체의고정화를 위한반응시간
자성입자표면에 IgG 항체를고정화시키는데필요한시간을확
인해보았다. NHS와 EDC를이용하여활성화시킨자성입자에 10 mM sodium acetate(pH 4.5) 버퍼에들어있는 IgG 항체 80µg을넣어 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간후자성입자에고정되는 IgG 항체의양 을확인하였다. 1시간까지거의모든반응이일어났고그이후로는 반응이거의일어나지않았다.
3-4. 비특이적반응을줄이기위한 pH 설정
자성입자표면에비특이적으로흡착하는단백질의양을줄이기 위하여반응에적합한 pH 조건을확인해보았다. 목적물질인 IgG와 불순물질인 BSA의혼합물을 50mM sodium bicarbonate(pH 3.5~9.5)의 버퍼에용해시킨뒤입자표면에흡착하는양을분석하였다. 사용한 자성입자는 (1) 표면을아무런처리하지않아카르복실기를나타내
는표면과 (2) NHS와 EDC를이용하여표면을활성화시킨후잔여
카르복실기를 1 M ethanolamine(pH 8.0)을이용하여 blocking시켜 하이드록실기를나타내는표면을이용하여실험하였다. Fig. 3에서 나타나듯이 pH가높아질수록자성입자표면에흡착되는 IgG와 BSA
의양이줄어드는것을확인할수있다. 이러한 pH의영향은자성 입자표면과단백질표면의전하에의한영향이라고설명할수있 다. pH가 IgG의 pI값인 7.4 범위보다높아지면서 IgG의표면이음
Fig. 2. Adsorption isotherm of anti-IgG immobilized on magnetic parti- cle (N=3).
성부하를나타내어역시음성부하를나타내는자성입자와의정전기 적반발력이생김으로써흡착되는양이줄어들게되고, 같은이유 로 pI 값이 4.7인 BSA도 pH가 4.7보다높아짐으로써자성입자표 면에흡착되는양이줄어들게된다. 이러한결과는단백질의흡착 에서정전기적반발력이중요한요소라는보고와일치하는것을알 수있다[9].
3-5. IgG의 선택적결합확인
IgG 항체를리간드로고정화시킨자성입자에 IgG만이선택적으 로결합할수있는지에대하여확인해보았다. 비특이적반응을줄 이기위하여 50 mM sodium bicarbonate(pH 9.5) 버퍼를이용하였 다. 자성입자표면에 (1) 아무런처리하지않은경우, (2) NHS와 EDC
를이용하여활성화시킨후 1 M ethanolamine(pH 8.0)을이용하여
blocking시킨경우, (3) IgG 항체를 amine-coupling 방법으로비배 향성고정화시킨경우에 IgG와 BSA의흡착률을확인해보았다.
Table 1에서나타나듯이 IgG 항체를고정화시킨자성입자를이용한
경우가카르복실기, 하이드록실기만있는경우보다목적단백질인
IgG와의선택적결합력이 6~8배높아진것을확인할수있었다. 즉
IgG 항체를표면에고정화시킨경우 IgG와의선택적반응을높일 수있는것을확인하였다.
3-6. 고정화된 IgG 항체와 IgG간의반응속도
IgG 항체가 amine-coupling 방법으로고정화된자성입자에 IgG
가 결합하는데필요한 시간을측정하였다. IgG 항체가 amine- coupling 방법으로고정화되어있는자성입자에 100µg의 IgG를 넣어준뒤 20분부터 360분까지결합한 IgG의양을확인한결과, IgG
항체와 IgG 사이의결합은 1시간이면 끝나는것을확인하였다
(Fig. 4).
3-7. IgG 탈착조건
고정화된 IgG 항체와결합한 IgG의효율적탈착을위하여 Table 2
에제시된것과같이 pH, 버퍼염의종류및농도의영향을살펴보
았다. 이버퍼들중에 100 mM glycine(pH 2.0)과 100 mM glycine (pH 2.3)+1％ DMSO 버퍼를이용한경우회수율이 86％로가장높
았다. 이것으로 IgG 항체와결합한 IgG의탈착에서염기성조건보
다 산성조건이더욱효과적인것을알수 있었다. 또한, glycine
만을사용하는경우보다 DMSO를혼합하여사용하는경우높은효
과를나타내었는데이는 acetonitrile이나 DMSO와같은유기물질 들이탈착효율을높여준다는보고와일치하였다[10].
Fig. 3. Amount of protein adsorbed on magnetic particle surfaces.
: nude MP with BSA, : nude MP with IgG, : NHS- activated (after ethanolamine blocking) MP with BSA, : NHS-activated (after ethanolamine blocking) MP with IgG.
Table 1. Effect of surface on adsorption capacity of BSA and IgG
Relative adsorption capacity
BSA IgG *
Surface with carboxyl group(nude) 1.0 0.4
Surface with hydroxyl group(NHS-activated and ethanolamine-blocked) 1.0 0.6
Anti-IgG immobilized surface(ligand-coated) 1.0 3.5
(*) Relative adsorption capacity of IgG as compound to BSA’s (1.0).
Fig. 4. Time course of IgG adsorption to anti-IgG-coated magnetic particle. k is 0.014 min-1(N=3).
Table 2. Buffers used for elution of IgG adsorbed on anti-IgG-coated magnetic particle
No. Elution buffer Elution yield
(％)
1 1 M sodium chloride 0.8
2 200 mM sodium carbonate (pH11.5) 10.0 3 100 mM sodium bicarbonate (ph 9.2) 1.3 4 Alkaline SDS (0.2 M Tris base/1.0％ SDS) 31.3
5 100 mM sodium citrate (pH3.0) 0.8
6 100 mM glycine (pH 2.0) 77.1
7 250mM sodium hydroxide 21.7
8 100 mM hydrochloric acid 35.8
9 100 mM glycine (pH 2.3)+1％ DMSO 86.0
3-8. 고정화된 IgG 항체의재사용가능성
목적단백질인 IgG의효과적인탈착과자성입자에고정화된 IgG
항체의재사용은자성입자를이용한생물분리기술의산업화에서 중요한부분이다. 가장좋은탈착수율을보이는 100 mM glycine (pH 2.3)+1％ DMSO 버퍼를이용하여 IgG를탈착시킨뒤, 기사용 한자성입자를이용하여 IgG의결합과탈착을반복하였다. 자성입 자를 8번반복해서사용한후, 활성은초기결합력의 70％정도가 유지되는것을알수있었다. Kandimalla 등[10]은 Sepharose에고 정화된 EP(ethyl parathion) 항체를이용하여고정화된항체의재사 용가능성을실험하였다. 100 mM glycine(pH 2.3)+1％ DMSO 버 퍼를이용하였을때 14~15회까지는초기결합력의 70％이상을유 지하였다. 이것으로보아자성입자에고정화된항체의재사용횟수 의향상이필요하다.
3-9. 배향성고정화수율비교
자성입자표면에항체의아민기가배향성없이고정화되는방법 과항체의탄수화물부분을산화시켜알데하이드로변화시킨후입 자표면의아민기와고정화시키는방법, streptavidin을고정화시킨 자성입자에 biotinylation시킨항체를고정화시키는방법을각각이 용하였다. 이론적으로하나의항체에반응할수있는항원의수는
2개인데, Table 3으로부터알수있듯이비배향성고정화방법을이
용하는경우, 항체하나에대하여반응할수있는항원의수는약
0.9개이고항체의탄수화물부분을이용하여배향성고정화를시킨
경우에는항체하나에대해약 1.5개로항원과의결합력이약 1.6배 향상되는것을알수있었다. 이러한결과는비배향성고정화방법
의경우에는항체내라이신의 ε-amine을이용하게되는데항체에
는라이신이많이존재하기때문에다중결합으로고정화되는것은 피할수없고, 또고정화후항체의비배향성에의해리간드항체의 결합력이감소하게된다는연구결과와일치하였다[4]. 항체의탄수 화물부분을산화시켜서고정화시키는경우에는항체가비교적방 향성있게고정화되기때문에활성부위가바깥방향으로노출될확 률이높아진다. 또, 항체의탄수화물부위가일종의 spacer arm으로 작용하여입자표면으로부터의거리를만들어주어항원과의접근을 용이하게한다고유추할수있다[11]. 또다른방법인 streptavidin과
biotin을 이용하는방법은 카르복실기를갖는 자성입자표면에
streptavidin을공유결합시킨뒤, IgG 항체의탄수화물부분을산화
시켜 biotinylation시키고두가지를반응시키는것이다. 이때 IgG 항 체에결합한 IgG의수는항체하나에대해약 1.5개로항체를산화 시켜고정화시키는방법을이용하는경우와거의같았다 (Table 3).
따라서항원과의결합력측면에서볼때, 항체를산화시켜고정화 시키는방법과 biotin-streptavidin을이용한방법은비슷한결과를 나타냈다.
3-10. 이상혼합물(Binary mixture)에서의선택적결합
비배향성고정화를이용한경우와 IgG 항체의탄수화물부분을
산화시켜배향성고정화시킨경우, 그리고 streptavidin과 biotin 고
정화방법을이용하여 IgG 항체를고정화시킨자성입자를 IgG와
인슐린의혼합액에첨가하였다. Table 4와같이비배향성고정화경 우는 IgG의약 30％가결합한것으로판단되고, 배향성고정화와
biotin-streptavidin을이용한경우에는각각 94％, 97％의 IgG가결 합한것을알수있다. 또한, 고정화된 IgG 항체양에대하여확인해 보면배향성을준경우와 biotin-streptavidin을이용한경우하나의 항체에약 1.7개의항원이결합하였다. 이는 Table 3에서제시한결 과와유사함을알수있다. 불순물인인슐린이존재함에도특이적 결합력은유지되는것으로미루어볼때여러불순물이존재하는 용액에서목적단백질을선택적으로결합분리해내는데유용할것 으로기대된다. 또한, 이러한결과는단백질의배향성고정화가비 배향성고정화보다활성부위와의접근성이향상됨으로인하여높은 활성을보여준다는기존의연구결과와일치하는것을알수있다
[3]. 불순물로넣어준인슐린의양은반응전후의양에거의차이
가없는것으로보아, 고정화된 IgG 항체와 IgG만선택적으로결합 한다는것을확인하였다(Fig. 5). 그러나 biotin-streptavidin을이용 한경우비특이적결합을나타낸다는보고를감안할때 IgG 항체의 탄수화물부분을산화시켜이용한배향성고정화방법이더욱효과 적이라고판단된다.
3-11. SPR을이용한배향성과비배향성IgG 항체고정화에따른
결합력 확인
CM5 칩에 amine coupling으로비배향성고정화된 IgG 항체는
1,076 RU(428 nM)이 fc 2에, 탄수화물기를알데하이드기로산화시
켜 CM 5 칩의아민기와반응시켜배향성을준경우 1,047 RU
(418 nM) 고정화되었다[12]. 이와같이고정화된 IgG 항체에 321.3,
Table 3. Comparison of IgG binding affinity by ligand coupling methods (N=3) ImmobilizationMethods Anti-IgGImmobilization
(µg/mg MP) IgG adsorbed
(µg/mg MP) Binding affinity(the number of IgG/the number of anti-IgG)
Random(amine-coupling) 31.9 ± 6.9 28.2 ± 9.5 0.9
Oriented(oxidized carbohydrate coupling) 35.7 ± 2.9 56.3 ± 5.8 1.5
Biotin-streptavidin 43.8 ± 2.7 60.3 ± 1.7 1.4
Table 4. Comparison of IgG binding affinity from IgG-insulin mixture by ligand coupling methods (N=3) Immobilized
anti-IgG(µg) Adsorbed IgG Ratio of immobilized antibody
to bound antigen Percentage (％) Mass (µg)
Random(amine-coupling) 31.3 29.6 17.8 0.6
Oriented(oxidized carbohydrate coupling) 32.9 94.2 56.5 1.7
Biotin-streptavidin 35.2 96.8 58.1 1.7
160.7, 80.3, 40.2, 20.1, 10.0, 5.0, 2.5µg/mL의 IgG를 30µl/min으 로흘려주어결합력을확인하였다. Fig. 6에서보여주듯이배향성 고정화된 IgG 항체의경우비배향성고정화된 IgG 항체보다약 6배 높은 IgG와반응할수있는것으로나타났다. 이는배향성이있음 으로하여항원반응부위가바깥으로많이노출되어더많은항원 과결합할수있다는것을알수있다. 또한, 고정화된 IgG 항체와 반응한 IgG의몰비를구해보면, 비배향성의경우 IgG 항체하나당
0.04개의 IgG와반응하는반면, 배향성의경우 0.27개의항원과반 응하는것을알수있다. 이는자성입자실험과는수치적으로는많
은차이가있다. 이는 dextran 층내에고정화되어있는항체들이항
원과만나기어려워상대적으로적은양의항원과결합하는것으로 사료된다. 하지만, 배향성고정화시킨 IgG 항체의경우비배향성고
정화된 IgG 항체보다 6~7배더높은결합친화력을보인다는것을
확인하였다.
4. 결 론
본실험에서는자성입자를이용한다단계분리공정에대한타당 성을확인하였다. 리간드로이용한 IgG 항체고정화경우 pH 4.5에 서고정화율이가장높아서 1 mg당약 70µg의 IgG 항체가고정화 되었다. 단백질의비배향성 amine-coupling 고정화방법과 IgG 항 체의탄수화물부분을산화시킨배향성고정화방법을이용하여비 교해보면, 항원결합부위와멀리떨어져있는항체의탄수화물부 분을이용하여고정화시킨경우 IgG가비배향성고정화보다항원 결합능력이약 2배높았다. 불순물인인간인슐린이섞여있는용액
에 IgG 항체를고정화시킨자성입자를넣어반응시켰을때역시배
향성있게고정화시킨경우 IgG와더욱높은결합력을보였다. 따 라서항체의탄수화물부분을산화시켜배향성고정화를시킨경우 항원과의결합능력, 공정의단순성측면에서효과적이었다. 이결과 를 SPR을이용하여항원항체간결합력을비교하여확인하였다.
간단한산화반응에의해리간드항체를배향성고정화시켜항원결 합력을향상시키는방법은고성능생물분리공정으로의응용가능성 뿐아니라약물표적전달, 바이오칩분야로의응용에도가능할것 으로판단된다.
감 사
본과제(결과물)는교육인적자원부, 산업자원부, 노동부의지원으 로수행중인최우수실험실지원사업(‘차세대바이오의약생산을위 한생물인식공학기술개발’)의연구결과입니다. 이에감사드립니다.
참고문헌
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Fig. 5. SDS-PAGE (20％ acrylamide gel) analysis. Lane 1: binary mixture sample (0.6 mg/ml IgG and 0.6 mg/ml insulin), lane 2:
after reaction by random immobilized anti-IgG, lane 3: after reaction by oriented immobilized anti-IgG, lane 4: after reac- tion by biotinylated anti-IgG.
Fig. 6. IgG isotherm to immobilized anti-IgG antibody. Open circle:
orientedly immobilized anti-IgG antibody, closed circle: ran- domly immobilized anti-IgG antibody.
10. Kandimalla, V. B., Neeta, N. S., Karanth, N. G., Thakur, M. S., Roshini, K. R., Rani, B. E. A., Pasha, A.and Karanth, N. G. K.,
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