Agarose Electrophoresis

(1)

대한임상병리사협회지

:

제 5 권 제 1 호

1973

對한小考

Agarose Electrophoresis

에

(指導安富浩敎授)

Lipoprotein

의

聖心病院臨皮病理科

接

알려진 사실이 다. 이 러한 眼質蛋白複合體 (Lipid-

Protein

Complex) 를 초기에는 산성 만포화황산암모니움을 써서 분리 1) 하여 그중에는 단백체인 지질 코레스테롤에스터 등이 존재한다고 말표하였었다.

현청전기영동법을 개벨-한 Tiselius²) 도 사람의 혈청을 전 기 영 동하면

ß-globulin

분획 과 α-globulin 분획 이 혼탁 되어 보이는데 이것은 眼質을 包含하고 있기 때문이라 고 報告하였었다.

이 와같이

Lipoprotein

은 많은 사람에 아 왔다.

확인되 의해

德徐

血淸중에 存在하는 暗質에 는

cholesterol ester , free cholesterol , neutral

fat(거 의 가

Triglyceride

로 存在)

phospholipid

그외 소 량의

free fatty acids

가 존재 한다.

정상인은 이러한 聞質은 血淸中 거의 1% 를 차지하고 있으며 순환혈액중에는 15 f"，J 30gm 에 이르는 양이 있고 이것들은 거의 대부분이 血淸蛋띄과 결합한 聞質 다시 말해서 B릅質蛋白複合體를 形成하여 존재한다고 알려져 있다. 이 런 물질은 특히 食後에 增加를 한다는 것은 널리

(績論)

Phospholipid(20-30)l Phospholipid ,

C￡이esterol 의 운반

molesteroI(17-30) |

Chylomicron의 뻐質(주로phospholi pid

,

I

nonesterifld

cholesterol) 의 分散協助.

주로

cholesterol

의 운반

그외

phospholipid. Neutral fat

의 운반

Neutral fat

의 운반

陽管에 서 吸收펀 聞質成分(대 부분은 중성지방)의 운반

Lipoprotein

으l 種類와 性狀

훨灌짧劃에 의 | ^{훨환b짧짧劃에} | ^{훌뚫쫓뚫짧몽} | ^{좋뽑할 빨휠짧鍵|} Lipoprotein

의 主投좀U A※ (33-57)

α1-Lp

HDL

cholesterol (46) B (20-25)

껴-Lp

LPL Sf. 0-20 VLDL Sf 20-400 Chylomicron

Neutral fat(50) C>B))(A) (1 0)

pre ß-Lp

Neutral fat(83)

※ A. B 는 각기

Asp ,

Glu 을

N

말단 아미노산으로 되어있고

C

는

Thr ,

Ser 을

N

말단 아미노산으로

Apolipoprotein (Sasaki

等에 서 轉載)

C))A (2) Chylomicron

는 하

볍을 소개하여 보먼 다음과 같은 것들이 있다.

1)

沈澈法

:

沈觀法은 簡易測定法의 一種이 다.

Lipo-

protein은 Chylomicron을 合해 서

4

種耶 α-

Li poprotein , ß-Lipoprotein , Pre ß-Lipoprotein

이 있 다. 이 런 것 들은 組成上 아주 相通한 部分이 있!!...묘로 간단한 方法으로 正確한 分析을 하기란 아주 어려운 것이다.

檢훌方法으로서도

이 러 한

4

種의

Lipoprotein

을 다 알아내 는 방법 과 어 떤 특정 한 종류의

Lipoprotein

만을 분석 하는 방법 이 있 는데 、沈澈法은 후자의 分析法이며 한번에 여러사람의

- 2 3 -

Lipoprotein

은 暗質과 蛋白質을 주성 분으로하는 복 합단백체라고 생각되고 있으며 8읍質의 運搬 및 代謝에 아주 중요한 역할을 하고 있다. ij읍質에 관해서는 아주 옛날부터 동맥경화증 등의 질병과 연관해서 수많은 연 구엽 적 이 딴표되 어 왔다. 그런데

Lipoprotein

에 관해 서 는 근래에 많은 연구가 이루워치고 있는데 이에는 여 러가지 원인이 있다고 볼 수 있다. 그 이유로서는 우 선 분석방법이 어려웠고 또한 분자의 不安定性保存의 어 려 움 등등을 指觸할 수 있 다.

Lipoprotein

의 分析에 는 여 러 가지 의 方法이 利用되 는데 이 에 는

lipoprotein

의 物理化學的性狀을 利用하고 있다. 그 중 벚가지 방

(2)

검 체 를 분석 하여 病的增加의 定性的分析法으로서 횟 病의 發見을 主目的으로 하는 檢좁法이라고 할수있다.

測定法으로서 는

Dextran-sulfate

法3>，

Heparin -Oa

沈願 합4) 等의 polyanion 을 쓰는 方法들이 있다.

2)

超遠心품

- Lipoprotein

의 分子의 무개 의 差를 利用하여 分析하는 方품안데 커다란 대형특수장치가 必喪하며 오랜 時間이 所要되 는 短點이 있지 만 分析途中 에

Lipoprotein

의 變性을 최 소한도로 막을 수 있 고 그 러므로서 인체내의 狀態를 가장 가깜게 反映하는 長點 이있어 아직도 표준방법의 자리블 유지하고 있다. 이 方法으로는 高比重리 뽀蛋白 (high

density lipoprotein ^, H. D.L.).

低比重려 뽀蛋白

(low density lipoprotein ^, LD L.).

超低比重리 뽀蛋白

(very low density lipoprotein ^, VLDL.).

및 카이 로마이 크론 (Ohylomicron， Ohyl.)으로 구분 分析 5) 된다.

3)

電氣泳動法

: Lee and Hatch

^{의 改良盧紙電氣泳動}

法6)

cellulose acetate

^{를 支持體로}^{쓰는 方法7)}

Agarose

를 쓰는 方法8)

Polyacrylamid gel

을 쓰는 方法9) 등이 널 리 쓰이 며

Lipoprotein

異常의 大體的얀 分類檢훌로서 널리 5fIJ 用되고 있다. 여기에서는우리나라형펀으로보 아서 비 용 01 안드는

agarose

를 支持體로 쓰는 방볍 을 記述하기로 한다.

4)

免度化學的分析法

: Lipoprotein

은 高分子化合物이므로 當然、히 抗原性윤 갖이고 있어서 특히

Apoli- poprotein

에 관해 서 는 免俊化學的分析法이 應、用된 다.

Apolipop:-otein

이 란 다시 말해 서

lipoprotein

에 서 R읍質部分을 除去한 蛋白部分을 말하며 사람의 血淸에 관해서 는

Apolipoprotein

^A(또는^{α) ，}

Apo 1i popretin

B(또는 껴)，

Apolipoprotein 0

^등^{이 확}^인^{되 어 있}^다.

Apolipoprotein A

는 α-li

poprotein

에 서 脫R읍한 것 이 며

B

는

ß-lipo- protein

에 서

Pre ß-lipoprotein

^{에 서 는}

^A. B.O

가 확인펴 어 있다고 한다.10)

각

A poli poprotein

^{은 抗原性이 달러}^서

Apoprotein A

는

2

개 의 抗原性

Apoprotein B

^{는 한개}^{의 抗原性，}

Apoprotein 0

는 적 어 도

3

개 의 抗原性部分을 갖이 고 있다고 한다. 그런데 蛋白部分에만 抗原性이 있는것이 아니 라 眼質部分에 도 一部抗原性이 있 어

lipoprotein

과

a poli poprotein

의 抗原性이 꼭 -→致된다고는 믿지 않 고 있다. 免홈學的分析으로 가장 흔히 使用되는 것은

Ouchterlony

품，免、度電氣泳動法，沈降反應、 (ß-Lipo

test

등) 등이 있다.

閒質에 關해서 보통 분석하는 방법으로서는 몇가지 方뽑으로 大別할 수 있는데 그中 하나는 血淸中에 存 tE하는 眼質成分을 子先抽出하고 그 抽出波中에서

phospholipid , cholesterol , neutral fat

등을 分析하는 方

法이 며 다른 하나는

lipoprotein

을 어 떤 方法으로든지 分劃하고 各己分劃中에 存在하는 間質構成成分을 化學的으로 分析하는 方法이 며 또 다른 方法으로서 는 各己의 R읍質成分을

Gas chromatography

^또는

Thin layer chromatography

로 分析하는 ]方法이 現在利用된 다고 할 수 있다.

(Agarose gel

電氣泳動法)

Agarose

는 違類、에 서 얻 은 多續類

gelose

의 主成分으로 [01Z^H1405(OH)4Jπ 의 基本構造를 갖고

ß- D-galactopyranose

^와

3 , 6-anhydro

α-L

galactopyranose

가 서 로 結合한 線狀構造를 갖인 物質 이라고하며 이미 蛋白體등의 電氣泳動用으로 아주 優秀한 支持體라고한다. Agarose 는 白色紹末로 供給되 며

70"-'80

⁰

0

의 水溶淑中에 서 찰 溶解되 며

Gel

化펀 다.

경 험 에 의 하면

Agarose gel

은

Noble agar

보다 아주 越等히 分離能이 좋은 支持體이 기 때 문에

Pre ß-lipop-

rotein 의 分離가 잘 된다. 그러므로 Agarose 릎 支持體 로한 여머가지 方法의 電氣泳動法이 發表되어 있어서 여 기 에 서 는

Noble

의 方法，

Rapp

等의 方法，置醒等의 方法을 基魔로하여 筆者의 經驗에 비 추어 좀더 分離가 잘 된 述式과 意見을 記述코져 한다.

1.

材料

Veronal

援衝波은

barbital sodium 10.3gm. barbital 1. 84gm

를

1 , 000ml.

의 E훤留水에 녹여

pH 8.6 Ion

^彈度 0.05 의 繹衝W찾을 만들어 使用하었다.

Agarose

는 美國

Sigma

會社의 것 을 購入하여 使用 하였다.

固定波은

75% ethyl alochol

에 5% 가 되 도록

acetic

acid 를 넣었다.

業色波은 美國

Sigma

會社의

Oil red 0 O. 4gm.

를 500ml. 의

ethyl

alcohol 에 넣어 100⁰0 로 加熱、하면서 樓控，充分히 溶解시 킨후

45

⁰

0

로 冷去n되 도록 放置하 었다가 37⁰0 의 incubator 에 넣어 하룻밤 두었다가 다 음날 다시

45

⁰

0

로 加溫하고 保溫 깔데 기 로

40

⁰

0

以下 가 되지 않게하며 여과한 후 橋色搬에 넣어

37"-'39

⁰

0

의

incubator

^에

•

넣 어 保管하며 이

Oil red 0

館和被온

1

個月間동안만 使用하였다. 이 方法은 原랩에 準한 方法이였다.

Brom phenol blue 1 %

水溶波은 電氣泳動距離確認用으로 使用하였다.

泳動裝置는 水平型泳動裝置로서 150mA 의 出力能力 이 있는 것을 使用하었다.

Densitometry

는

Beckman microzone

densitometer를 使用하였다.

2. Agarose gel plate

의 준비

: 100ml. elenmyer flask

에

agarose O. 4gm

를 넣 고 여 기 에

Veronal buffer - 2 4 -

‘

(3)

50ml. 를 넣는다. 이 Flask 전체를 處方用 100g 天쯤으 며 chylomicron 은 原點에 머무른 상테로 梁色된다.

로 重量을 알아낸후

flask

內의

agarose

를 加熱、하여 溶

7. Lipoprotein

梁色灌度의 測定

:

解시 킨다. 完全히 녹았으띤 증말되 어 감소된 重量만큼

Beckman

의

microzone densitometer

500mμ∞ 520mμ 薰潤水를 추가한 후

microscopic slide glass

를 水平안 으로

chart

上에 樓度블 作成하여 成績을 얻 었 다. 置醒 table 장에 必要한 放數만큼 準縮하고

slide glass

1 板當等은 8cmX11cm 의

gel

plate 플 썼으나 우리나라에서

2ml.

의 뜨거 운

agarose

溶波을 注加하여 全平面에 고루 는 앓은 짧子板을 얻 을 수기- 없 고 또한

Densitometer

퍼져 水平이 되도록 하고 擬固시킨다. 이때 室溫이 너 에는 1mm 以下의 유리판이랴야 densitometry 가 됨으 무 차서

slide glass

가 冷패되 띤 고르게

agarose pla te

가 로 밟은

microscope slide glass

플 이 응하였 다. 다음의 만들어 지 지 않으므로 若千

slide

블 加熱하여 쓰는것 도 그림 은 한 愈體의

densitometer curve

이 다.

必、喪하다.

3.

可檢物注入用 홈의 作成

:

어느정도 時間이 經過되 연

ararose

가 擬固되 는데 癡固되 기 前에

slide glass

끌에서 2cm 위치에 福

1mm.

長 5mm 의 두개의 흠을 일 직 선 으로

slide glass

短端을 가로질 르게

aluminum

板 으로 세워 흠이 생기도록하여 擬固시킨다. 그러면

slide

glass

一放에 二A의 可檢物을 電氣泳動할 수 있게된다

이 때 흠을 만드는 位置는 표確히 一定하게 되 어 야한다 萬一位置가 달러 지 면 分劃位置評價에 많은 支障을 이 르킨다. agarose 가 完全히 굳었요연 aluminum 板을 除去한다. 이 홉에 可檢血淸 5"'10μl 를 넣 는다.

4.

뿔혔泳動:

Gel plate

를 電氣泳動用

Chamber

에 놓는다.

slide

兩端은 約 5mm 가량 2 板의 여과지로 덮어 績衝波과

Gel

이 電氣的으로 連結이 되 도록한다.

1

板의

slide

glass

當

5mA

의 電流가 通하도록한다. 筆者의 整流器

로서 는

130 volt

의 電壓이 되 었 다. 히〈動時間은 40:分間 하였드니 約 3cm 가량 移動된다. 電氣泳動中의 發熱은 大端한 것은 아니었오나 夏節에 室溫이 35⁰C 를 오르 내 리 는 때 는

5"'10

⁰

C

의 冷藏庫에 서 泳動하였다. 鍵衝 찌찾은 泳動때 마다 電極을 交代록 바꾸어 使用하여

6"'8

벤 使用하였다. 電氣泳動을 할때

slide glass(gel plate)

는 7 校를 념지 않게 6"'7 板를 한벤에 하〈動하였으므로 12∞ 14 名을 泳動할 수 있었다. 치우친 흠은

cathode

쪽으로 연결한다.

5.

固定 및 乾操

:

固定波에

30

分間 담금 후 싣 온 "'90⁰C

01

하에 서 水平 으로 놓아 건조시켰다.

6.

梁色:

Oil red 0

의

60% ethyl alcohol

館和波에

gel plate

플 담근후

oil red 0

액이 薰發하여 鎭失되지 않게 密閒한후

37

⁰

C

의

incubator

에 서

15

時間梁色하였다. 梁色이 끝나면

Oil red

0 波에서 꺼낸후 通風에 건조시킨 다.

lipoprotein

은 α-lipoprotein，

pre-ß-lipoprotein , ß-li poprotein

의 順序로 移動되 며 붉은 色으로 榮色되

‘/"、-

C/7，한 β ~L.p‘ Preß~L.p‘ cJ. ~L.;o'

(考按)

1. Gel plate:

Gel plate

의 두깨 는

slide glass

에

2ml.

를 놓면 約

1mm

의 두깨 로 되 는데 一般的으로

gel plate

의 두깨 가 두꺼우띤 分畵u 아 뚜렸하지 못하고

gll

plate 가 밟으면 分劃은 分羅가 잘 편다. 그러 나

cellulose acetate

나

Pole-E fllm plate

와 같이 商品化펀 plate(支持體)를 쓰 지 않고 自家製의

plate

는 밟게 만드는데 에 도 限度가 있으므로

slide glass 1

板에

agarose

1ml. 以下는 펴 기 어 렵다• 1ml. 의 gel 로서도 分離가 찰되는 泳動像을 얻을 수 있다.

Gel 의 禮度는

1. 2% 1. 0% 0.8%

0.6%의 순서로 만 들아

gel

plate 를 만들어 寶施하였더니 灌度가 높으면

- 2 5 -

(4)

分훨l의 分離가 좁아 좋지 않았다. 없어 앞으로의 改良이 기대된다.

反面 0.6%의

agarose

樓度는 分離는 넓 게 잘 되 나 (績論)

取됐上 부서 지 는 일 이 많아서 0.8% 의

agarose

灌度가

Lipoprotein agarose

電氣泳動法은

cholesterol , trig-

適當하여 筆者는

0.8%

灌度로 施行하고 있 다.

lyceride , phospholipid

치 를 참고로 하여

Lipoprotein

의

2.

檢體注入用홈 各分劃이 잘 分離되 고 短時間에

hyperlipoproteinemia

原法에서는 1. 5mm 福 15mm 長의 흠을

operating

의 phεnotyping 이 쉽게 되므로 검사질에서 많이 利用 knife 로 切斷하여 만든다고 하였다. 그렇게 홈을 만들 할 수 있는 좋은 방법이라고 생각펀다. 以上은 Lipopr- 어 泳動하였더니 電氣泳動途中切斷되어 通電이 안되 otein 의 아주 기본적 초보적 지견을 간단히 적었으므 는 境遇가 생기고 泳動像 01 가끔 완곡되어 分離되는띠l 로 앞으로의 좋은 方法이 말표될 것을 기대한다.

가 많아 檢體量에 支障이 없는 限 흠을 적게하여 通電 이 圓濟하게 되 도록하여 좋은 梁色結果와 分離能을 얻 을 수가 있 었 다.

Aluminum

板은 血淸을 注入하기 直前에 除去하여 야지 오랜 시 간이 경 과되 면 sample 흠에

buffer

액 이 스며 틀어 血淸量이 적 게 注入된 다. 原法에 서는 血淸과 agar 와룹 굳기 걱전에 섞 어서

Gel plate

홉에 注入하여 해〈勳하고 있、었으니- 筆者는 檢體의 變性 을 우려하여 血淸-만 넣어 泳動하였다.

3.

題짧泳動은 40分에 完 T 펌 으로 血淸의 變性을 월 大限度로 막을 수 있는 長點이 있다. 또한 한번에 12∞

14 檢體를 處理할 수 있음으로 8 時間의 勳務時間中에 100 檢體以上을 해낼 수 있어서 一般檢호에 利用이 可能하다.

4. agarose

支持體로

lipemia

가 심 하고

chylomicron

이 많은 檢體를 電氣泳動하였드니

p

re-껴-lipoprotein 과 原點간에 分離가 不確實한

trailing

이 빨장게 梁色되 었 다. Hulley8)等도 이 런 일 이 었 다고 말하고 있 다.

5.

chylomicron 에 關해서는 原點에 있고 移動。1 안 되므로 正確한 灌度測定이 애미}하다고 느껴치며 梁色途中 이 탈이 있을 수 있다고 생 각된다. 그러므로

agarose

만으로는

chylomicron

에 는 滿足한 方‘法이 라고는 할 수

Refrences:

1) Macheboeuf , M.: BuIl. Soc. Chim.

Bi이.

Agarose Electrophoresis

:

1973

Agarose Electrophoresis

Lipoprotein

Protein

ß-globulin

Lipoprotein

cholesterol ester , free cholesterol , neutral

Triglyceride

phospholipid

free fatty acids

Phospholipid(20-30)l Phospholipid ,

molesteroI(17-30) |

,

nonesterifld

cholesterol

phospholipid. Neutral fat

Neutral fat

Lipoprotein

훨灌짧劃에 의 | 훨환b짧짧劃에 | 훌뚫쫓뚫짧몽 | 좋뽑할 빨휠짧鍵| Lipoprotein

HDL

cholesterol (46) B (20-25)

LPL Sf. 0-20 VLDL Sf 20-400 Chylomicron

Neutral fat(50) C>B))(A) (1 0)

pre ß-Lp

Neutral fat(83)

Asp ,

N

C

Thr ,

N

Apolipoprotein (Sasaki

C))A (2) Chylomicron

1)

:

Lipo-

4

Li poprotein , ß-Lipoprotein , Pre ß-Lipoprotein

4

Lipoprotein

Lipoprotein

- 2 3 -

Lipoprotein

Lipoprotein

Lipoprotein

lipoprotein

Dextran-sulfate

Heparin -Oa

2)

- Lipoprotein

Lipoprotein

density lipoprotein , H. D.L.).

(low density lipoprotein , LD L.).

(very low density lipoprotein , VLDL.).

3)

: Lee and Hatch

cellulose acetate

Agarose

Polyacrylamid gel

Lipoprotein

agarose

4)

: Lipoprotein

Apoli- poprotein

Apolipop:-otein

lipoprotein

Apolipoprotein

Apo 1i popretin

Apolipoprotein 0

Apolipoprotein A

poprotein

B

ß-lipo- protein

Pre ß-lipoprotein

A. B.O

A poli poprotein

Apoprotein A

2

Apoprotein B

훨灌짧劃에 의 | ^{훨환b짧짧劃에} | ^{훌뚫쫓뚫짧몽} | ^{좋뽑할 빨휠짧鍵|} Lipoprotein

density lipoprotein ^, H. D.L.).

(low density lipoprotein ^, LD L.).

(very low density lipoprotein ^, VLDL.).

^A. B.O