Volume 12, Number 1, June, 2009
※ 통신저자: 김 종 옥
대전광역시 중구 대흥동 520-2 가톨릭대학교 대전성모병원 병리과
TEL: 042) 220-9530 FAX: 042) 221-0429 E-mail: [email protected] 접수일: 2009년 3월 19일, 게재확정일: 2009년 5월 27일
회전근개 파열 환자에서 회전근개 건의 세포고사와 P53, Bcl-2, Bax, JNK-1 발현과의 관계
가톨릭대학교 대전성모병원 정형외과, 병리과*, 방사선 종양학과**
지종훈∙장성순**∙김영율∙김종옥*∙장동균
= Abstract =
Expression of P53, Bcl-2, Bax, and JNK-1 in Relation to the Apoptosis of the Ruptured Rotator Cuff Tendon
Jong-Hun Ji, M.D., Seong-Soon Jang, M.D.**, Young-Yul Kim, M.D., Jong-Ok Kim, M.D.*, Dong-gune Chang, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, Pathology*, and Radiation Oncology**, College of Medicine, Catholic University of Korea, Daejeon St. Mary’s Hospital, South Korea
Purpose: The causes of rotator cuff tendon tear were excessive overuse, aging process and impingement syndrome and a lot of research of these factors have been performed. But molecular study of cuff tear or apop- tosis of rotator cuff tenocyte is not done until now. In this study, the apoptosis level and apoptosis-related gene expression were investigated in the specimens from the torn margin of a rotator cuff tear, and compared with those from normal portion.
Materials and Methods: Among patients who underwent arthroscopic shoulder surgery between April 2008 to August 2008, 15 patients with complete rotator cuff tear was investigated. These were 10 men and 5 women.
The age were from 48 years to 76 years old (average 61.5 years). The contol group were 2 patients with intact subscapularis tendon. Patients with impingement syndrome, partial tear or tendinitis were excluded from the design of the study. Tendon specimen in the tear margin of supraspinatus or infraspinatus tendon was evaluated using Hematoxylin-Eosinophilic stain, TUNNEL assay and immunohistochemistry for p53, Bcl-2, Bax and JNK1 were performed.
Results: TUNNEL assay was positive in 5 cases of the 15 specimens. In these cases, 5.4% of the cells were positive. The apoptosis-related gene such as p53, Bcl-2, Bax and JNK-1, and tear size were evaluated. These correlations were evaluated using a correlation analysis of Spearman correlation analysis. Spearman correlation coefficient between apoptosis and bcl-2, and between apoptosis and p53 were 0.625 and 0.71, respectively.
These p values were 0.01 and 0.003, respectively. Spearman correlation coefficient between p53 and tear size, and Bax and tear size were 0.58 and 0.76, respectively. These p values were 0.02 and <0.001, respectively. The apoptosis of control group in normal subscapular tendon is zero.
Conclusion: The increased apopotic index was correlated with increased bcl-2 and p53 gene in Rotator cuff tear patients. The larger tear showed increased p53 and Bax gene expression. Further research in this area will need to reduce apoptosis in the development of the rotator cuff tear.
Key Words: Rotator cuff tear, Apoptosis, P53, Bcl-2, Bax, JNK-1.
서 론
최근 사회의 고령화와 함께 스포츠 등의 활동이 많아지며 어깨 관절의 질환의 빈도수가 증가하고 있으며 이들 어깨 질환들 중에서 회전근개 질환은 가장 흔한 질환중의 하나이다16). 특히 MRI등의 진단 기구의 발전과 함께 관절경 등의 치료 기술 의 발달로 인하여, 회전근 개 파열 환자의 치료의 빈도는 크게 증가하고 있다14). 초기에는 약물 치 료나 주사 요법, 또는 물리치료 등의 보존적 요법 이 시도되지만 이에 효과가 없는 경우, 관절경하 회전근 개 봉합술이나 견봉성형술 등의 다양한 수 술적 치료가 시도되고 있다. 그러나 봉합되는 회 전근 개 건 자체의 질(tendon quality)에 따라 항상 만족스러운 결과를 보이지는 않는 것으로 되 어있다. 이러한 회전근 개 파열의 원인으로는 건 자체의 퇴행성 변화5), 외상11,12), 과도한 사용15) 및 충돌증후군9,10,18), MMP(Matrix Metallo- preteinase)의 발현3,7,13,17,20,22)
이나 세포 고사 (apoptosis)24) 등 다양한 요인들이 알려져 있다
15). 특히Soslowsky et al.15) 등은 쥐를 이용한 실험에서 과도한 사용으로 극상건이 손상되는 것 을 증명하였다. 현재 이러한 회전근 개 파열의 여 러가지 요인들 중에서 회전근 개 건의 과도한 사 용이나 건 자체의 연령 증가에 따른 변화로 인한 자연적 변성이나 충돌 증후군등에 대한 연구는 많
이 있으나, 분자생물학적 접근이나 건 세포의 세 포고사로 인한 근거에 대하여는 많은 연구가 이루 어 지지는 않은 상태이다. 따라서 본 연구는 이러 한 회전근 개 파열 환자들에서 파열된 회전근 개 건의 경계부위 건을 채취하여 퇴행성 변화의 한 원인으로 세포고사와의 연관성을 정상대조군과 비 교하며, 세포고사 과정에서 중요한 유전자들의 발 현차이를 비교분석 하고자하였다.
실험 대상 및 방법 1. 표본(Sample) 채취
2008년 4월부터 2008년 8월까지 견관절 회전 근 개 파열로 관절경하 회전근 개 봉합술을 시행 받은 환자들 중에서 충돌 증후군, 부분 파열이나 건염등의 환자를 제외하고, 회전근 개 완전 파열 환자 15예를 대상으로 하였다. 관절경 수술시 파 열된 회전근 개 건의 파열단면에서 관절경적 착공 기(arthroscopic punch)로 파열된 건조직을, 약 3 mm×3 mm 크기로 채취하였다(Fig.1). 남자 10예, 여자 5례로 모두 15예의 환자를 대상으로 하였으며, 평균 61.5세(표준편차 8.3세, 48세 이 상에서 76세 미만)였다. 회전근 개 완전 파열 환 자에서 극상건 및 극하건의 파열면에서 관절경적 착공기를 이용하여 조직을 채취하였으며, 대조군
Fig. 1. Athroscopic finding showed large-sized rotator cuff tear and retear after arthroscopic repair.
으로는 회전근 개 파열이 없는 환자에서, 정상적 인 견갑하건 부위에서 관절경적 착공기를 이용하 여 약 3 mm×3 mm 크기의 조직 절편을 채취하 였다.
채취 개수는 정상조직 2예와 완전 파열 환자의 회전근개 조직 15예 등 총 17례를 대상으로 하였 으며, 채취 샘플들은 TUNEL assay와 면역조직 화학염색(Immunohistochemistry)을 위해 파라 핀블록으로 만들어 보관하였는데, TUNEL 염색 전에 먼저 파열된 회전근개 면에서 채취한 조직을 헤마톡실린-에오신염색(H&E염색)를 시행한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 관절경수술시 관찰된 회전근 개 파열의 크기에 대한 정의는 Cofield의 분류4)를 이용하여 소파열 1 cm 이하, 중파열 1~3 cm, 대파열은 3~5 cm로 구분하였다.
2. TUNEL assay
파라핀 포매 조직을 3 μm 두께로 자른 후에, ApopTag plus peroxidase in situ apoptosis detection kit (Chemicon, Billerica, MA, USA)를 사용해 Terminal transferase-medi- ated dUDT-digoxigenin nick end labeling (TUNEL) assay를 시행하였다. 슬라이드를 xylene에 담가 탈파라핀화시킨 후 알코올로 함수 과정을 거친 다음 PBS로 세척하였다. 이어서 Proteinase K(40 ㎍/ml)를 15분 동안 실온에서 슬라이드 위에 도포시켰다. 이어 내인성 과산화효 소의 활성을 제거하기 위해 3% 과산화수소 (H2O2)로 15분간 처리하고 즉시 PBS용액으로 세척한 후 equilibration buffer로 20분간 전처 리 하였다. 다음 과정으로 TdT 혼합액을 슬라이 드에 떨어뜨리고 1시간 동안 37℃ humidified chamber에서 반응시켰다. 그 후 슬라이드를 stop/wash buffer에 10분간 두어 효소작용을 중지 시킨 후 PBS로 세척하였다. 이어서 anti- digoxigenin conjugate 용액과 실온에서 30분간 반응시키고 PBS용액에 세척하여 diethyl aminobenzidine(DAB)을 5분간 처리해 발색반 응을 거쳐 헤마톡실린으로 대조염색을 시행한 후 마운트 액을 떨궈 커버글래스를 덮고 광학현미경 으로 관찰하였다. 핵에 적갈색으로 염색된 경우
양성으로 판독하였으며 현미경 200배 배율에서 모든 세포중에서 양성인 세포의 개수를 세어 백 분율로 계산하였다.
3. 면역조직화학검사
세포고사 과정에서 중요한 p53, JNK1, Bax, Bcl-2 단백질들의 발현을 면역조직화학검사를 통 해 분석하였다. 먼저 포르말린에 고정하여 파라핀 포매된 조직을 3 μm의 두께로 절단하여 슬라이드 에 고정시킨 후 자일렌(xylene)을 이용하여 파라 핀을 제거하고 알코올로 함수(hydration)시켰다.
이후 조직 내에 감추어진 항원을 노출시킬 목적으 로 10 mmol/L citric acid buffer 용액에서 10 분간 autoclave로 가열시켰다가 실온에서 20분 간 식혔다. 내인성 과산화효소를 차단하기 위하여 3% 과산화수소(H2O2)로 처리하고 비특이적인 염 색을 예방하기 위해서 protein blocking agent로 10분 내지 15분간 전처치하였다. 일차항체 anti- p53, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-JNK1 mon- oclonal antibody(Santa Cruz, CA, USA)를 약 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 수세를 거쳐 서 이차항체(polyvalent biotinylated anti- immunoglobulin, Santa Cruz, CA, USA)를 약 20분간 반응시키고 발색시켰다. 이어서 Strep- tavidin-peroxidase를 10분간 도포시키고 PBS buffer를 이용하여 수세한 후 AEC Chromogen Kit로 4-5분간 발색시킨 후, 헤마톡실린으로 대조 염색을 시행하였다. p53은 핵내에 5% 이상 적갈 색으로 염색된 경우 양성반응으로 평가하였고, JNK-1, Bax, Bcl-1는 세포질에 적갈색으로 염 색된 경우 양성으로 판독하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 위하여 SPSS 프로그램 버전 12(Statistic Package for the Social Sci- ence, Chicago IL Version12)를 사용하였다.
면역조직화학검사를 통하여 시행한 4가지 유전 자들의 발현정도, TUNEL assay양성결과와 수술 시 관찰된 회전근 개 파열의 크기와의 상관관계를 Sparman correlation analysis(1-tailed)를 이
용하여 분석하였다. 통계학적 유의성은 p<0.01을 의미 있는 것으로 분석하였다.
결 과
2008년 4월부터 2008년 8월까지 본원 정형외 과에서 견관절 회전근 개완전 파열로 수술한 15 예의 환자들로, 대파열 남자 2예, 중파열 5예중 남자 4예, 여자 1예였다. 소파열은 8예로, 남자는 4예, 여자는 4예였다. 회전근 개 조직의 파라핀블 록을 이용한 헤마톡실린-에오신 염색, TUNEL 염색과 면역조직화학검사의 결과는 다음과 같다
1. 헤마톡실린-에오신 염색(H-E stain).
정상 회전근개 건조직은 세포수가 적은 섬유연 골조직(hyalinizing fibrocartilaginous tis- sue)로 구성되어 있다. 파열된 회전근개면에서 채취한 조직을 헤마톡실린-에오신 염색을 시행한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 광학현미경 소견 상 표본은 15예 모두 정상조직보다 호산성이 적 게(less eosinophlic) 관찰되어 퇴행성 변화가 있는 것으로 보았으며, 3예에서 모세혈관 크기의 혈관증식과 길쭉한 섬유모세포(fibroblast)가 성 글게 혹은 중등도(sparsely or moderate degree)로 증식하였다. 2 예에서 관절활액막 아
래에서 한두개의 림프구나 대식성세포와 유사한 세포가 있었는데 정상수준 정도이고 염증으로 진 단할 만큼 많은 수의 염증세포는 관찰되지 않았 다. 2예에서 세포를 동반하지 않은 에오신염색상 을 띄고 섬유성과 유사한 물질의 침착(fibrinoid deposit)이 있었다(Fig. 2).
2. TUNEL assay
총 15예의 조직절편 중 5예에서 양성으로 관찰 되었다. 양성 5예 중 2예에서는 몇 개의 세포만 양성으로 관찰되어 약 1%으로 평가하였고, 2예 에서 10%, 그리고 1 예에서 5%정도 관찰되었 다. 총 5예에서 평균 5.4%의 빈도로 TUNEL 염색 양성인 고사세포가 관찰되었다(Fig. 3).
양성인 5예을 성별로 분류하면 3명이 남성, 2 명이 여성이었고, 파열건의 크기별로 살펴보면 3 예가 중파열이었고 2예의 소파열에서 TUNEL assay 양성반응을 보였다. 대조군으로 검사한 견 갑하근에서는 모두 음성으로 관찰되었다. 또한 Bcl-2, p53, Bax, JNK-1 면역염색에서 수술 시 관찰된 회전근 개 파열의 크기, 4가지 세포고 사 관련 유전자들, TUNEL assay 양성결과와의 상관관계를 Spearman correlation analysis를 이용한 분석결과, 세포고사에 대하여 Bcl-2와 p53이 양의 상관관계를 보였다(p value=0.01, P
Fig. 2. (A) Degenerative changes of collage bundles were seen in H&E staining (200×, H&E), (B) Proliferation of capillary-sized vessels and fibroblasts (200×, H&E).
A B
value=0.003). 세포고사와 연령, 성별, 파열의 크기와 Bax와의 유의성은 관찰되지 않았다.
3. 면역조직화학검사
Bcl-2, p53, Bax, JNK-1 면역염색과 TUNEL assay와 유전자에서 회전근 개 파열의 크기와 관련 된 결과는 다음과 같다.
Bcl-2는 3예에서 양성반응을 보였는데, TUNEL assay 양성반응을 보인 2예에서 양성이 었고, TUNEL assay 음성반응을 보인 1예에서 양성반응을 보였다. 회전근 개 파열 크기별 분석을 해보면, 소파열 건에서 2예, 중파열 건에서 1예가 양성반응을 보였다. P53은 1예가 양성반응을 보였 는데, TUNEL assay 양성반응을 보였으며 수술 시 중파열 소견이 관찰되었다. Bax 염색은 2예에 서 양성반응을 보였으며 2예 모두 TUNEL assay 음성이었고 수술시 대파열 소견이 관찰되었다.
JNK-1은 모두 음성반응을 보였다(Table 1).
P53과 회전근 개 파열의 크기와, Bax 단백질 발현과 회전근 개파열크기와의 상관관계 분석에서 Spearman correlation coefficient 는 각각 0.58과 0.76으로 나타났으며, p53과 Bax 유전자 와 회전근 개 파열의 크기와는 관련성이 있는 것으 로 관찰되었다(p value; 0.02, p value<0.001).
그 외 Bcl-2 와 JNK-1 유전자들과 회전근 개 파 열크기와의 상관관계는 관찰되지 않았으며, 세포 고사와 Bax 와 JNK-1 항체발현에 대해 통계학 적 의의는 없었다. 대조군은 모두 TUNEL assay와 면역염색검사에서 음성으로 관찰되었다.
Bcl-2 와 JNK-1의 항체발현과 건파열의 크기에 대한 통계학적 의의는 없었다.
고 찰
회전근 개의 퇴행성 변화에 의해서 회전근 개
Fig. 3. Several cells were positive in TUNEL assay.
Fig.5. Cytoplasmic immunostainings of a few cells were positive for Bcl 2.
Fig. 6. Several cells showed positive cytoplasmic stain- ing for Bax.
Fig.4. Nuclear immunostainings of few cells were posi- tive for p53.
질환이나 건 파열이 유발되는 것은 잘 알려져 있 으나5), 회전근 개 건의 퇴행성 변화의 병태생리에 서 세포 고사의 관여여부에 대한 최근까지 발표된 논문은 드문 실정이다. 최근 몇몇 보고에서 충돌 증후군 환자의 극상건에서 기계적인 충돌 증상이 건의 퇴행성 변화(degeneration) 및 건 세포의 세포고사를 유발하는 것으로 알려져 있으며 또한 퇴행성 건에서 과도한 세포 고사가 관찰된다고 보 고되고 있다18,23-25). 세포고사는 세포군의 수를 조 절하는 정상적인 생리적 과정일 수 있으나, 비정 상적으로 조절된 과도한 세포 고사는 여러 신경학 적 변성질환들이나 류마티스 관절염, 그리고 골관 절염2,8) 등과 연관되어 발견된다. 최근 Yuan 등
24)은 회전근 개 건의 퇴행성변화 과정에서 파열된 건의 세포고사가 관여되고 있음을 보고하였는데, 정상 대조군에 비해 회전근 개 파열 환자의 극상 건에서 2배정도 증가된 세포 고사 세포들을 관찰 하였고, 면역조직화학검사를 통해 이 세포들은 대 개 섬유아세포들임을 확인하여 정상적인 기능을 갖는 섬유아세포 또는 섬유세포 수의 감소로 인해 세포 활성도의 손실과 세포외기질 합성의 감소가 퇴행성 변화를 유도했을 것이라고 보고하였다.
세포고사의 신호전달체계는 크게 DNA 손상 신 호에 의한 p53 증가로 인해 Bcl-2 단백질계의 발 현조절이 일어나 미토콘드리아에서 cytochrome C가 방출되고 Apaf-1, procaspase 9들과 결합 해 apoptosome을 형성한 후 caspase 9를 활성 화시켜 결국 effector caspases가 활성화되는 경 로와 CD95 사망수용체를 통해 caspase 8이 활 성화되어 effector caspases가 활성화되는 경로, 그리고 세포막의 지질이 산화적 손상에 의해 ceremide라는 부산물이 만들어지고 이어서 SAPK/JNK 경로를 통해 effector caspases가 활성화되는 경로로 분류될 수 있다6),19). 그리고 증 가된 세포 고사 과정은 여러 위험인자들에 의해 유도될 수 있는데 건 세포들에서 활성산소물질들 (ROS)이나 과도한 사용으로 인한 반복적인 스트
Table 1. The results of TUNEL assay and immunostaining of bcl-2, p53, and Bax
Age Sex TUNEL assay Bcl-2 P53 Bax Tear Size of tendon
1 48 M - - - - medium
2 68 F + + - - small
3 61 M + - - - medium
4 56 M + + - - smalll
5 76 M + - - - medium
6 67 F - - - - small
7 69 M - - - - small
8 66 M - - - - small
9 54 M - + - + large
10 63 M - - - - medium
11 55 F - - - - small
12 49 M - - - + large
13 50 F - - - - small
14 62 F + - + - medium
15 67 M - - - - small
(+;양성반응, -;음성반응, small; less than 1cm, medium;1-3cm, large;3-5cm) Fig. 7. The immunostaining for JNK-1 was negative.
레스가 세포고사의 유발인자로 작용할 수 있다고 보고되었다6,19,21),23)
.
활성산소물질들과 관련해 Wang 등21)은 정상 건에 비해 퇴행성 건에서 항산화물질인 Perox- iredoxin 5(PRDX5)가 더 많이 발현됨을 관찰하 여, PRDX5가 건의 퇴행성 변화과정 동안 산화 적 스트레스에 대한 방어적 역할을 할 것이라고 보고하였다. 또한 Yuan 등23)은 일차 배양된 인 간 회전근 개 건의 섬유아세포에 H2O2로 산화적 스트레스를 가했을 때, H2O2에 노출된 시간과 용 량에 의존적인 세포고사 유도의 증가현상과 cytochrome C 발현증가로 인한 대조군에 비해 3배 증가된 caspase 3 활성도를 관찰하여, 미토 콘드리아로부터 cytochrome C의 방출 증가를 세포고사 기전으로 설명하였다. 한편 Arnoczky 등1)은 슬개골 건의 섬유아세포들에 반복적인 변형 (cyclic strain)을 가했을 때 세포의 스트레스 반 응과정에서 세포고사 신호전달체계의 상위조절인 자(upstream regulator)인 SAPK 경로가 활성 화되어 JNK 발현이 증가함을 관찰하여, 반복적 인 스트레스가 세포고사 유발 및 건의 퇴행성 변 화와 연관되어 있을 것이라고 보고하였다. 본 실 험에서는 회전근 개 파열 환자의 조직절편에서 정 상 대조군에 비해 증가된 세포 고사 빈도를 TUNEL 염색으로 확인하였으나, 면역조직화학 검사를 통한 세포고사 관련 유전자 발현의 분석에 서 각 신호전달체계의 상위조절인자인 p53과 bcl-2의 발현이 관찰되었다. 단 Bcl-2계 단백질 들 중 대표적인 항아포토시스성(antiapoptotic) 유전자인 p53과 아포토시스유도성(proapoptoic) 유전자인 Bcl-2가 동시에 관련성을 보인 점이, 보 편적으로 종양에서 보이는 현상인 p53 증가와 Bcl-2감소되는 양상과는 다르게 관찰되었다. P53 과 Bax의 발현양상에서 파열의 크기가 클수록 양 의 상관관계를 보였으므로, 파열의 크기와 항아포 토시스성(antiapoptotic) 유전자인 p53과 아포토 시스유도성(proapoptoic) Bax 유전자 발현과의 연관성을 확인할 수 있었다.
단 이번 연구의 제한점으로 실험에서 표본수가 15예의 적은 수였으며, 항아포토시스성 유전자와 아포토시스유도성 유전자가 동시 발현된 점에 대 해, 이는 추후 더 많은 표본의 추가 연구가 필요
할 것으로 판단된다. 또한 대파열 환자에서 건 봉 합술 후 재파열이 흔히 관찰되는 것으로 알려져 있어, 추후 재파열되는 회전근 개 조직에서도 검 사를 시행하여 상관관계를 분석하여 보는 것도 필 요할 것으로 생각된다.
결론적으로 본 연구에서 회전근 개 파열 조직에 서 정상 대조군 조직보다 증가된 세포고사 빈도를 관찰하였고, p53과 Bcl-2 유전자가 관련성을 보 였으며, 파열의 크기가 클수록 p53과 Bax 발현 이 증가됨을 확인하였다. 세포고사는 회전근 개 파열의 여러가지 원인들 중의 하나로 생각되며, 이 분야에 대한 추가적인 연구들이 필요할 것으로 판단된다. 이는 회전근 개 파열 환자에서 원인 규 명과 함께 세포고사를 줄이기 위한 치료 약제의 개발에도 크게 기여하리라 사료된다.
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