접수일：2008년 3월 21일, 승인일：2008년 4월 18일
책임저자：신 수 156-707 서울시 동작구 신대방 2동 425번지 보라매병원 진단검사의학과 TEL: 02) 840-2608, FAX: 02) 840-2742, E-mail: [email protected]
본 논문은 서울대학교 산학협력단 주관 “난치병 치료를 위한 제대혈 줄기세포 실용화 사업”의 연구비 지원에 의해
기증 제대혈 검체의 Mycoplasma 오염률 확인
노은연1,2ㆍ윤종현1,2ㆍ장지영1ㆍ황규리3ㆍ송은영4ㆍ신 수1,2
서울특별시립 보라매병원 공여제대혈은행1, 서울대학교 보라매병원 진단검사의학과2, 산부인과3, 건국대학교 의과대학 진단검사의학교실4
= Abstract =
Analysis of Mycoplasma Contamination in Donated Cord Blood Units
Eun Youn Roh1,2, Jong Hyun Yoon1,2, Jee Young Chang1, Kyu Ri Hwang3, Eun Young Song4, Sue Shin1,2
Allcord1, Departments of Laboratory Medicine2 and Obstetrics and Gynecology3, Seoul National University Boramae Hospital, Department of Laboratory Medicine, Konkuk University College of Medicine4, Seoul, Korea
Background: Mycoplasma spp. occasionally colonize the genital tract and these organisms are some of the most important contaminants in cell culture laboratories and cell banks. We analyzed the Mycoplasma contamination rates in the donated cord blood units (CBUs) before cell processing.
Methods: A total of 151 CBUs that were donated with informed consent (November 3rd∼December 28th, 2006) were randomly selected and enrolled in the study. We performed blood culture and Mycoplasma DNA PCR assay with using samples from the collection bags before processing.
Results: All of the CBUs were obtained from full-term (gestational age 37∼42 weeks) deliveries. Two units showed positive results on blood culture however, Mycoplasma DNA is not found in the tested samples.
Conclusion: The contamination rates of Mycoplasma in the CBUs, which are donated from the mothers who have full-term delivery and no pregnancy complications, are extremely low. The donated CBUs could be used in culture and for an expansion process without concern of incurring pre-processing Mycoplasma contamination.
The rate of Mollicute contamination in the CBUs could become clear with the results of performing Ureaplasma assay. (Korean J Blood Transfus 2008;19:9-14)
Key words: Cord blood, Mycoplasma, Contamination
서 론
Mycoplasma는 지금까지 알려진 가장 작은 독립
생활(free-living) 생물체로 세포벽이 없어서 beta-
lactam 항생제에 저항성을 가진다. 인간에서 분리
되는 16종의 Mycoplasma 중에서 7종(M. hominis,
M. fermentans, M. primatum, M. genitalium, M.
spermatophilum, M. penetrans U. urealyticum)은 비 뇨생식기에 상재하는데 양수내 감염이 있는 여성 의 30%에서 M. hominis가 검출되었고
1)조산을 비 롯하여 임신 및 분만과 관련된 여러 병적 상태와 Mycoplasma의 연관성이 알려져 있다.
2)Mycoplasma는 임상적인 중요성 외에 세포배양 시 오염의 주요 원인으로서, 세포배양 실험실이 나 세포은행의 조사에 따르면 배양되는 세포의 15∼35% 정도가 Mycoplasma에 오염된다고 보고 되었으며, 배양 세포에 Mycoplasma 오염이 있는 경우 성장속도 저하, 형태학적 변화, 염색체 변 이, 싸이토카인 발현의 유도 또는 억제, 막 구성 의 변화, 아미노산 및 핵산대사의 변이 등을 유발 하여 실험 결과의 신뢰성을 떨어뜨리고 생물학적 산물을 폐기하는 경우를 초래한다. 하지만 오염 시의 변화가 잘 드러나지 않고 현미경 관찰로 확 인이 어려우며 성장조건이 까다로워 일상적인 미 생물 배양검사로는 검출되지 않기 때문에 다른 세 균 및 진균 오염과 달리 간과하는 경우가 흔하다.
3,4)Mycoplasma의 검출에는 배양, 혈청학적 검사, 간접 DNA 염색(Hoechst 33258), Gen-Probe, PCR 등의 방법이 이용되는데 배양은 Mycoplasma의 확진법이지만 영양 요구성이 까다롭고 1∼2주 이 상의 기간이 소요되며, 집락을 현미경 저배율로 관찰해야 하는 등 어려운 점이 많아서, 최근에는 배양법에 비해 민감하고 1일 이내에 결과를 확인 할 수 있는 PCR 방법이 널리 이용되고 있다. PCR 방법을 이용한 Mycoplasma 검출에서 가장 흔히 사용되는 표적 부위는 16S rRNA 유전자의 Mollicute 공통 염기서열이며 이를 이용한 자체 제작(in- house) 검사법이나 상용화된 PCR 키트가 많이 소개되고 있다.
5,6)세포치료센터 및 실험실에서 세포 배양시 My- coplasma 오염의 98%는 다음 몇몇 종- M.
hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans, M.
salivarium, M. hominis 및 A. laidawii -에 의하며
7)이 중 M. hominis와 M. fermentans은 사람의 비뇨 생식기에서 발견된다. 제대혈은 태아가 만출된 후 태반이 배출되기 직전(in-utero) 탯줄에서 채취 하므로 비뇨생식기계, 위장관계, 피부의 상재균 오염이 드물지 않으며, 제대혈 검체의 미생물 오 염은 5%에서 많게는 15%까지 보고되고 있다.
8,9)제대혈에는 골, 신경, 내피세포 등으로 분화 가능 한 줄기세포가 포함되어 있어서 조혈모세포이식 외에 각종 난치성 질환의 치료에 이용되고 있으 며, 제대혈 줄기세포의 체외 증식 및 분화에 대한 연구가 활발히 진행되는 추세이다.
10,11)이에 본 연구자들은 비뇨생식기 상재균 오염의 가능성이 있는 제대혈 검체에 대하여 Mycoplasma 오염률을 살펴 저장 제대혈의 안전성을 다시 한 번 확인하고 체외증식, 배양 등 세포치료제 개발 연구를 위한 줄기세포 공급원으로서의 적합성을 평가하고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대상
2006년 11월 3일부터 12월 28일까지 제대혈 기 증에 관해 서면으로 동의한 산모에게서 채취한 제대혈 151검체를 대상으로 하였다. 채취된 양이 기준에 미치지 못하여 접수가 거절된 제대혈 75 단위와 저장에 적합한 71단위, 검사결과 이상으 로 부적합 처리된 제대혈 5단위를 대상으로 하였 다.
2. 방법
1) 채취
서울특별시립 보라매병원 의학연구윤리심의
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Fig. 1. Electrophoretic analysis by PCR to detect Mycoplasma. Lane 1, 100 bp DNA marker; Lane 2, Positive control; Lane 3, Negative control; Lane 4∼
13, Cord blood samples.
위원회(Institutional review board, IRB)의 심의를 통과한(IRB No. 06-2006-2) 기증 동의서에 자발적 으로 동의 및 서명한 산모에게서 출산시 분만을 담당한 산부인과 의사가 태아 만출 직후 탯줄을 결 찰하고 항응고제(citrate phosphate dextrose adenine, CPDA-1)가 포함된 채취백에 제대혈을 채취하였 으며, 운송 담당자가 이를 실온에서 24시간 이내 에 제대혈은행으로 운반하었다.
2) 미생물 배양 검사
가공처리를 시작하기 전 채취백에서 무균적으 로 취한 제대혈 10 mL를 BacT/Alert SA (호기성세 균 혈액배양병)과 BacT/Alert SN (혐기성세균 혈 액배양병)에 각 5 mL씩 접종하였으며, 통상적인 혈액배양법에 따라 BacT/Alert 자동화 시스템 (bioMerieux, Durham, NC, USA)에서 5일간 배양하 였다. 균이 증식한 경우 그람염색을 실시하였고, BacT/Alert SA는 BAP와 MAC배지에, BacT/Alert SN는 Brucellar agar와 chocolate agar에 계대 배양 한 후 단일 집락을 선택하여 Vitek 카드 시스템 (bioMerieux, Durham, NC, USA)으로 균동정을 실 시하였다.
3) Mycoplasma PCR
세포 배양시 오염을 일으키는 M. arginini, M.
faucium, M. fermentans, M. hyorhinis, M. orale, M.
homonis, Acholeplasma laidlawii를 비롯한 주요 mycoplasma 종들을 검출하도록 제작된 e-Myco
TMMycoplasma PCR detection kit (iNtRON BIOTE- CHNOLOGY, Seoul, Korea)를 사용하였는데, 키 트는 16S rRNA 유전자의 mollicute 공통 염기서열 을 이용한 시발체로 구성되며 제조사의 설명에 따라 다음과 같은 방법으로 검사하였다.
(1) DNA 추출: 제대혈 채취백에서 검체 300μL 를 취한 후 Puregene
ⓇDNA purification Kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하 여 제조사의 지침에 따라 DNA를 추출하였다.
(2) PCR: 제조사의 지침에 따라 i-Star Taq DNA Polymerase (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seoul, Korea) 2.5U, dNTP 각각 250 mM, Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl
21.5 mM, Mycoplasma primer set 각각 10 pmol 및 증류수를 혼합하여 20 μL reaction volume에 맞추고 DNA 100 ng을 첨가 한 후 PTC 0200 (Bio-RAD, CA, USA) thermo- cycler로 94
oC에서 1분간 변성한 후, 94
oC에서 30 초, 60
oC에서 20초, 72
oC에서 1분씩 35 cycle 증폭 하고, 72
oC에서 5분간 다시 증폭하였다. 양성대조 와 음성대조를 함께 증폭하였는데 양성대조 주형 (template)은 키트내의 Mycoplasma genomic DNA 를 이용하였고 음성대조에는 DNA를 첨가하지 않았다. 증폭 산물은 ethidium bromide를 포함한 agarose gel에 100 V, 17분간 전기영동 한 후 267
∼277 bp 밴드 여부를 확인하였다(Fig. 1).
결 과
제대혈 기증은 임신 주수 37주에서 42주 사이의
만삭분만을 한 경우로 한정하였다. 산모의 연령
분포는 30.4±3.1세였고, 신생아의 성별은 남아 73
명, 여아 78명, 자연분만이 108건, 제왕절개를 통 한 분만이 43건이었다. 분만시 문제가 있었던 경 우로는 태변착색의 예가 1건이었으며 3개월 후의 2차 문진결과 산모 및 신생아의 주산기 감염, 염 증 등 임상적인 이상소견은 확인되지 않았다. 전 체 151 단위의 제대혈 중 2건은 산전 진단에서 기 형이 발견되어 접수가 거절되었으며 1건은 임신 초기 양수 파수 의심하여 항생제 치료를 받았으 나 이후 이상소견 없어 정상분만을 한 예였다. 저 장 처리가 실시된 제대혈 76단위에 대한 미생물 배양 검사에서는 2단위의 제대혈에서 각각 citrobacter spp.와 알 수 없는 그람 양성 간균이 동 정되었으나 저장 처리된 제대혈 및 거절된 제대 혈에서 Mycoplasma PCR 검사는 모두 음성이었다 (Fig. 1).
고 찰
Mycoplasma는 성병의 징후가 없는 50세 이전의 성인 여성에서 40% 가량 발견되는 생식기계 상재균 이며 건강한 성인 혈액의 2∼15%에서 Mycoplasma 유전자가 검출되었다는 보고가 있다.
12)제대혈의 Mycoplasma 오염률은 만삭분만 산모를 대상으로 한 연구는 보고된 바가 없으며 조산아를 대상으 로 조사된 1예만이 보고되었는데, 조산아 제대혈 배양시 23%에서 U. urealyticum 또는 M. hominis가 검출되었고, 배양 양성인 조산아에서 음성인 조 산아에 비해 자궁내 감염, 염증소견 및 신생아 전 신성 염증반응 증후군(neonatal systemic inflamma- tory syndrome)의 빈도가 높았다.
13)분만 후 채취 되는 제대혈은 비뇨기, 생식기, 소화기 및 피부의 상재균 오염 가능성이 적지 않을 것으로 예상되 는데, 본 연구에서는 Mycoplasma PCR 양성을 보 이는 제대혈 검체가 없어 Mycoplasma 오염율은 매우 낮은 것으로 보인다. 2006년 11월부터 2007
년 5월까지 본 연구와 동일한 방법으로 채취하고 처리한 제대혈 895 단위의 자료를 분석한 결과 2.3%에서 미생물 오염이 확인되었는데 이는 다 른 연구자들의 5∼15%보다 현저히 낮은 결과로 분만 및 채취과정 중 제대혈의 미생물 오염이 예 상보다 낮은 값을 보였고, 따라서 Mycoplasma 오염 율도 낮은 것으로 생각된다. 산모를 대상으로 시행 한 코호트 연구에서 생식기 검체의 M. hominis 양 성율은 4% 내외였으나
14)Mycoplasma는 조산, 사 산 등의 합병증과 관련이 알려져 있고 본 연구의 대상군에는 조기 양막파수, 조산 등의 임신 관련 합병증의 예가 거의 포함되지 않았으므로 임신 주수 37∼42주의 만삭분만으로 대상자를 한정하 는 기증제대혈의 Mycoplasma 오염률은 매우 낮 은 것으로 생각된다.
세포배양시 Mycoplasma 오염은 중요하고 흔한
문제로 다른 미생물 오염처럼 검출이 용이하지
않기 때문에 오염이 확산되는 것을 막지 못하여
피해가 커질 수 있고, 특히 줄기세포를 이용한 세
포치료제 개발 연구 등에서는 경제적으로 큰 손
실을 야기할 수 있어서 세포은행이나 세포치료제
관련 GMP 시설에서는 매우 주의를 기울이는 부
분이다. 원래 적출물로 폐기되던 제대혈이 1990
년대 이후 조혈모세포 공급원으로 주목을 받기
시작하여 최근에는 조혈모세포의 체외 증폭에 관
한 시도가 이어지고 있으며, 제대혈에 골, 신경,
내피세포 등으로 분화 가능한 줄기세포가 포함되
어 있음이 확인되면서
10,11)조혈모세포이식 외에
각종 악성 및 양성 질환의 치료에 제대혈 이용이
증가되고 있다. 이에 따라, 제대혈은행과 연계한
생명공학 회사들이 활발히 연구에 참여하여
15)가
까운 미래에 제대혈이 체외배양과 분화를 통해
세포치료와 재생의학 분야에서 중요한 줄기세포
공급원이 될 것으로 예상된다. 제대혈은 골수나
배아와 달리 윤리적인 문제는 최소화하면서 많은
잠재적 공여자를 확보할 수 있는 장점이 있지만 분만 과정과 연계된 채취의 특수성 때문에 세포 배양 및 가공 이전에 이미 Mycoplasma 오염이 있 을 가능성을 배제할 수 없는데, 실제로 세포배양 에서 발견되는 Mycoplasma 오염은 95% 이상이 M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans, M. salivarium, M. hominis 및 A. laidawii에 의하며
7)이 중 M. hominis와 M. fermentans은 사람의 생식 기에서 분리되는 종으로 알려져 있다.
본 연구에서 PCR 검사법을 이용하여 확인한 결과 세포배양 등의 실험적 조작을 행하기 전 채 취상태의 제대혈 검체에서 Mycoplasma 오염률은 극히 낮았으며 이는 Astori 등이 제대혈 체외 증 폭 연구에서 Mycoplasma 오염이 관찰되지 않았 음을 보고한 것과 일치하는 소견이다.
16)본 연구 결과 검체의 채취 특이성에도 불구하고 대상자가 한정되는 기증제대혈에서는 Mycoplasma 오염의 가능성은 희박하므로 체외 세포배양 및 세포치료 제 개발을 위한 세포 공급원으로 적합하다고 할 수 있겠다. 더불어 Mycoplasma 보다 조금 더 흔한 생식기 상재균인 U. urealyticum 및 U. parvum
17)의 오염률을 함께 확인해 본다면 제대혈에서 Mollicute 오염률에 대해 보다 명확한 결론을 제시할 수 있을 것으로 생각한다.
요 약
배경: Mycoplasma는 흔한 생식기 상재균인 동 시에 세포배양이나 세포은행에서 매우 중요한 오 염원의 하나로 저자들은 본 연구를 통해 가공처 리를 거치지 않은 기증 제대혈의 Mycoplasma 오 염률을 확인하고자 하였다.
방법: 2006년 11월부터 12월까지 기증된 제대 혈 중 151 단위를 무작위로 선정하였고, 채취백 에서 취한 제대혈 검체로 Mycoplasma DNA PCR
검사 및 혈액배양검사를 실시하였다.
결과: 대상군 제대혈은 모두 임신 주수 37주에 서 42주 사이의 만삭분만 산모로부터 기증되었으 며, 이 중 2 검체가 혈액배양검사에서 양성을 보 였으나 Mycoplasma DNA는 단 한 검체에서도 검 출되지 않았다.
결론: 임신 중 합병증이 없었던 만삭분만 산모 로부터 기증된 제대혈은 Mycoplasma 오염률이 매우 낮으며, 배양이나 증식에 이용할 경우 조작 전 Mycoplasma 오염의 가능성은 배제할 수 있으 리라 생각된다. 더불어 Ureaplasma 오염율을 함 께 확인한다면 제대혈의 Mollicute 오염에 대한 보다 명확한 결론을 제시할 수 있을 것이다.
참고문헌
