을 생산하는 방법은 특이적이고 정량적이기 때문 에 앞서 언급된 tag의 화학적 또는 효소적 제거시 발생하는 문제점을 해결할 수 있다.
현재 사용되고 있는 친화성 tag나 인테인을 이 용한 재조합 단백질 정제 방법은 항원-항체 결합 을 이용한 면역친화성 단백질 정제 방법과 마찬가 지로 높은 선택적 친화성을 갖고 있으며, 발현 vector 시스템의 개발을 통해 다양한 재조합 단백 질 정제에 응용할 수 있다는 장점을 지니고 있다.
그러나 친화성 tag나 인테인과 융합으로 인한 단 백질의 활성 및 발현율의 저하, 단백질의 변성, refolding의 문제, 값비싼 DTT의 이용 등 해결해 야할 많은 문제점이 있으나 현재 이러한 문제점들 을 해결하기 위한 많은 연구가 수행되고 있어 앞 으로 친화성 tag나 인테인 tag을 이용한 재조합 단백질 분리정제 기술은 산업적 이용뿐만 아니라 재조합 단백질 정제를 위한 가장 보편적인 방법으 로 사용될 것으로 전망된다.
서론 및 배경
1995년 처음 소개된 ‘proteome(단백질체)’이라 는 용어는 어떤 genome(유전체)으로부터 발현되 는 단백질 대응을 의미한다. 활성 단백질 합성이 유도되는 일련의 조절단계에서 proteome은 genome의 마지막 단계의 생성물로 나타날 수 있 다. Genome은 상대적으로 정체적인 것에 반해 proteome은 대단히 역동적인 실체이다. 어떤 세포 의 단백질 조성은 주위환경, 세포의 생리적 상태
(예를 들어, 세포 대사주기 상 위치), 스트레스, 치 료약 투여, 건강상태, 그리고 질병에 따라 변화한 다. 더구나, 다세포 생명체 내의 다른 형태 및 기 능을 갖는 세포들 간의 genome은 비교적 일정하 게 유지되는 반면에 proteome의 구성은 매우 다 를 뿐만 아니라 어떤 순간에 존재하는 한 세포의 proteome은 genome 일부로부터 발현된 것 임에 도 불구하고 매우 복잡한 성분들로 구성된다. 이 것은 아마도 복제능력을 갖는 가장 간단한 독립적 그림 4. Schematic illustration of the intein-mediated
affinity protein purification.
Proteomics /
백세환·변상요*·한종훈**
고려대학교 생명정보공학과, [email protected]
*아주대학교 화학생물공학부, [email protected]
**포항공과대학교 화학공학과, [email protected]
특·별·기·획
인 생명체라도 1,500개 이상의 유전자를 보유하기 때문에 발생하는 생명체의 본질적인 특성이다. 부 가하여, 유전자와 이에 상응하는 활성 생성물 사 이에서 일어날 수 있는 분자변이 예를 들어, suppression, promotion, splicing, 그리고 co-/post- translational modifications와 같은 상당한 변이잠 재력이 존재한다. 이와 같은 복잡성 때문에 pro- teomics(proteome을 연구하는 학문)는 genomics 와 같이 대규모 과학 분야로 인식되고 있다.
구조적 proteome 분석은 생명체의 genome으 로부터 암호화된 모든 주요 단백질의 분리와 sequencing을 의미하며 기능적 proteome 분석은 다른 주요 단백질의 화학적, 생화학적, 그리고 생 물학적 특성의 결정을 의미한다. 즉, 주요 단백질 에 대해 기능적으로 중요한 ‘sequence motives’의 규명이 기능적 proteome 분석의 목적이라 할 수 있다. 이것은 단백질에 대한 아미노산 서열의 결 정뿐만 아니라 더 중요하게는 구조적 변형과 양적 인 변화와 같은 광범위한 영역을 포함한다. 현재 많은 연구실에서 수행하고 있듯이 특별히 관심있 는 어떤 생물학적 혹은 병리학적 과정에 관여하는 단백질들을 탐지하는 연구에서 주로 2차원 전기 영동(2-dimensional electrophoresis, 2-DE) 단백 질 패턴을 사용한다. 조직 단백질의 복잡한 2-DE 패턴에서 이미 알려진 단백질인지의 여부를 조사하 기 위해 gel 상의 단백질 spot들을 mass spectro- metry에 의해 분석한 후 그 데이터를 sequence database와 비교하여 알려진 단백질과 일치하는 지를 조사한다. 이러한 연구가 구조적으로 그리고 기능적으로 proteome을 분석하는데 있어서 수행 되어야 하는 중요한 작업이다.
동물의 혈장이나 대량으로 배양되는 조직의 경 우와는 달리 극미량 세포 혹은in situ 상태에서의 proteome 분석은 극미세 농도로 존재하는 단백질 에 대한 분리와 분석기술이 요구된다. 극미세 단
백질을 취급하기 위해서는 분리/분석도구가 초소 형화되어야 하고 proteome을 구성하는 여러 다른 단백질에 대한 탐침(특이 감응성분 등)의 집적화 가 필수적이다. 대표적인 예로써, proteome 내 알 려진 단백질들을 인식하는 단백질칩 제작과 고속 으로 분석하는 센싱기술을 들 수 있다. 더욱이 미 량의 생체시료를 전처리하여 운반하고 분리과정 을 자동화하기 위해 microfuidics를 기반으로 하 는 bio-microsystem 제작기술의 개발이 병행되어 야 한다. 이러한 다학제간 기술의 결합을 통해 세 포 내 proteome을 분석함으로써 미지의 단백질로 부터 신기능성 생리활성 성분을 탐색하고 궁극적 으로 신의약품 개발이 가능할 것으로 예측된다.
대량 분리/분석
대규모 단백질 특성화를 가능하게 하는 현재의 유일한 방법으로 2차원 전기영동(2-DE) 방법을 사용하는데 우선 단백질을 추출한 후 반고체 medium인 gel(주로, arcrylamide와 agarose의 co-polymer) 상에서 분리한다. 단백질 종류에 따 라 그 표면의 전하분포가 다르므로 먼저 pH 기울 기와 일정 전압차이 하에서 iso-electric focusing (IEF) 방법을 이용하여 1차원 분리를 수행한다.
2차원 분석을 위해, 단백질들을 강력한 음이온성 계면활성제인 sodium dodecylsulfate(SDS)로 처 리하여 분자 간 전하차이를 최소화한 후 일정 전 압 하에서 분자크기에 따라 분리한다. 이와 같은 방법을 이용하여 다른 조직, 세포, 혹은 분화단계 로부터의 2-DE 단백질 분포형태들을 비교함으로 써[그림 1] 다른 생물학적 변수에 따라 단백질들 을 특성화할 수 있다. Western blotting과 함께 glyco- 혹은 phospho-그룹을 특이하게 탐지하는 면역학적 분석법은 post-translation에 의해 변형 된 단백질들의 추적을 가능하게 한다. 단백질의 구조는 2-DE gel로부터 단백질 spot들을 추출하
고 mass spectrometry와 partial sequencing과 같 은 분석기술을 도입함으로써 결정될 수 있다. 이 와 같은 총체적인 전략을 응용함으로써 각개 단백 질들은 상당히 많은 변수들에 대해 특성화될 수 있으므로 다른 단백질 spot들의 특성들을 종합하 여 단백질 그리고 결국 유전자의 기능에 관한 결 론에 도달하게 된다.
예를 들어보면, 어떤 위치에 나타나는 단백질 spot은 뇌에 특이하게 존재하며 태어난 후 성장하 면서 신경세포의 세포막에서 발현되고 나이에 따 라 phosphorylation이 증가되는 경향을 나타낼 뿐 만 아니라 여성보다 남성의 세포에서 더 높은 농 도로 존재한다. 이로부터, 관찰 대상 단백질은 노 화에 관련하여 어떤 역할을 하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 또한 단백질 역할에 대한 정보를 이 용하여 유전자의 위치와 기능에 관한 연구를 수행 할 수 있다.
그러나 2-DE 방법을 이용한 대규모 proteome 분석에서 비교적 고농도로 존재하는 단백질은 탐 지하기 용이한 반면에 대부분 단백질들은 저농도 로 존재할 뿐만 아니라 그 양이 조건에 따라 변화 가 커서 탐지하기 어려운 것으로 여겨진다. 특히 호르몬과 같이 조절에 관여하는 단백질들이 여기
에 속하며 proteome 연구의 중요한 영역으로 인 식되고 있어서 분석방법의 개선과 새로운 분석도 구의 개발이 절실하다. 이와 관련하여 저농도 단 백질의 용해와 추출, 재분리를 통한 농축, high loading, 그리고 고감도 탐지 등 기술개발이 수행 되고 있다.
극미량 분리/분석
Proteome을 구성하는 단백질 분석시 특히 극미 량의 시료만이 제공되는 경우, 예를 들어 몇 개의 세포에 존재하는 단백질 분포를 탐지하고자 할 때 위에서 소개된 2-DE 기법 외의 대안이 필요하게 된다. 이와 같은 미량시료를 취급하고 단백질의 미세분리를 수행하기 위한 microsystem 설계 및 고안 그리고 미량 시료 내 단백질 분석기술로써 단백질칩 개발이 여기에 해당한다.
Bio-microsystem
시료 전처리와 반응공정 자동화 그리고 미세분 리를 위해 미량 용액을 정밀 제어하여 공급해야 하므로 microfluidics에 기초한 microsystem 기술 의 도입이 요구된다. 우선 미세 시료를 일정하게 공급하고 반응시간을 조절하기 위한 한 예로써 초 그림 1. 한국산 장뇌삼과 중국산 장뇌삼의 2차원 전기영동을 통한 proteome 분석 및 비교.
특·별·기·획
미량 용액의 제어가 가능한 일종의 squeezing pump를 [그림 2]에 제시하였다. 이것은 톱니형태 의 바퀴를 회전시켜 연성 폴리머 내 microchannel 을 톱니에 의해 반복적으로 눌러 용액을 운반하는 원리로써 약 50pL 미세용액을 조절할 수 있다.
[그림 3]에 나타낸 바와 같이, 일정하게 운반된 용액은 성분의 분리 전에 전처리 혹은 다른 용액 과 미리 반응될 수 있고 그 후 포함된 성분들은 순 차적으로 미세 분리칼럼 내에서 분리될 수 있다.
Microchannel 내에서의 유체흐름은 일반적으로 Laminar 흐름패턴을 나타내므로 용액 간 혼합을
위해서는 특별히 굴곡이 반복되도록 고안된 미세 precolumn이 사용된다[그림 3(A)]. 이와 같이 처 리된 성분들은 소수성 혹은 친수성 상호작용을 이 용하는 칼럼을 통하여 최적 분리조건 하에서 분리 되고 탐지된다[그림 3(B)].
단백질칩
현재까지 개발된 미세 단백질 분석용 단백질칩 중 전형적인 예로써 항원-항체 반응을 이용한 면 역분석시스템을 들 수 있다. 어떤 proteome에 포 함되고 탐지될 단백질의 종류는 매우 복잡하므로 그림 2. 미세용액을 정밀 전달하는 squeezing pump 시스템(A) 그리고 이를 이용한 약 50pL 용액의 반복적 제어(B).
그림 3. 시료에 포함된 성분들을 효과적으로 분리하기 위한 전처리용 precolumn과 분리용 칼럼이 장착된 마이 크로시스템(A) 그리고 이를 이용하여 분리된 성분들의 탐지(B).
(A)
(A) (B)
(B)
동시에 분리하고 측정하는 방법의 개발은 그 효율 성을 향상시킨다. 따라서 이들을 한 측정시스템 내에서 동시 탐지하고 또한 정밀 측정하는 단백질 칩 기술의 개발이 필요하게 된다. 단백질칩 제작 시 예측되는 주요 문제점 및 기술적인 요구사항으 로써, 많은 수의 단백질들을 특이하게 인지하는 감응성분들을 생산하고 이것들을 고체표면에 효 과적으로 분할하여 고정화하며 각 단백질의 인식 반응을 독립적으로 수행할 수 있는 연구개발이 선 행되어야 한다. 부가하여, 각 단백질의 인식 여부 및 정도를 기존의 스캐닝 방식을 이용할 수 있지 만 고속 스크리닝을 위해 ‘인식’과 ‘센싱’이 결합 된 센서 어레이에 대한 기술정립이 점차 중요하게 된다.
소형화가 가능한 단백질칩 제작원리와 그 가능 한 응용을 [그림 4]에 제시하였다. 서로 다른 두 세 포(예로써, 정상세포와 암세포) 내 존재하는 proteome을 비교분석하기 위해 항원-항체 반응을 이용하는 면역칩이 응용될 수 있다. 우선 두 다른 proteome을 2-DE를 통하여 분리한 후 antibody library(분자생물학적으로 제조한 약 1×109개 재
조합 항체의 pool) 기술을 이용하여 각 단백질 spot에 특이한 재조합 항체들을 선별한다. 이 항체 들을 유리나 실리콘 기판 상에 고정화하여 미세배 열하면 proteome 분석용 면역칩을 제작할 수 있 다. 실제로 실리콘 기판 상에 배열된 항체를 이용 하여 분석물질 농도에 비례한 신호발생방법과 그 농도응답을 [그림 5]에 나타내었다. 이러한 칩기 술은 세포의 상태(정상 혹은 암)를 판별할 수 있 을 뿐만 아니라 proteome에 속한 각 단백질들의 종류 및 농도변화를 탐지할 수 있어서 정상세포가 암세포로 변화하는 기작 그리고 이와 관련된 단백 질 인자들에 대한 연구를 가능하게 한다.
위에서 설명한 내용들을 정리하면, 어떤 조직 시료 내 proteome 분리 및 분석을 위한 기술은 다 음과 같은 필요조건들을 충족시킬 수 있어야 한다.
① 목표 조직 내의 단백질들을 모두는 아닐지라도 대부분을 포함하고 탐지할 수 있는 방법(예:
단백질 추출, 2-DE)에 기초하여야 한다.
② Proteome 분석시, 알려진 단백질은 물론 미지 의 단백질도 포함시킬 수 있어야 한다.
③ 광범위한 생화학적 그리고 생물학적 변수에 기 그림 4. 단백질칩을 이용한 다른 조직 내 proteome에 대한 비교분석 개념.
특·별·기·획
초하여 분리된 단백질(알려진 것과 미지의 단 백질 모두)의 특성화 즉, 기능적인 proteome 분석을 수행할 수 있어야 한다.
④ 분리되고 특성화된 단백질에 상응하는 유전자
에 대한 규명과 chromosomes에서의 mapping 도 고려되어야 한다(이것은 또한 기능적 geno- mics에도 해당함).
광학활성 화합물
이 세상에 존재하는 화합물 중 많은 부분, 특히 동물이나 식물에 존재하면서 생명현상에 중요한 역할을 하는 대부분의 화합물이 광학활성 물질이 다. 화합물의 광학활성이란 편광을 회전시키는 능 력을 말하며, 이러한 현상은 분자의 비대칭성 (chirality)에 기인한다. 분자가 비대칭성을 갖기 위해서는 분자구조 내에 비대칭 탄소가 1개 또는 그 이상 있을 경우이며 이러한 화합물들을 광학활 성 화합물이라 부른다. 이들 광학이성질체 중 서 로 거울상을 이루는 이성질체를 거울상 이성질체 (enantiomer)라 부르며, 거울상을 이루지 않는 이 성질체를 diastereomer라 부른다. Diastereomer들
의 경우 이성질체간의 물리 화학적 성질이 다르며 따라서 생물학적 성질도 전혀 다르다. 하지만 거 울상 이성질체간에는 물리적 성질과 화학적 성질 이 동일하며 오로지 편광면을 회전시키는 방향만 이 반대일 뿐이다. 현재 시판되고 있는 상당수의 의약품은 보통의 일반적 방법으로는 분리할 수 없 는 화학적 성질이 동일한 두 개의 입체이성질체의 혼합물이다. 그러나 이 두 개의 입체이성질체 중 하나는 약효가 다른 하나에 비해 약하거나 전혀 없는 경우가 많다. 이 입체이성질체의 혼합물로부 터 약효가 있는 이성질체만을 분리한다거나, 다른 화학적 경로를 통해 합성이 가능하다면 상용약량 이 반으로 줄어들 것이기에 여러 가지 이점이 있 김 인 호
충남대학교 신소재공학부, [email protected] 그림 5. 고정화모체로써 실리콘 기판 상에 배열된 항체를 이용한 분석방법(A)과 분석물질에 대한 농도응답(B).
(A) (B)
