동위원소검사학 강의 6

동위원소검사학 강의 6

7. 방사면역측정법 Radioimmunoassays(RIA)

8. 정도관리(Quality Control ; QC)

7. 체외검사법(In Vitro Test)

방사성동위원소를 시험관내 조작만으로 RI를 trace로 사용하여 혈액 내의 Hormone, Drug 등의 미량물질을 측정하는 검사법

시작 : 1959. Rosalyn Yalow, Solomon Berson 혈중의 Insulin측정 주로 γ선을 방출하는 핵종으로 ¹²⁵I 사용 (혹 ¹³¹I를 사용)

59Fe, ⁵⁷Co 등 특정 물질의 측정에 사용 β선을 사용하는 핵종 ³H, ¹⁴C milligram(10^-3g), microgram(10^-6g)측정에서

nanogram(10^-9g), picogram(10^-12g) 측정가능

protein, hormone, vitamin, drug, tumor markers

RI(Radioisotope)를 이용한 체외검사법의 종류 경쟁적 방사측정법(competitive radioassay) 방사면역측정법(Radioimmuniassay: RIA)

경쟁적 단백결합측정법(competitive protein binding assay: CPBA)

1. 경쟁적 방사측정법(Competitive radioassay) 방사면역측정법(Radioimmunoassay : RIA) :

방사성 물질을 표지시킨 호르몬과 검체 중의 비표지 호르몬이 항체에 경쟁적으로 결합하는 것을 이용한 방법

경쟁적단백결합측정법(competitive protein binding assay : CPBA) : 항체 대신에 호르몬과 특이적으로 결합하는 단백질을 사용하는 방법 방사수용체측정법(radiorecepter assay : RRA)

세포막 등에 있는 수용체를 이용한 방법

1). 방사면역측정법(Radioimmunoassay : RIA) (1). 원리

항체에 대한 비표지항원과 표지항원의 사이에서 일어나는 경쟁반응(competition)

①. 측정하는 물질을 항원으로 하고 항원에 대한 항체를 미리 동물을 이용하여 만들고 항원에 방사성동위원소를 표지한 표지항원 Ag^※ 을 만듦

②. 검체의 항원과 일정량의 표지항원을 일정량의 항체와 반응시켜 항원.항체(Ag+Ab)와 표지항원. 항체 (Ag^※+Ab)를 만든다.

③. 결합형(bound form :B) : 항체와 결합한 것

유리형(Free form ;F) : 항체와 결합하지 않은 항원과 표지항원

표지항원과 유리항원을 어떤 방법으로 분리, 결합형의 방사능 측정

④. 항원의 양에 따라 표지항원이 항체와 결합하는 비는

항원이 많으면 표지항원이 항체와 결합하는 양은 적어지고 반대로 항원의 양이 적으면 표지항원은 항체와 많이 결합한다.

방사면역측정법의 기본 원리

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RIA procedure (example)

구분 가 나 다 라 마 바 사 아

No 항원 Ag

표지항원

※Ag

항체 Ab

항원 표지항원 Ag+ ^※Ag

결합항원 AgAb

※AgAb

유리항원 Ag. ^※Ag

결합형 B/T(%)

※AgAb

유리형 F/T(%)

※Ag 1

2 3 4 5 6 7 8

0 25 50 100 200 400 900 (500)

100 100 100 100 100 100 100 100

100 100 100 100 100 100 100 100

100 125 150 200 300 500 1000 (600)

100 100 100 100 100 100 100 100

0 25 50 100 200 400 900 (500)

100

80 ^(100/125) 67 ^(100/150) 50 ^(100/200) 33 ^(100/300) 20 ^(100/500) 10(100/1000)

17 ^(100/600)

0

20 (25/125)

33 (50/150)

50 ^(100/200) 67 (200/300)

80 ^(400/500) 90 (900/1000)

83 ^(500/600)

가: 항원의 숫자, 1-7까지 표준항원을 넣고, 8에 검체, 1에는 넣지 않음 나: 표지항원 (1-8) 동량

다: 항체의 수, 1-8 동량

라: 항원과 표지항원을 더한 전체의 수

마: 항원과 표지항원이 항체와 결합할 수 있는 숫자 바: 유리항원의 숫자

사: 표지항원이 항원과 비례하여 항체에 결합한 결합형의 숫자 아: 표지항원과 비례하여 항체에 결합하지 못한 유리형의 숫자

표지항원(^※Ag)의 F/T =항원 F/T 표지항원(^※Ag)의 B/T =항원 B/T

RIA 측정 물질

구분 적용 측정물질

단백, Hormone

뇌하수체 ACTH, ADH, FSH, LH, GH, Prolactin, TSH 칼슘대사 Calcitonin, PTH

Pancrease Insulin, C-peptide, Glucagon 소화관 Gastrin, Secretin

혈관 Angiotensin I, Angiotensin II 태반 HCG, hPL

비단백 Steroid Aldosterone, Androsterone, Cortosol, DHEA, Estradiol, Testosterone Thyroid T3, T4, free T4, TSI,

Hormone

Drug Cyclosporin, Digoxin, Gentamycin, vancomycine Enzyme Elastase, PAP, Pepsinogen I, Pepsinogen II

Virus HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, AntiHBc, HDV Ab, HCVAb Tumor

AFP, CEA, CA19-9, CA125, CA15-3, CYFRA21-1, NSE, SCC, CA72-4

(2). 특성

①. 민감도(Sensitivity)

표지항원이 높은 비방사능(specific activity)을 지녀야한다

비방사능: 한 분자 내에 몇 개의 방사성 표지물이 들어 있는가를 나타냄 비방사능↑ 많은 방사선을 내어서 계측이 쉽고 낮은 농도 계측 가능 반응시간, 온도, 검체의 양

②. 특이성(Specificity)

항원 항체 결합의 관계처럼 특이하게 다른 물질을 구별 할 수 있는 성질

③. 교차반응(Cross reaction)

측정하려는 물질과 유사물질이 간섭하는 정도

④. 재현성(Reproducibility)

다음의 측정에도 같은 값을 나타내는 정도

⑤. 회수율((Recovery rate)

측정물질에 어떤 정확한 함량을 첨가하여 측정 그후 첨가량이 회수되는 율

①. 항체의 생성 a. 면역항원의 조건

RIA에 사용하는 항혈청은 특이성이 높고 친화성이 우수한 항체를 갖는것 중요 항원으로 투여하는 물질은 표지항원과 표준물질이 순수하다면 불순물에 대한 항체를 만들었다 하더라도 측정에 영향을 주지 않는다.

b. 면역에 사용하는 동물, 주사 및 채혈 방법

몰모트, 토끼가 흔히 사용. 주사부위는 피내, 피하, 복강 내항원에 adjuvant를 충분히 혼화, 완전한 oil 유탁액을 만들어 2-3주

간격으로 수 회 주사. 항혈청의 채취는 마지막 주사 2주 후에 시행 최근에는 단클론성 항체(monochronal Ab)를 흔히 사용.

(3). RIA의 조성

RIA를 하기 위한 필요조건

a. 순수한 항원을 얻을 수 있을 것 b. 항체를 생산할 수 있을 것

c. RI표지가 가능한 것 d. B. F 분리가 정확하게 이루어질 것

②. 표지항원 제작

표지물질에 요구 조건

i). 표지에 의해 생화학적성질은 변화해도 좋으나 항체와 반응성은 변화 없어야 한다.

ii). 미량의 항원을 검출하기 위해서는 방사능이 충분히 높을 것 위와 같은 목적에 가장 적합한 방사성동위원소 --- ¹²⁵

I

Iodine은 단백을 구성하는 아미노산 중 tyrosine, cysteine, tryptophan, 황화수소기 (sulpahydryl)등과 결합할 수 있다

Tyrosine기가 없는 경우에는 화학적으로 tyrosine기를 도입해서 요오드화하던가 또는 미리 요오드화한 화합물을 만들어 펩티드 호르몬의 아미노기에 결합시킨다 a. 방사요오드화(radioiodination)표지항원 제작법

현재 chloramin-T법이 가장 많이 사용

Na-¹²⁵I을 chloramine-T로 산화시키고 ¹²⁵I를 유리시켜 이것을 tyrosine기와 결합시키는 방법

b. 표지물질의 정제

위의 방법으로 방사성요오드를 단백에 반응시킨 다음, 신속하게 반응하지 않은 방사성요오드와 변성 단백을 표지 단백에서 분리 정제할 필요가 있다.

정제법으로는 gel여과법이 흔히 사용되고 있다.

③. 결합형(Bound form)과 유리형(Free form)의 분리법

i). 결합형(Bound form)과 유리형(Free form)을 정확하게 분리 ii). 방법이 간단해야 하고 재현성이 높아야 한다

iii). 시간이 적게 걸리고 특별한 장치가 필요하지 않아야 한다 iv). 다량의 검체를 쉽게 처리할 수 있어야 한다.

B.F 분리법 종류

염석법(salt precipitation)

이중항체법(double antibody method) PEG 법(polyethylene glycol)

흡착법(absorption method) 투석법(dialysis)

고상법(solid phase method) 효소법(enzymatic method)

방법 장점 단점 제한 흡착법

Dextran-charcoal Silicate

이온교환수지

빠르다

경제적이다 편리하다

빠름. 싸고 편리

떨어진다 비특이적

반응시간,온도에 영향 유리항체의 분리

분자량 이용법 경제적 느리다 적은 분자에 좋다

단백질변성법 (알코올,PGE)

경제적 남는다 적은 분자에 저항

이중항체법 특이하다 비경제적

시간낭비

고형상항체법 편리 비경제적 적은 분자에 한계

각종 B.F 분리법의 장단점

a. 고형상법(Solid Phase Method).

항체를 고체 표면에 피복시키고 항원-항체 반응을 일으키면 B/F분리 반응이 일어나 면서 동시에 이루어지게 되므로 고체와 액체를 분리하여 쉽게 측정할 수 있다.

용액 속의 방사성동위원소를 씻어내면 끝이다

고체상 : 세파덱스, 플라스틱, 폴리에틸렌, 셀룰로스, 폴리아크로마이드 등.

bead, tube disc등

항체를 고상체의 표면에 피복시키고 단순히 표지항원, 비표지항원을 여기에 경합시키는 방법

항원과 항체를 반응시킨 다음 방사성동위원소로 표지된 항체(2nd Ab)를 반응시키 는 Sandwich method

b. 이중항체법(Double Antibody Method)

항원 항체 반응에 이용된 항체에 대하여 다시 2nd 항체를 만들어 반응 항원-항체(제1)-2nd항체 복합체가 침전되도록 하는 방법

1st reaction Ag-Ab reaction

Add 2nd Antibody → 4℃ reaction

1,000g centrifuge 상층액 제거 count 비교적 간단, 다량처리에 용이

2nd 항체가 많이 소모 비싼 편, 시간이 많이 걸림

+

+

⇒

Ag AgAb AgAb 2nd Ab, 2nd Ab (상층제거)

Ab

☢Ag ^☢AgAb ^☢AgAb 2nd Ab(bound form),침전

^☢AgAg(free form)

c. 흡착법(Absorption Method)

여러 종류의 흡착제를 이용, 측정하려는 물질의 유리형(F)을 흡착시킨다.

결합정도는 형태, 흡착제의 표면면적, 성질, 항원의 크기, 전기적 성질, 반응액의 단백질 농도, 이온 농도, ,pH에 따라 달라진다.

Dextran, 단백질로 피복한 active charcoal(활성탄)을 가장 많이 사용한다.

실리카, 셀룰로스, 이온교환수지, 세파덱스, 겔 등이 이용 완전하고 빠르며 재현성이 높고 시행하기가 쉽다.

유리형은 바르게 흡착되어 다시 떨어져 나올 가능성이 적다.

단점은 용액안의 단백질농도와 온도에 민감하다.

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d. 염석침전법(Salt precipitation)

염(Salt)이나 특수한 용매(polyethylene glycol : PEG)를 이용 항체결합형을 침전시키는 방법

황산암모늄(NH₄)₂SO₄등의 염을 첨가하면 고분자의 항체결합체는 침전되므로 결합형과 유리형을 분리할 수 있다.

PEG : 25% 차거운 PEG첨가, 4℃, 30mins 1,000g로 centriguge 후 상청액 버리고 측정 (PEG: Polyethylene glycol) . 이온농도, 온도 등에 영향

e. 전기영동법(Electrophoresis)

B/F의 분리를 종이의 흡착성의 차이와 gamma globulin의 전기영동에 의한 이동성을 이용

Ag-Ab complex들은 전기적 힘과 물의 이동에 의해 끌려가서 B/F가 분리되며 결합형은 용매이동전단(solvent front)으로 가게 된다.

Bromphenolblue등의 지시약으로 전기영동 시킨 후 방사능 스캔으로 위치를 정한 다음 종이를 잘라서 계측하여 B/F를 알게된다.

최근에는 특수한 목적 이외에는 거의 사용하지 않는다.

f. 복합분리체계

두 개의 침전 시약(제2항체와 PEG)을 함께 낮은 농도로 사용된다.

2nd Ab의 비싼 가격과 긴 반응시간의 단점을 제거하고 PEG의 높은 점성도 문제를 해결해 주는 보완 방법

2nd Ab에 황산암모늄의 혼합물을 쓸 수도 있다.

(4). RIA의 장점과 문제점

①. 장점

감도, 정밀도, 정확도 및 특이성이 높으며 최근에는 측정방법의 자동화로 다수의 검체를 신속히 처리할 수 있다

②. 문제점

a. 생물활성과의 해리

항원-항체 반응을 이용하는 측정법이기 때문에 실제의 생물활성을 반영하고 있지 않을 가능성이 있다.

b. 측정 물질에 대한 항체의 영향

시료 중에 항체가 함유되어 있으면 표지 호르몬은 kit에 첨가되어 있는 항체뿐 만 아니라, 시료 중의 항체와도 결합한다.

2). 경합적단백결합측정법(competitive protein binding assays : CPBA) 호르몬 등의 특이결합단백을 이용

①. 원리

어떤 종류의 Hormone, Vitamin등은 생체 내에서 특이적으로 결합하는단백질과 결합하고 있어서 이 단백질을 항체 대신에 사용해서표지물질과 비표지물질을 결합시키는 반응

RIA법과 원리적으로는 같으며 측정 시에는 측정하고자 하는 목적물질과 결합하고 있는 단백질을 분리할 필요가 있다.

②. CPBA법의 성립 조건

a. 측정하고자 하는 목적물질의 특이단백질이 존재할 것 b. 측정하고자 하는 목적물질의 추출 정제를 할 수 있을 것 c. 표지가 가능 할 것

d. 결합형과 유리형의 분리가 가능할 것

③. CPBA Method 로 측정할 수 있는 물질

측정물질 특이결합단백

T4 T3

Cortisol Vitamin-B12 Serum Iron

티록신결합 단백(TBG) T3결합단백(TBG)

Corticorsteroid binding globulin(CBG) 내인자(intrinsic factor)

Transferrin

3). 방사수용체측정법(Radioreceptor Assays : RRA)

RIA와 동일하지만 항체 대신에 Hormone혹은 약제의 수용체(,receptor)를 특이 결합 물질로 이용한다.

Hormone + 수용체(receptor) ==== Hormone-수용체(receptor) 조건

①. 수용체를 안정한 상태로 얻어야한다

②. Hormone이 생물학적 활성(수용체와의 결합력)을 가진 상태로 유지할 수 있어야 한다

③. 수용체와 Hormone이 결합할 때 이 결합반응이 안정되어 있어 결합 후 변화하지 않아야 한다

④. RIA와 같이 B/F를 분리할 수 있는 방법이 있어야 한다.

2. 비경쟁적 방사측정법(Non competitive radioassay) 1). 면역방사계측법(Immunoradiometric assay: IRMA)

검체 중의 항원을 고상화 항체(bead, tube)와 결합시키고 이어 표지항체를 가해서 결합하고 있는 항원과 결합시킨 다음 유리표지항체를 제거하고 방사능을 측정하는 방법 sandwitch법 이라고도 한다

RIA법의 고형상법과 비슷하며 항원의 양이 많아야 측정이 되는 관계로 검체의 양이 RIA보다 많이 필요하고 특히 항체와 결합할 수 있는부분이

항원에 2개 이상 있는 분자에만 적용이 가능하기 때문에 큰 분자의 단백질에 이용하기 쉽다.

장점

a. 넓은 측정범위 b. 우수한 재현성

c. 용이한 표지항체의 작성 d. 고감도

e. 간편한 조작

(1). 원리

항원 대신에 항체에 방사성동위원소를 표지시키는 방법.

항원의 양에 비례하여 항체에 결합한다.

항체를 고정화한 bead, plastic tube에 항원(미지검체)을 가하고

다시 RI로 표지한 항체(Ab^※)를 참가하면 결합형인 Ab-Ag- Ab^※이 생성 결합형(B, bound form)과 유리형(F, free form)분리, 방사능 측정

Ab + Ag → Ab-Ag +

Ab^※ → Ab^※ : Free form 제거 ↓

Ab-Ag- Ab^※ (complex) Bound form 방사능 측정

(2). 측정의 실제

a. One –step method

고상화 항체에 미지의 검체(표준액)와 ¹²⁵I표지항체를 동시에 혼합 일정 시간 후에 내용액을 흡인 세척, 결합한 방사능을 측정

b. Two-step method

고상화 항체와 검체를 일정 시간 반응 후 내용액을 흡인 세척 ¹²⁵I표지항체를 가하여 일정 시간 incubation 후에 흡인 세척 측정 (3). 특징

IRMA method에서의 문제점 a. Hook effect

과잉된 항원이 존재하면 ¹²⁵I표지 항체는 유리된 항원에도 결합하고 항원의 농도가 너무 높으면 결합률이 오히려 저하되는 경우가 발생 하는 현상. Hook effect, 후지대 현상(postzone phenomenon)

Two-step보다는 One-step법에서 발생하기 쉽다.

2). 포화분석법(Saturation Analysis : SA)

어떤 종류의 Hormone이나 Serum iron등은 혈액 중에 각각의 특이결합단백과 결합하여 순환하고 있다.

그 포화부분은 담체단백질의 일부이고 반드시 남은 불포화부분을 가지고 있다.

그 불포화도는 병태나 생리적 상태에 따라 다르게 온다.

혈청 외부에서 표지한 방사성물질을 혼합해서 불포화부분에 섭취되는 비를 봄에 따라 간접적으로 Hormone 또는 Serum iron 등의 양을 알고 기능 상태를 파악할 수 있다.

섭취율(%) = 흡착제에 흡착된 방사능량(cpm)

×100(%) 처음 넣어준 방사능량(cpm)

①. T₃ 섭취율(T₃ uptake : T₃U)

Thyroid hormone은 T₃와 T₄가 있으며(대부분 T₄, T₃는 일부) 이들은 혈중 TBG(Thyroxin binding globulin)에 결합한 상태로 있다.

TBG는 완전히 포화된 상태가 아닌 미결합부위가 있으며 이TBG에 ¹²⁵I-T₃를 가하면

125I-T₃ 는 미결합 부위에 결합한다.

125I-T₃를 과잉으로 첨가하면 나머지는 흡착제로 흡착한다.

흡착제를 취하여 방사능을 측정. T₃와 T₄ 양을 간접적으로 알 수 있다.

일정량의 시료와 ¹²⁵I-T₃ 및 흡착제를 시험관에 넣고 incubation Washing, 측정

T₃ 섭취율 = (A) CPM

Ｘ100%

(B) CPM

②. 불포화 철결합능 측정 (Unsaturated Iron Binding Capacity: UIBC) Serum iron은 gamma-globulin중에 transferrin과 결합하고 있다.

결합 부분은 transferrin이 약1/3정도, 남은 부분은 혈청 불포화 철결합능 이 둘의 합을 혈청철결합능(Total iron binding capacity: TIBC)이라 한다 혈청에 ⁵⁹Fe를 mix후 일정시간 반응시켜 transferrin에 결합시킨 후 나머지 ⁵⁹Fe를 흡착제에 흡착시킨다.

UIBC(μg/dl) = 흡착제에 흡착된 방사능량(cpm)

×첨가한 철의 양(μg/dl)×100 처음 넣어준 방사능량(cpm)

3. 비방사면역측정법(Nonradioisotope Immunoassay)

방사성동위원소를 표지하는 대신에 효소, 형광물질등을 사용하여 표지물질의 활성을 측정하는 방법

비방사성면역측정법의 종류

측정법 tracer

효소면역측정법(Enzyme immunoassay, EIA) 효소, 기질, 보효소 형광면역측정법(Fluoro immunoassay, FIA) 형광물질

화학발광면역측정법

(Chemiluminescent immunoassay, CLA)

화학발광물질

4. RIA Laboratory 에 필요한 장비 1). 시설

①. 사용시설 : 실험실, 작업실, 계측실 ②. 저장시설 : 동위원소 저장

③. 폐기시설 : 폐기함, 3단탱크,(폐수처리), hood시설, 세척실 ④. 오염검사실 : 오염검사

2). 기기

①방사선계측기: 감마선계측기, 베타선계측기, 방사능 측량계 ②원심분리기 : 일반, 냉장(4℃)

③Water bath: 4℃, 37℃ 45℃ 60℃

④냉장, 냉동고 ; 냉장고(4℃, -20℃), 냉동고(-20℃, -80℃) ⑤흡입기 : 진공펌프 (vacuum pump), 흡입기(aspirater) ⑥진탕기 ; 혼합기, 자석교반기, 교반기, 다량교반기 ⑦건조 : 건조기 ⑧Balance : 일반, Micro

⑨RDW 재증류기, pH Meter, 초음파세척기 3). 기구 및 재료

①. Test tube ②. Pipette ③. Dispenser ④. 유리기구 ⑤. 기타

4). Reagent

①. 방사면역측적용 각종 kit ②. Buffer ; phosphate buffer ③. B/F분리용 시약

④. 추출시약 : ether, hexane, HCl, 빙초산 ⑤. 액체섬광체 제조시약(Beta counter 용) ⑥. 초자기구 세척제

8. 정도관리(Quality Control ; QC)

1. 검사실내의 정도관리 1950년 Levey & Jenning

화학검사결과치의 변동이 각 시설마다 차이, 편차 발생이 증명 평균과 표준편차의 관리도를 작성하는 것

환자로부터 채혈한 시점에서 결과치 보고 때까지의 실험과정을 객관적으로 파악하고 가능한 부분을 표준화하는 것이 오차 발생 방지에 중요

2. 검체의 관리 1). 채혈

감염관리. 공복시. 일내 변동이 심한 종목은 영향이 가장 적은 시간에 채혈 2). 검체의 운반

Hormone의 경우 채혈 후 얼음 컵에 보관 검사실로 운반.

3) 검체의 보관

방사성동위원소를 사용하기 때문에 경제적인 이유, 검체를 모아서 검사.

냉동보관. 재융해를 반복하면 단백질의 변질을 초래. 각각 나누어서 보관 4). 혈청의 분리

1시간 이내 500g 10mins centrifuge. 바로 검사가 안될 경우, 냉장 혹은 동결 보관.

5). 검체의 성상

3. 기구의 관리

1). Pipette 정도관리 (월1회 검사)

①. 미량 천평을 이용하여 용액의 무게를 달아보는법 ②. 색소를 이용. photometer로 측정

③. 방사성동위원소를 분주, 방사선계측기로 방사선의 양을 측정하는 법 검정하고자 하는 피펫으로 20회 이상 되풀이 분주하여 감마선 계측기 로 계측하여 계수의 변이계수가 1%이내임을 확인한다.

2). Dispenser

정기적인 정밀도 검증 3). Test tube

보통 10x80mm사용 4). 기구의 세척

방사성동위원소가 사용된 팁은 반드시 폐기해야 한다

6. Beta Counter

①. 매 측정 전에 블랭크를 계측하여 오염여부를 확인한다.

②. ³H 비소광 표준시료를 5분씩 또는 최소10,000계수가 되도록 10회 이상

되풀이 측정하여 계수변이계수를 측정한다. : 1%이내임을 확인한다.(매주1회)

③. ³H 비소광 표준시료의 붕괴표로 부터 시료의 붕괴율(dpm)을 계산하여 10회 되풀이 측정한 계수 평균값(cpm)을 계산된 붕괴율로 나누어 계수효율

(counting dfficiency)을 측정한다.

④. ³H 소광 표준시료(색소광에 따라 10개의 시료를 회소 10,000계수씩

측정하여 소광계수 (검체 채널비 또는 전환 외부선원 스펙트림의 소광에 따른 계수효율과의 관계를 구한다.

7. 시약의 관리 1) Standard

2). Labeled Antigen 반드시 유효날짜 확인.

활성도의 손상의 원인

①. 옥소 원자의 표지에 의한 손상(구조의 차이에 의한 활성의 저하) ②. 방사선에 의한 손상

③. 표지화에 사용된 시약에 의한 화학적 손상

④. 반응액에 존재하는 불순물에 의한 화학적 손상 3). Antibody

4). 분리시약

8. 측정 조건의 관리

1). 검체의 양 : 10μl이상의 검체

2). 반응시간 : end point법 일 경우는 장시간, 현재는 단축법을 많이 사용 3). 반응 온도: 온도가 높으면 짧은 반응시간 온도가 낮으면 긴 반응시간 4). Dilution : 높은 수치일 경우, Graph를 벗어나거나, hook effect 발생시 5). Recovery test :

6). Sensitivity

7). Cross reaction

8). 방해인자 : 용혈, 혼탁혈청 9). Precision

10). 상관계수

회수율(%)= 첨가시료 측정치 - 첨가전 측정치 첨가한 량

9. Control serum 1). Kit내 관리혈청

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10. Normal range

1). 정상범위 정하는 방법

건강인의 95.44%(M±2SD)를 포함하는 농도 범위 2). 참고치 (Reference value)

평균과 표준편차를 구한 후 SD가 ±3SD범위를 벗어나는 결과는 버리고 다시 평균과 표준편차를 구해서 평균에서 ±2SD범위를 참고치로 한다.

각 시설마다 정상범위를 구해야 하며 가끔 재검사실시, 수정 3). 정상범위의 변동 요인

구분 요인 세부요인

기술적 요인 고유오차

개인오차 과실오차

측정방법, 측정기구, 기기 측정기술과 숙련도

기록, 보고

생리적 개인간 변동 유전

생활환경 시간

개인차, 성별, 인종

지역, 기후, 음식습관, 흡연, 직업 연령

생리적 개인내 변동 시간

습관 생리

일일내, 일일차, 계절(온도) 음식, 습관, 체위

성주기, 임신

11. 정도관리의 실제

1). 정밀도(Precision) : 반복 측정해서 어느 정도 일치하느냐와 관계 2). 정확도(Accuracy) : 참값(true value)과 밀접한 관계

3). 표준편차(Standard Deviation : SD):

각 데이터가 평균과 얼마나 차이를 가지느냐를 알려주는 분산의 양의 제곱근.

데이터의 퍼짐 정도

(표준오차는 샘플링을 여러 번 했을 때 각 샘플들의 평균이 전체 평균과 얼마나 차이를 보이는가를 알 수 있는 통계량 평균이 얼마나 정확한지 알 수 있다 )

4). 변이계수(CV) : 표준편차가 평균치에 차지하는 퍼센트(%)

결과의 표준편차가 크면 클수록 변이계수가 커지고 방법의 정밀도가 나쁘다.

× 100

= SD

CV

6). 내부 정도관리

Blank 측정 오염 여부 확인, 영구 표준 시료로 계측, 변이계수 측정 7). 외부정도관리

각 검사실 간의 검사값의 비교, 저농도, 중간농도, 고농도의 검사

8). 정도관리의 관리도 정도 관리도의 작성

9). 검사의 실수

검체, 시약, 실험조작, 계산, 기록 및 보고

※. 오차의 체계적인 원인 규명 방법 제1단계 문제점의 구분

제2단계 관련된 사람 모두 문제점 토의 제3단계 기능성 원인 목록 작성

Reagent 환경 측정기기

tracer antibody

Standard sol.

poor serum 분리시약 buffer

temp.

time pH

간섭물질

pipette 측정기기 calculation 냉장, 냉동고 centriguge mixer

Test tube

12. 검사의 수행 및 관리 1). 검체의 관리

①. 검체의 채취와 보관에서 여러가지 간섭 물질들이 오염되어 예측치 못한 값을 나타낼 수 있으므로 검체의 조건(Hemolysis, 고지방혈, 고빌리루빈혈 등)을 검사실에서 도착 즉시 기록한다.

②. 호르몬을 검사시 일내변동과 주기분비의 특성 때문에 채혈 시간을 기록.

③. 채혈하여 혈장은 항응고제(EDTA, 헤파린, 또는 ACD)와 혼합하여 분리.

빈 시험관에 채혈, 실온 또는 4℃에서 30분이상 방치 후 원심분리하여 혈청 분리.

④. 항온수조 온도, 냉장고나 냉동고의 온도 계측기의 안정성을 매일 기록과 점검하여 검사결과에 미치는 영향을 감시한다.

⑤. 정도관리된 파이펫을 사용하여 기구오차를 최소화 한다.

2). 키트(Reagent)의 관리

①.방사성의약품 키트를 수령하면 즉시 키트 별로 규격, 수량, 유효기간 반드시 확인

②. 키트내의 표준액, 표지항원, 항혈청등 시약병이 파괴되지 않았나 확인하고 이상이 있으면 따로 보관한다.

③. 각 키트들의 보관, 저장방법을 확인하여 냉장실(4℃)또는 냉동고(-20℃)에 검사종목 키트별로 정리정돈 한다.

④. 꼭 유효기간 순서대로 사용하도록 한다.

※. 키트 선택시 고려할 사항

① 정밀도와 정확도를 일차적으로 고려한다.

② 검사에 걸리는 시간, 검체의 준비, 검사과정의 간편성, 필요한 검체량, 특수 과정의 필요성, 계수시간, 키트공급원의 신뢰도, 가격등을 고려한다.

③ 키트의 평가는 물질마다 고, 중, 저농도 범위에서 측정한다

④ 방사면역 측정용 키트내에 함유된 표지항원, 항혈청, 표준액, 항원유리혈청과 또한 분리방법으로 이용되는 제 2항체 단백질등은 주의해서 저장하지 않으면 파괴되기 쉽다.

⑤ 정상적으로 키트의 유효기간은 표지항원의 반감기에 의해 제한된다.

⑥ 단백질시약: 단백질 시약은 반복적으로 얼리고 녹이는 것을 피해야 한다.

⑦ 탈수된 단백질 시약

4℃ 냉장이 필요하며 시약을 복원한 후 일주일 이내에 사용해야 한다.

⑧ 얼린 단백질 시약

키트를 받는 즉시 시약병을 -20℃에 보관하고 각각의 검사를 시작할 때 냉동고로 부터 꺼내 사용한다.

⑨ PEG(polyethyleneglycol)와 DCC

PEG 는 4℃에 보관하고 DCC는 분말로 구입하여 복원시킨 후엔 반드시 냉장

3). 검사수행

①. 검체 및 검사 준비

ⅰ). 검체를 냉장고나 냉동고에서 꺼내 30분이상 해동시킨다.

ⅱ). 증류수를 첨가하여 검사시약을 재구성하고 해동한 검사 시약을 30분 이상 실온에 방치하여 준비한다.

ⅲ). 검사할 계획표를 작성하고 시험관 또는 트레이에 번호를 기록한다.

ⅳ). 표준액과 시료중 동결된 상태에서 해동한 것은 진탕후 원심분리하여 침전물을 제거한 상층액을 사용한다.

②. 검사

ⅰ). 준비된 시험관에 표준액, 정도관리혈청, 검체를 키트검사지시서에 지시된 일정량씩 넣는다.

ⅱ). 설명서에 따라 시약을 넣는다.

ⅲ). 지정된 시간동안 반응시킨다.

ⅳ). 반응이끝나면 결합형과 유리형을 분리한다.

ⅴ). 계측기에서 방사능을 계측한다.

4). 측정 : 방사능 계측기(Beta, Gamma counter)

① 감마선 계측기는 시험관을 바로 계측한다.

② 베타선 게측기는 액체섬광 계측기로서 액체 섬광체를 사용한다.

③ 액체섬광체는 베타선의 에너지를 받아서 빛으로 바꾸는 역할을 하는 물질이며 이것은 유기용매 중에서 여러가지의 섬광물질을 용질로 용해시키는 것이다.

④ 액체 섬광체는 ppo 5g popop 0.1g

Triton X-100 333ml

Toluene 667ml 의 비율로 혼합하여 만든다.

⑤ 혼합된 액체섬광체를 10ml씩 측정용기에 넣어 진탕기에 시료를 넣고 혼합 후 계측한다.

⑥ 소광 표준액으로부터 얻은 파라메터와 계측효율의 관계식으로부터 시료의 계측효율을 정하고 효율로 나누어 붕괴율 즉 방사능을 구한다.

5). 검사방법은 경합반응과 비경합반응으로 나눈다.

경합반응: 방사면역측정법, 방사수용체측정법, TSH결합억제면역글로불린측정법

비경합반응: 면역방사계수측정법, 방사성알레르겐흡수검사법, 포화분석법이 있다.

6). 방사면역측정법은 표지항원을 시료와 항체와 함께 넣고 반응시키는 평형방법 (equilibrium method)과 표지항원을 나중에 넣는 비평형방법(disequilibrium method)로 나눈다.

7). 결합/유리형 분리법 ① 제2항체 방법,

② 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ; PEG)

③ 황산암모늄으로 침전후 상층액을 쏟거나(decant) 흡인하는 방법 ④ 고형상법으로 셀룰로스(cellulose)미소구슬, polyacrylamide beads, polupropylene tube에 2nd Ab를 부착하여 쏟거나(decant), Asp.

2nd Ab에 철성분(iron oxide)를 부착하여 결합분획을 시험관에 바닥에 부착된

13. 검사 자체의 소요시간

1). 항원과 항체 및 표지항원을 함께 넣은 후 반응 시간은 37℃에서 1시간 이상 또는 4℃에서 24시간이 표준이다.

2). 검사구성에 따라 반응시간과 조건을 달리하게 된다.

3). 비평형방법의 경우는 항원과 항체를 먼저 일정시간, 37℃에서 1시간 이상 또는 4℃에서 24시간 방응 시킨다. (일차반응)

4). 표지항원을 첨가하고 2차반응은 37℃또는 실온에서 1시간에서 8시간까지 또는 4℃에서 24시간 반응시킨다.

5). 이중항체를 첨가하고 실온 또는 4℃에서 1시간 이내 반응시킨다.

6). 고형상법을 쓴 경우 10분간 원심분리후 흡인 또는 버리기, 세척, 상층액버리기 등 의 조작으로 분리한다.

7). 검사자체의 소요시간은 각각의 반응시간에 피펫조작 시험관 조작 등 반응사이의 과정에 각각 10분씩 소요된다.

14. 데이터 처리 및 보고

1) 표준액 함량에 따른 계측값으로 표준곡선을 만든다.

2) 반복측정쌍의 계측값을 읽고 계측변이계수를 구한다.

3) 정밀도 프로필을 작도한다.

4) 평균뱃치 변이계수나 프로필자체를 과거의 정밀도 프로필과 비교하여 검사자체 의 승인여부를 정한다.

5) 정밀도 프로필에서 측정범위 (working range)를 정한다.

6) 표준곡선에서 검체의 값을 찾는다.반복쌍측정변이계수를 과거의 정밀도 프로필 에 비추어 해당 검체의 수용여부를 정한다.

7) 희석하여 측정범위를 검사하고 희석배수를 곱하여 검체값을 정한다.

15. 방사면역측정법의 문제점 및 가능한 원인

문제점 가능성한 원인

어떤 시험관에서도 결합형이 없다 (모든 시험관이 비특이결합시험관 과 동일한 계측값을 갖는다

항체가 첨가되지 않음

표지항원이나 항체를 잘못 첨가 잘못된 분리방법(PEG 또는 이중

항체법에서 시험관에 침전물이 없음) 모든 시험관에서의 낮은 결합률 오래된 표지항원의 사용. 희석된 표지항원

이 너무적거나 혹은 희석된 항체가 너무많 거나, 그릇된 완충액의 pH

표준액이 0인 시험관(B0)과 같은 계측값을 갖는다

첨가된 표준액이 없다.

표준액이 잘못 첨가됨

높은 비특이결합률(NSB) 오래되거나 손상된 또는 부적절히 보관된 표지항원의 사용. 비특이결합 시험관에 항 체 첨가(비특이결합 시험관이 표준액이 0인 시험관과 동일)

표준곡선의 완만한 경사 사용된 표준액을 지나치게 희석 표지항원과 항체를 과다하게 사용 표준곡선의 급격한 경사 표준액의 희석률 차이가 많다.

표지항원과 항체를 너무 적게 사용 높은 정도관리혈청의 값 지나치게 희석된 표준액

보관하는 동안 혈청의 수분의 증발 낮은 정도관리혈청의 값 표준액의 낮은 희석

보관하는동안 변질된 정도관리혈청 이중항체법에서 침전물이 없슴 정상혈청, 제2항체가 첨가되지 않음 이중실험의 정확성 미흡 미흡한 기술 , 미흡한 피펫

낮은 총방사능 계측값 (total cpm) .

지나치게 희석된 표지항원

농축된 표지항원액에 방사능이 없음 시험관에서의 방사능 계측값이 표지항원이 첨가되지 않음

16. 외부정도 관리

1). 월 1회 또는 그 이상의 간격으로 학회 정도관리위원회의 시료를 받아 검사에 포함시켜 측정한다.

2). 정도관리위원회의 전체검사실에서 추린 평균값을 바람직한 검사값으로 두고 평균으로부터 표준편차의 1,2,3배 범위 내에 위치하는 횟수를 기록해 간다.

THE END