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이학 석사학위논문

병원성 파울러자유아메바

( Naegleria fowleri )에서 발현하는 profilin 단백질의 세포 내 발현 양상

아 주 대 학 교 대 학 원 의생명과학과/분자의학전공

함 아 정

병원성 파울러자유아메바

( Naegleria fowleri )에서 발현하는 profilin 단백질의 세포 내 발현 양상

지도교수 신 호 준

이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.

2021년 2월

아 주 대 학 교 대 학 원

함아정의 이학 석사학위 논문을 인준함.

심사위원장 신 호 준 인

심 사 위 원 박 선 인

심 사 위 원 김 경 민 인

아 주 대 학 교 대 학 원

2021년 1월 7일

-국문요약-

병원성 파울러자유아메바( Naegleria fowleri )에서 발현하는 profilin 단백질의 세포 내 발현 양상

파울러자유아메바는 인체의 코를 통해 침범하여 원발성의 아메바성 뇌수막염을 일으킨다고 알려져 있다. 생활사 중 세 가지 형태의 영양형(trophozoite)과 편모형(flagellate) 그리고 포낭형(cyst)이 있으며, 이 중 감염형인 영양형이 인체 내의 중추 신경계로 들어가 뇌 조직을 파괴하게 된다. 이때 숙주세포에 아메바가 접촉하고 세포용해물질 등을 분비하며 숙포세포의 세포병변효과를 유도하여 세포사멸을 일으킨다는 보고가 있다. 아메바 세포질의 분출 형태인 food-cups 구조 형성에 관여하며 숙주세포에 부착해 세포의 용해(trogocytosis)를 유발하고 식세포작용을 수반한 접촉성 기전에 관여한다고 알려진 유전자로 Nf-actin 및 nfa1 등이 있다. 특히 Nf-actin 유전자는 분화와 포식작용이 활발한 영양형에서 food-cups 부위에 많이 발현된다고 보고되었으나, 아메바 의 포낭형에서 발현되는 유전자에 대한 연구는 미미한 편이다. 앞선 연구에서 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형에서 발현되는 유전자가 분석되었으며 그 결과, 포낭형에서 과발현되는 Nf-profilin 유전자가 클로닝 되었으며, 본 연구

- ii -

의 발현 차이를 비교하고 파울러자유아메바 내에서의 Nf-profilin 단백질의 발현 위치를 형광현미경 및 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하고자 하였 다. 파울러자유아메바에서 Nf-profilin 유전자는 운동기능과 식세포작용이 일 어나지 않는 휴면상태의 포낭형에서 많이 발현되는 것을 알 수 있었으며, 영 양형에서는 특이적으로 발현이 감소하였다. 표적세포가 있을 때 Nf-profilin 단백질의 발현 변화를 알아보고자 CHO 세포와 혼합배양 하였을 때, 포낭형을 혼합배양한 실험군에서는 아메바 포낭형의 세포질 전체에서 Nf-profilin 단백 질이 발현하였다. 반면, Nf-actin 단백질은 파울러자유아메바의 포낭형에서 거의 발현되지 않았다. 혼합배양시간에 따라 점차 영양형으로 변화해갈수록 위족(pseudopodia)과 food-cups 부위에서 Nf-actin 단백질이 나타났으며, 배양 시간에 따라 발현 양이 증가하였는데 특히, 표적세포에 접촉할 때 영양 형 형태에서 강한 발현 수준을 보였다. 이는 아메바 영양형이 표적세포에 달 라붙는 adhesion 역할과 phagocytosis 작용에 Nf-profilin 유전자는 직접 작용하지는 않는다고 생각된다. 결론적으로 Nf-profilin과 Nf-actin 유전자 는 파울러자유아메바 생활사의 영양형과 포낭형에서 각각 대조되는 결과가 관 찰되었는데, 아메바의 환경 내 생존과 증식조절에서 중요한 유전자임을 보여 주었다. Nf-profilin 유전자에 대한 발현 조절 연구는 파울러자유아메바의 병 원성 분석 및 아메바에 의한 감염증 치료제 개발을 위한 기초자료로 활용할 수 있을 것이다.

--- 핵심어: 파울러자유아메바, 아메바성 뇌수막염, Profilin, Actin,

Immuno-cytochemistry

차 례

국문요약 i

차례 iii

그림 차례 ^Vi 표 차례 ^Viii I. 서론 1

II. 재료 및 방법 9

1. 세포 배양 9

1) 파울러자유아메바(N. fowleri)의 배양 및 포낭형성(encystation) 9

2) CHO 세포(Chinese hamster ovary cell) 배양 10

2. CHO 세포와 파울러자유아메바의 혼합배양 11

1) 혼합배양을 위한 혼합배지 조성 11

2) CHO 세포와 파울러자유아메바의 혼합배양 12

3) 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용 관찰 13

3. 파울러자유아메바의 포낭형성과정에 따른 Nf-profilin 단백질의 발현량 변화 관찰 13

- iv -

(RT-PCR) 시행 16

C. Real-time RT-PCR 시행 16

2) SDS-PAGE 및 Western blotting 시행 18

3) Immunocytochemistry 시행 19

III. 결과 21

1. 파울러자유아메바의 포낭 형성에 따른 Nf-profilin 유전자의 발현량 변화 21

1) 파울러자유아메바의 포낭형성 유도 21

2) Nf-proiflin 유전자 발현의 RT-PCR 결과 23

3) SDS-PAGE 및 Western blotting 분석 25

2. 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 2 7 1) 형광현미경 관찰 결과 27

2) 공초점 레이저 주사현미경 관찰 결과 30

3. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용과 Nf-profilin 유전자 발현 33

1) 혼합배양시간에 따른 파울러자유아메바의 형태학적 변화 33

2) 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바 Nf-profilin 유전자의 시간별 발현량 변화 36

A. RT-PCR 결과 36

B. Real-time RT-PCR 결과 38

4. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 Nf-profilin 단백질의

발현 위치 40

1) 형광 현미경 관찰 결과 40

2) 공초점 레이저 주사현미경 관찰 결과 47

IV. 고찰 49

V. 결론 56

참고문헌 57

ABSTRACT 64

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그 림 차 례

Fig. 1. Life cycle of N. fowleri 2

Fig. 2. A section cerebral portion of the brain from a PAM patient 4

Fig. 3. Extensive hemorrhage and necrosis of brain in primary

amoebic meningoencephalitis(PAM) 4

Fig. 4. Observation of N. fowleri trophozoites and cysts after the

induction with encystment medium for 24 hr 22

Fig. 5. Nf-Profilin and Nf-actin genes expression level in

N. fowleri trophozoites and cysts 24

Fig. 6. Expression level of Nf-profilin protein in N. fowleri

trophozoites and cysts 26

Fig. 7. Localization of Nf-profilin and Nf-actin protein in N. fowleri

trophozoites and cysts by immunofluorescence assay 28

Fig. 8. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri

trophozoites and cysts by a confocal microscope 31

Fig. 9. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri

trophozoites and cysts by a confocal microscope 32

Fig. 10. Microscopic observation of N. fowleri co-cultured with CHO cells, which show the phagocytosis post co-incubation

for 24 hr 35

Fig. 11. Nf-profilin gene expression levels in N. fowleri

co-cultured with CHO cells for 24 hr 37

Fig. 12. Nf-profilin gene expression level of N. fowleri co-cultured with CHO cells, which was estimated with real time RT-PCR

for 24 hr 39

Fig. 13. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri cysts co-cultured CHO cells by immunocytochemistry assay

using anti-Nf-profilin monoclonal antibody 42

Fig. 14. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri trophozoites co-cultured CHO cells by immunocytochemistry assay

using ant i-Nf -prof il in monoclonal ant ibody 43

Fig. 15. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri cysts co-cultured CHO cells by immunocytochemistry assay

u s i n g a n t i - N f - a c t i n a n t i b o d y 4 5 Fig. 16. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri trophozoites

co-cultured CHO cells by immunocytochemistry assay

- viii -

표 차 례

Table 1. Primers used for RT-PCR 14 Table 2. Primers used for real time RT-PCR 17

Ⅰ . 서 론

1. 자유생활 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)

자연환경에서 스스로 세균 또는 박테리아 등을 잡아먹으며 영양분을 얻을 수 있는 자유 생활을 하는 아메바(free-living amoeba; FLA)에는 많은 종 들이 있다. 그 중 Naegleria spp., Acanthamoeba spp., Balamuthia spp. 종 들은 중추신경계(central nerves system;CNS)에 침범하여 인체에 병변을 일으키는 종들이다(De Jonckheere 등, 2011). 특히 Naegleria spp. 중에서 가장 병원성이 높다고 보고된 파울러자유아메바(Naegleria fowleri)는“뇌 먹는 아메바(brain eating amoeba)”로 알려져 있으며(Lakhundi 등, 2014), 1965 년에 오스트레일리아의 Fowler 와 Carter 에 의해 처음 보고되었다(Fowler 등, 1965; Shin, 2010). 전세계적으로 주로 토양이나 따뜻한 담수의 연못, 하천, 온천이나 오염된 수돗물 등에서 발견되는데 호열성의 병원체로서 37 ̊C 정도의 따뜻한 담수가 최적의 활성을 보이는 온도이지만 45 ̊C의 높은 온도에 서도 생존이 가능하다(Visvesvara 등, 2007; Long 등, 2017). 이처럼 파울 러자유아메바는 호열성의 특성 때문에 지구의 기온 상승은 파울러자유아메바

- 2 -

(Pana 등, 2017). 한편, 영양결핍이 있지만 최소한의 물이 존재하고 적당한 온도 조건만 맞는다면 영양형으로 쉽게 변화하는 일시적으로 운동성이 있는 두 개의 길쭉한 편모를 가진 10~16mm 크기의 편모형(flagellate)이 있다. 마지막으 로 영양형이 온도나 pH, 영양분의 부족 등으로 인해 불리한 환경 변화에 노 출되면 외부 변화에 저항성이 있는 두꺼운 세포벽을 가진 8~20mm 크기의 원형의 포낭형(cyst)이 있다(Fig. 1)(Visvesvara 등, 2007; Jahangeer 등, 2020).

Fig. 1. Life cycle of N. fowleri

파울러자유아메바로 인한 감염은 주로 수상레포츠나 수영 등의 수중활동 등 으로 야기되는데, 물 속에 서식하고 있던 파울러자유아메바가 사람의 비강점 막을 침투하여 후신경을 통해 중추신경계로 들어가 뇌 조직을 파괴시켜 원발 성의 아메바성 수막뇌염(primary amoebic meningoencephalitis; PAM)을 발생시킨다. 파울러자유아메바가 뇌 속을 침투하게 되면 영양형이 적혈구 및 신경 세포와 같은 세포들을 용해하고 섭취하면서 조직의 파괴를 일으키고, 결 국에는 염증성의 침윤을 동반한 출혈성 괴사를 일으킨다(Fig. 2, 3)(Carter 등, 1970; Jahangeer 등, 2020). PAM 증상은 아메바 감염 후 1~9일 사이 에 나타나기 시작하며 심한 두통과 고열, 메스꺼움, 환각, 신경학적 결함과 발 작 등의 증세를 보인다. 혼수상태와 사망에 이르는 속도가 매우 빨라 대게 1 주 내에 사망하게 되고, 90% 이상의 매우 높은 사망률을 보인다. 특히 뇌 속 이라는 감염 부위의 특수성과 박테리아성 등과 같은 다른 유형의 뇌수막염과 임상적 증상이 유사하기 때문에 진단이 어렵다(Visvesvara 등, 2007; Marciano -Cabral 등, 2007).

- 4 -

Fig. 2. A section cerebral portion of the brain from a PAM patient.

hematoxylin and eosin stain. Figure refer to US-CDC.

Fig. 3. Extensive hemorrhage and necrosis of the brain in primary amoebic meningoencephalitis(PAM). Figure refer to US-CDC.

1962년부터 2018년까지 미국에서 파울러자유아메바에 감염된 145명의 환자 중에서 단 4명만이 생존하였고, 따라서 미국 CDC에서는 파울러자유아 메바에 의한 감염증을 희귀난치병으로 지정하기도 하였다(Cope 등, 2016).

PAM 발생 환자에게 진균을 죽이는 Amphotericin B나 항암제로 개발된 Miltefosine을 사용하고 있지만 드물게 완치가 된 환자가 있는 반면, 치료제 를 투여했음에도 사망하거나 뇌 손상 및 신경학적 회복이 불가능한 사례가 있 는 만큼 아직까지 파울러자유아메바에 의한 감염증을 치료하는 완전한 치료제 는 없다(Visvesvara 등, 2007; Grace 등, 2015).

예방법은 파울러자유아메바가 오염된 물이 콧속으로 들어가지 않도록 하는 것이 최선이며, 현재는 명확한 조기 진단법 및 새로운 치료제의 개발에 많은 연구자들이 집중하고 있다.

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2. 파울러자유아메바의 분화 및 포식작용 관련 단백질

파울러자유아메바(N. fowleri)는 환경 변화에 의해 세포의 형태가 변화하 거나 분화할 때 몇몇 단백질이 발현조절기전에 관여한다고 알려져 있다. 그 중 actin 은 대부분의 진핵세포에 존재하는 주요 세포골격 단백질이다. 또한, 자유 생활아메바 종 들에서 myosin 이나 microtubule-associated proteins, profilin 등의 단백질들은 세포골격(cytoskeleton) 구조 변화에 관여하는 것으로 밝혀져 있다 (Pollard 등, 1973; Sathish 등, 2004). 외부자극이 세포 내의 골격 및 기관 등으로 도달하는 과정에서 미세섬유가 관여하게 되는데, actin polymerization 이 발생하고 편모와 세포골격 미세소관이 새롭게 형성된다고 한다. 이러한 과 정에는 actin filament 가 중요한 기능을 수행하며, actin polymerization 을 촉 진 또는 억제하는 관련 단백질에 의해 조절된다(Ridley 등, 2003; Witke 등,

2004). 또한, 파울러자유아메바가 표적세포를 포식하는 과정에서 접촉성 기전

에 의해 표적세포가 용해되는 과정(trogocytosis)을 거치게 되는데, 이 때 파 울러자유아메바 영양형의 세포질에서 food-cups 가 형성된다고 보고되었다 (John 등, 1984). 파울러자유아메바의 영양형과 표적세포가 함께 배양되었을 때, 표적세포에 파울러자유아메바가 접촉되는 food-cups 주변에 중점적으로 위치하는 유전자들인 nfa1 및 Nf-actin 유전자들이 클로닝되었다(Shin, 2010, Sohn 등, 2010). 따라서 아메바의 food-cups 에 의해 표적세포가 섭 취될 뿐만 아니라 아메바가 기질에 부착할 때 nfa1 및 Nf-actin이 중요한 역 할을 한다고 할 수 있다. 이들 중 Nf-actin에 결합해 세포골격구조에 영향을 주는 핵심단백질 중 하나가 profilin 으로 actin polymerization 기작에 관여한 다고 알려져 있다(Marciano-Cabral 등, 1982; Grenklo 등, 2004).

Profilin은 동물, 식물 및 바이러스 등의 생물체에서 필수적으로 존재하는 단백질이며, 꽃가루 또는 음식에서 주요 또는 중간매개의 알러지원(allergen) 이기도 하다. Actin-binding protein으로서 actin monomer와 1:1로 결합해 액틴 단량체를 격리시키고 액틴 중합을 억제함으로써 작용한다(Carlsson 등, 1977; Schutt 등, 1993). 또한 actin-microfiliament의 성장조절에 필수적인 actin 단백질의 complex로 세포 운동과 세포 모양 변화에 필수적 과정을 수반한다(Hartwig 등, 1989; Buß 등, 1992). 대부분의 진핵세포에서 발견되는 높은 농도의 profilin은 새로운 filament의 핵 형성 및 재구성을 방해하며 세포골격구조에 영향을 주고 액틴 중합을 저해한다고 알려져 있다(Alvarado 등, 2014; Gunning 등, 2015). 이처럼 profilin 은 식물 또는 동물 세포 내 다수의 단백질 사이에서 많은 결합 단백질과의 상호작용을 통하여 세포 골격 변화의 활성인자 로 기능을 한다는 역할에 대한 데이터가 많이 보고되었다(Witke 등, 2004;

Rawe 등, 2006). 하지만 진핵세포인 파울러자유아메바에서의 profilin에 대한 역할은 보고된 바가 없으며, 특히 파울러자유아메바 생활사 중 영양형과 환경 의 변화에 따라 형성되는 포낭형에서 차별되어 발현되는 유전자에 대한 차이를 비교하는 연구는 미미한 편이다. 현재까지 파울러자유아메바의 포낭형에서 많 이 발현되는 유전자가 클로닝(cloning) 된 연구가 보고된 바 없으며, 더욱이 파울러자유아메바의 생활사에 관여하는 인자로서의 역할은 아직까지 밝혀진 바 가 없다.

- 8 -

3. 본 연구의 목적

선행연구에서 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형에서 차별되어 발현되는 유전자가 분석되었으며 그 결과, 포낭형에서 과발현되는 profilin 유전자가 클 로닝 되었다. 구축된 Nf-profilin 유전자 정보를 이용하여 실험을 수행하였다.

본 연구에서는 파울러자유아메바 생활사 중 포낭형과 영양형에 따라 Nf-profilin 유전자의 발현 수준의 차이를 관찰하고자 하였다. 또한 아메바 포낭형과 영양 형 내에서의 Nf-profilin 단백질 발현 위치변화를 알아보고자 하였으며, 추가 적으로 표적세포가 존재할 때 파울러자유아메바내에서 Nf-profilin 단백질 발 현 양상과 식세포작용과의 연관관계를 형광 현미경 및 공초점 레이저 주사현미 경으로 관찰하고자 하였다.

II. 재료 및 방법

1. 세포 배양

1) 파울러자유아메바의 배양 및 포낭 형성

파울러자유아메바의 영양형을 5% fetal bovine serum(Gibco, California)이 첨가된 Nelson’s medium (4mg MgSO⁴-7H²O, 4mg CaCl²-2H²O, 142mg Na²HPO⁴, 136mg KH²PO⁴, 120mg NaCl, 1.7g Glucose, 1.7g Liver extract Pamade) 15mL 이 담긴 75-cm²culture flasks (BD bioscience, USA)에 넣어주고 37 ̊C 배양기에서 무균배양하였다. 파울러자유아메바의 포낭형을 형 성시키기 위해, 아메바 영양형을 배양중인 75-cm²flasks 의 상층액(배지)을 버리고 FBS 가 첨가되지 않은 Nelson’s incomplete 배지를 15mL 넣어주었다.

18 시간 동안 배양한 뒤 배지를 제거하고, 포낭형성배지(encystment medium;

120mM NaCl, 0.03mM MgCl2, 1mM NaHPO4, 1mM KH2PO4, 0.03mM CaCl2, 0.02mM FeCl2, pH6.8;) 15mL 을 넣어 10 시간 동안 배양하였다.

포낭형 유도 여부를 위상차 현미경(inverted microscope)(Olympus, Japan) 으로 형태학적 변화를 관찰하였다.

- 10 -

2) CHO 세포 (Chinese hamster ovary cell) 배양

중국 햄스터에서 유래된 난소세포(Chinese hamster ovary cell)는 1%

penicillin/streptomycin과 5% FBS를 첨가한 DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)(Welgene, Korea)배지를 15mL 넣은 75-cm²flasks (BD bioscience, USA)에서 37 ̊C, 5% CO² 배양기 내에서 배양하였다. Monolayer 로 배양된 것을 위상차 현미경으로 확인 후 배양액을 제거하고 0.25% Trypsin- EDTA(Gibco, California) 용액을 5mL 넣어주어 3 분간 반응 시키고 DMEM 배지를 더 넣어준 뒤 파이펫을 이용하여 세포를 완전히 떼어내주었다. 부유된 세포를 conical tube 에 모아 1,000rpm 에서 5 분간 원심분리 해준 뒤 상층액을 제거하고, PBS (p ho s ph a te bu ff e re d s a l in e ; pH 7.4) 용액을 1 0m L 첨가하여 2번 세척해주었다. 침전된 세포들을 잘 풀어준 후, DMEM 배지를 10mL 넣어 10cm dish에 분주하고 monolayer가 될 때까지 37 ̊C, 5% CO² 배양기에서 배양해 주었다.

2. CHO 세포와 파울러자유아메바의 혼합배양

1) 혼합배양(co-culture)을 위한 혼합배지 조성

혼합배양을 위한 적절한 배지의 조성을 결정하기 위해 Nelson’s 배지와 DMEM 배지를 1:9 또는 3:7 비율로 혼합해 75-cm²flasks 에 15mL 을 각각 넣어준 뒤, CHO 세포들의 배양이 혼합비율에 따라 차이가 있는지 확인하였 다. 파울러자유아메바는 CHO 세포보다 상대적으로 외부 변화에 영향을 덜 받기 때문에 표적세포인 CHO 세포에 가장 영향이 없고 잘 자랄 수 있는 환 경의 배지 비율을 결정하였는데, Nelson’s : DMEM 혼합비율을 1:9 비율로 배지 조성을 정한 뒤 이후 혼합배양 실험에 사용하였다.

- 12 -

2) 파울러자유아메바와 CHO 세포의 혼합배양

표적세포인 CHO세포를 직경 10cm dish에 monolayer로 배양한 후 위상 차 현미경으로 확인하였다. 배양한 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 1,300rpm에서 3분간 원심분리 해주고, PBS로 2번 더 세척 후 원심분 리하여 세포침전물을 얻었다. PBS 10mL에 침전된 세포들을 풀어준 뒤, trypan blue로 세포를 염색한 후 hematocytometry로 세포 개수를 세어주었 다. 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형(각 5×^cells/mL)을 각각 혼합 배지에 풀어주고, CHO 세포가 배양되어 있는 각 dish에 분주해 혼합배양하 였다.

① CHO 세포 + DMEM 배지

② CHO 세포 + 혼합배지

③ CHO 세포 + 파울러자유아메바 영양형+혼합배지

④ CHO 세포 + 파울러자유아메바 포낭형+혼합배지

3) 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용 관찰

앞서와 같이 CHO 세포와 파울러자유아메바를 혼합배양 하였을 때, 아메바 영양형과 포낭형이 CHO 세포를 포식하는 과정을 위상차 현미경을 이용하여 1, 3, 6, 12 및 24시간 간격으로 형태적 변화를 관찰하였다.

3. 파울러자유아메바의 포낭형성과정에 따른 Nf-profilin 유전자의 발현량 변화 관찰

1) RT-PCR을 이용한 파울러자유아메바 Nf-profilin 발현 확인

앞선 연구에서 클로닝 된 Nf-profilin 유전자 정보를 얻어 Nf-profilin 확인을 위해 primer 쌍을 제작하였으며, 제작된 primer 쌍들을 이용하여 PCR 을 수행하였다. 파울러자유아메바의 housekeeping gene으로 Nf-GAPDH primer 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다(Table 1). 대조군으로 사용된 Nae3 primer 쌍은 대만의 PAM 환자들에게서 파울러자유아메바의 18s-ribosomal small-subunit DNA(srDNA) 검출을 위해 사용되는 primer 쌍(Su 등, 2013) 이며, Nfa1 primer 쌍, Nf-actin primer 쌍은 파울러자유아메바의 영양형에

- 14 - Table 1. RT-PCR primer sequence

Gene Forward sequences (5’ to 3’) Reverse sequences (5’ to 3’) N. fowleri

GAPDH TGGTAGACTTGTCTTCCG CCGTGGACAGAATCATAC

N. fowleri

profilin GAAAGCTGTGGCGTGATGG GCTCTGCAACATCACACAGA

Nae 3 CAAACACCGTTATGACAGGG CTGGTTTCCCTCACCTTACG

nfa1 ATGGCCACTACTATTCCATCACCA AAGCACTCCCTTGTACTTCAT N. fowleri

actin ATGTGTGACGACGTTCAAGCACTC AAGATCTTTCTGTGGACAATACCTGGA CHO cell

GAPDH CATCACCATCTTCCAGGAGC CTTGGTTCACACCCATCACA

A. RNA 분리 및 cDNA 합성

PCR 시행을 위하여 아메바의 total RNA 를 분리하고 cDNA 를 합성하였 다(Kang 등, 2015). 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형을 conical tube 에 모아 3 분간 원심분리하여 세포 침전물만 모은 후 PBS 로 2 번 세척 해주 었다. 마지막으로 1.5mL tube 에 모아 13,000rpm 으로 3 분간 원심분리하여 상층액을 완전히 제거한 후 세포 침전물만 얻었다. 얻은 세포침전물을 RNeasy mini kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 protocol 에 따라 RNA 를 추출하였다. 분리한 RNA 1ug 에 RNase-free water 와 oligo dT primer (Nanohelix, Korea)를 섞어 65℃에서 5 분간 변성시킨 후, 반응용액과 혼합 하여 42℃에서 10 분, 65℃에서 50 분, 70℃에서 10 분간 반응하여 cDNA 를 합성하였다. 또한, CHO 세포와 혼합배양 한 아메바의 영양형 및 포낭형을 1, 3, 6, 12 및 24 시간 별로 세포 스크래퍼(cell scraper)를 이용하여 세포들을 떼어내고 위와 동일한 방법으로 RNA 분리 및 cDNA 를 합성하였다.

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B. Reverse Transcription Polymerization Chain Reaction (RT-PCR) 시행

파울러자유아메바 영양형 및 포낭형의 cDNA를 이용하여 형태학적 차이에 따라 발현되는 Nf-profilin 유전자를 비교하기 위하여 RT-PCR 을 진행하였다 (Kang 등, 2015). 각각의 cDNA 1ug 과 primer 및 NoblezymeTM PCR Plus Premix 2X (Noble Bioscience Inc., Korea)를 혼합하여 95℃에서 30 초, 57℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 35 cycles 조건으로 RT-PCR 을 수행하였다. 증폭된 유전자의 DNA 는 1% Etidium bromaide 가 포함된 agarose gel 상에서 발현되는 밴드의 양상을 Geldoc (BioRad, California)으로 확인하였다. 또한 CHO 세포와 혼합배양 한 파울러자유아메바의 Nf-profilin 유전자의 발현 변화를 시간별로 관찰하기 위하여 합성한 아메바의 영양형 및 포낭형 cDNA 를 이용하여 위와 동일한 방법으로 RT-PCR 을 진행하였다(Table 1).

C. Real-Time RT-PCR

표적세포와 혼합배양 하였을 때 시간 별로 발현되는 파울러자유아메바 내 의 Nf-profilin 유전자를 정량화하기 위하여 real-time RT-PCR을 수행하 였다. Nf-GAPDH와 Nf-profilin의 primer 쌍을 디자인하고 합성하여 얻은 후, 1ug의 cDNA를 SYBR premix Ex Taq(TAKARA, Japan)와 혼합하여 95℃에서 30초, 95℃에서 5초, 60℃에서 34초 및 40 cycles의 조건으로 RT-PCR을 수행하였다. 결과는 대조군으로 사용한 Nf-GAPDH 유전자의 CT 값과 Nf-profilin유전자의 CT 값의 상대적인 차이를 이용하는 comparative 2-∆∆CT 방법으로 분석하였다(Table 2)(Livak 등, 2001).

Table 2. Real time RT-PCR primer sequence

Gene Forward sequences (5’ to 3’) Reverse sequence (5’ to 3’) N. fowleri

GAPDH ATGGTCAAGGTTGGAATCAACG TTATTGGACCTTTGAAGTTGAAAT N. fowleri

profilin ATGGTACGAGCTTGCTCCAA GCTCTGCAACATCACACAGA

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2) SDS-PAGE 및 Western blotting 시행

파울러자유아메바의 형태에 따른 Nf-profilin 단백질 발현량을 비교하기 위하여 SDS-PAGE 및 Western blotting을 진행하였다. 아메바의 영양형 및 포낭형을 각각 conical tube에 모아 원심분리 해준 뒤 PBS로 2번 세척하였 다. 세포침전물에 protein lysis buffer (iNtRON, Korea) 50uL을 넣고 잘 풀어준 뒤, 얼음에서 1시간 이상 반응시키고 13,000rpm에서 20분 간 원심분 리하여 상층액만 모아 세포용해물(lysate)을 얻었다. 세포용해물 25ug에 sample 완충용액(240mM Tris-Cl pH 6.8, 8% SDS, 0.1% bromophenol blue, 40% glycerol, 100mM dithiothreitol) 5uL을 넣고 100 ̊C에서 5분간 끓여주었다. 그 다음 15% polyacrylamide gel에서 2시간 전기영동 하였다.

앞서 SDS-PAGE 를 수행한 gel 을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane 에 올려놓고 250mA로 2시간동안 전기영동 하여 이적시켰다. 전기영동이 끝난 membrane을 3% bovine serum albumin (BSA) 용액에 담가 두고 4 ̊C 에서 하룻밤동안 반응시켰다. 다음 날 membrane을 PBS에 tween-20이 혼합된 PBST 용액으로 5분씩 3번 세척해준 뒤, 1차 반응항체로 N. fowleri profilin 단클론항체(3E5 monoclone, culture supernatant)를 넣어주고 실온에서 2시 간 반응시켰다. 다시 PBST 로 5 분간 3 번 세척해준 뒤, 2 차 검출항체인 Alkaline- phosphatase conjugated anti-mouse IgG (whole molecule)(Sigma, USA)을 1:2000 비율로 희석하여 2 시간 반응시켰다. PBST 로 세척해준 후 발색을 위해 BCIP/NBT alkaline phosphatase substrate tablet (Sigma, USA) 1 정을 substrate buffer 20mL 에 녹여 membrane 에 반응시켰다.

3) Immunofluorescence assay 시행

Nf-profilin 단백질의 세포 내 발현 위치를 관찰하기 위해, 파울러자유아메 바 영양형과 포낭형(각각 5×^cells/mL 개)을 1mL 의 Nelson’s complete 배지에 넣고, 6 wells culture plate (BD Bioscience, USA) 안에 놓아둔 cover glass 위에 seeding 하고 37 ̊C 에서 1 시간 배양하였다. 먼저 아메바 영양형에서의 Nf-profilin 단백질을 관찰하기 위해 세포가 커버글라스에 부착 되도록 1 시간 정도 배양하고 광학현미경으로 부착여부를 확인하였다. 파울러 자유아메바 포낭형을 유도하기 위해 위와 동일한 방법으로 영양형을 배양한 뒤 커버글라스에 부착되도록 37 ̊C 배양기에서 1 시간 정도 배양하였다. 세포배양 액을 제거한 후에 Nelson’s incomplete 배지를 넣어 영양분의 공급을 감소시 켰다. 18 시간 배양 후에 배지를 제거하고, 파울러자유아메바 포낭형성배지로 교체 해준 뒤 10 시간동안 배양하였다. 그리고나서 아메바의 영양형 및 포낭형 을 CHO 세포에 각각 1, 3, 6, 12 및 24 시간동안 혼합배양하였다. 혼합배양액 을 제거하고 0.85% saline 에 희석한 4% formalin 용액을 실온에서 10 분간 반응시켜 커버글라스에 세포를 고정하였다. PBS 로 세포를 세척하고 1% 암모 니아수(NHPO4)와 0.5% tween-20 용액을 각각 5 분씩 처리하여 세포막의 투과성을 높여주었다. 항체를 붙이기 전 비특이적 단백질들이 세포에 붙는 것 을 방지하기 위해 3% BSA 용액으로 1 시간 블로킹 처리하였다. 1 차 반응항체

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포함된 mounting media (VectorLabs, USA)를 10uL 떨어뜨린 후 슬라이드 글라스에 올려놓아 고정시켰으며, Axiovert 200M 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany) 및 LSM710 공초점 레이저 주사현미경(Carl Zeiss, Germany)으 로 아메바 내의 Nf-profilin 단백질 발현 위치를 관찰 및 분석하였다. 또한, CHO 세포와 혼합배양 했을 때 아메바 Nf-profilin 단백질의 발현위치 변화를 보기 위해, 먼저 monolayer 로 배양된 CHO 세포의 형태학적 관찰을 위한 형광 대비염색으로 10uM 의 CM-SNARF(chloromethyl seminaphthorhodafluor –1 acetate)을 처리하고 30 분간 37 ̊C, 5% CO² 배양기에서 배양하였다. 아메 바 영양형과 포낭형(각각 5×^cells/mL 개)을 CHO 세포와 1, 3, 6, 12 및 24 시간 혼합배양하고, 위에서 시행한 동일한 방법으로 세포를 고정하였으며, 항체를 처리한 뒤 세포 내의 유전자 위치를 형광 현미경 및 공초점 레이저 주 사현미경으로 관찰하였다.

III. 결 과

1. 파울러자유아메바의 포낭 형성에 따른 Nf-profilin 유전자의 발현량 변화

1) 파울러자유아메바의 포낭형성 유도

파울러자유아메바의 포낭형을 유도하기 위하여 배양중인 파울러자유아메바 영양형을 Nelson’s incomplete 배지에서 영양분 공급을 감소시킨 뒤 포낭형 성 배지를 넣어주어 37 ̊C 배양기에서 3, 6, 9, 12 및 24시간 배양하여 형태 학적인 변화를 광학 현미경으로 관찰하였다. 포낭형성 유도 배양 3시간에는 아 메바 영양형이 수분이 빠져 움츠러드는 듯한 형태를 보이다가 6시간부터는 아 메바 내부의 액포(vacuole)가 팽창하는 양상이 관찰되고, 점차 위족(pseudopodia) 이 사라지며 동그란 원형의 형태로 변해가는 것을 관찰하였다(Fig. 4). 9시간 이후부터 대부분의 아메바들이 둥근 형태의 전포낭(precyst)으로 변화하였으 며, 몇몇의 두꺼운 벽을 가진 완전한 포낭형(cyst)들도 약간 떠있는 상태로 관 찰되었다(Fig. 4). 이후 12시간부터는 아메바의 세포막이 파괴되어 사멸되기 시작한 아메바들이 관찰되었으며, 24시간 이후부터는 대부분의 아메바가 사멸 한 것을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 포낭 형성 유도 9시간 경과 된 아메바의 포낭형을 본 실험에 이용하였다.

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Fig. 4. Observation of N. fowleri trophozoites and cysts after the induction with encystment medium for 3, 6, 9, 12 and 24 hr. Arrows indicate cysts. Scale bar, 20um. x400.

2) Nf-profilin 유전자 발현의 RT-PCR 결과

파울러자유아메바의 형태에 따른 Nf-profilin 유전자 발현 차이를 확인하 기 위하여 먼저 영양형과 포낭형의 아메바 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하 였다. 합성된 cDNA를 이용하여 RT-PCR로 수행한 결과, Nf-profilin 유전자 는 약 450 bp, Nf-actin 유전자는 약 1.2 kb 에서 발현이 관찰되었다. Nf-profilin 유전자는 아메바의 영양형에 비해 포낭형에 더 많이 발현되는 것을 확인한 반 면, Nf-actin 유전자는 파울러자유아메바의 영양형에 많이 발현하였다(Fig.

5). 추가적으로 아메바가 숙주세포에 부착하기 위한 위족 형성과 관련이 있는 nfa1 유전자 또한 영양형에서 많이 발현하였다. Nae3 유전자와 Nf-GAPDH 유전자는 파울러자유아메바에 대한 대조군으로 사용하였다(Fig. 5).

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Fig. 5. Nf-profilin and Nf-actin gene expression level in N. foweleri trophozoites and cysts. T, N. fowleri trophozoites; C, N. fowleri cysts;

Nfa1, pseudopodia-specific gene of N. fowleri; Nae3 and Nf-GAPDH were used for the control genes. M, DNA size marker.

3) SDS-PAGE 및 Western blotting 분석

파울러자유아메바 형태에 따른 Nf-profilin 단백질 발현 차이를 비교하기 위해 파울러자유아메바의 포낭형 및 영양형의 전체 세포추출액(lysate)을 이용 하여 SDS-PAGE를 수행한 뒤 Nf-profilin 단클론항체를 처리하여 Western blotting을 수행한 결과, 아메바의 포낭형 세포추출액에서 Nf-profilin 단백질 발현이 22KDa 반응대에서 확인되었다(Fig. 6).

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Fig. 6. Expression level of Nf-profilin protein in N. fowleri trophozoites and cysts. A, SDS-PAGE results of lysates of N. fowleri trophozoites and cysts. B, Western blotting results of N. fowleri trophozoites and cysts with Nf-profilin monoclonal antibody. Arrow indicates the reacting band with 22KDa molecular weight. T, N. fowleri trophozoites;

C, N. fowleri cysts; M, protein size marker.

2. 파울러자유아메바 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치

1) 형광 현미경 관찰 결과

파울러자유아메바 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 를 확인하고자 Nf-profilin 단클론항체(anti-Nf-profilin monoclonal antibody) 을 이용하여 면역형광염색법(Immunofluorescence assay)을 수행하였다. 그 결과, Nf-profilin 단백질은 파울러자유아메바 포낭형의 세포질 내 액포 (vacuoles) 부분을 제외한 전체에서 강하게 발현하는 것을 확인하였다. 반면, 영양형에서는 세포의 내부나 위족 부분에 한정적으로 약하게 발현하였다(Fig.

7A). 한편, Nf-profilin 단백질이 결합한다고 알려진 Nf-actin의 항체를 처 리하여 동일한 실험을 진행하였을 때, Nf-actin의 항체를 처리한 영양형에서 는 food-cups로 추정되는 부분에서 Nf-actin 단백질이 강하게 발현하였으나 포낭형에서는 세포질 내에 형성된 food-cups 부분에서만 약하게 발현되었다 (Fig. 7B).

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Fig. 7. Localization of Nf-profilin and Nf-actin protein in the N. fowleri trophozoites and cysts by a fluorescence microscope. Immunofluorescence assay were carried out using Nf-profilin monoclonal antibody(A) and Nf-actin antibody(B) conjugated with DAPI and FITC, respectively.

T, N. fowleri trophozoites; C, N. fowleri cysts.

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2) 공초점 레이저 주사(confocal) 현미경 관찰 결과

아메바 영양형과 포낭형 내부에서 발현되는 Nf-profilin 단백질의 위치를 보기 위하여 앞선 결과에 추가적으로 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였 을 때, 영양형에서는 대부분 아메바의 위족 말단 부분에서 발현되는 경향을 보였으며 포낭형에서는 아메바 내부 전체에 Nf-profilin 단백질이 발현하는 것으로 관찰되었다(Fig. 8). 동일한 방법으로 실험을 진행하여 Nf-actin 단 백질의 위치를 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과, 영양형에서는 아 메바의 food-cups에 Nf-actin 단백질이 매우 강한 발현을 보였으며 포낭형 에서는 세포 내부에서만 약한 발현을 보였다(Fig. 9)

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Fig. 9. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri trophozoites and cysts by a confocal microscope. T, N. fowleri trophozoites; C, N.

fowleri cysts. x800.

3. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용과 Nf-profilin 유전자 발현

1) 혼합배양시간에 따른 파울러자유아메바의 형태학적 변화

표적세포가 있을 때 파울러자유아메바의 포식작용 여부를 형태학적으로 관찰하기 위하여, 표적세포인 CHO 세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭 형을 각각 혼합배양 후, 위상차 현미경을 이용하여 파울러자유아메바의 식세포 작용(phagocytosis) 등 형태학적 변화를 관찰하였다. 아메바를 처리하지 않은 CHO 세포(대조군 I 및 II)는 24시간 동안 계속해서 분열하여 증식하는 양상 을 보였다. CHO 세포에 아메바의 영양형과 포낭형을 각각 배양한 경우(실험군 I 및 II)에서는 시간이 경과함에 따라 아메바의 식세포 작용에 의해서 수가 줄 어들고 둥근 모양으로 변화하거나 culture flask 바닥에 CHO 세포가 붙어있던 흔적만이 남아있는 것을 볼 수 있었다(Fig. 10).

CHO 세포에 아메바의 영양형만을 혼합배양한 실험군 I에서는 배양 1시간 부터 아메바들이 포식작용을 하기 위해 숙주세포 주위에 모여들며, 이미 달라 붙어 있는 형태도 많이 관찰되었다(Fig. 10). 관찰 6시간부터는 아메바가 CHO 세포를 빠르게 포식하기 시작해 12시간 이후부터는 CHO 세포보다 아메 바의 수가 더 많이 관찰되었다. 배양 24시간에는 대부분의 CHO 세포는 흔적

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이 관찰되었다(Fig. 10). 혼합배양 6시간부터는 포낭형의 아메바들이 탈낭을 거쳐 영양형으로 변화하기 시작하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이미 영양형으 로 변화하여 CHO 세포에 붙어있는 양상 또한 볼 수 있었다(Fig. 10). 12시간 부터는 대부분의 포낭형이 영양형으로 변화하여 CHO 세포를 빠르게 포식하고 있었다. 혼합배양 24시간에는 포낭형을 거의 찾아보기 힘들고, CHO 세포의 개 체 수는 현저히 줄어든 것을 볼 수 있었다(Fig. 10). 실험군 모두 혼합배양 시 간이 경과함에 따라 CHO 세포의 수는 크게 감소하였다.

Fig. 10. Microscopic observation of N. fowleri co-cultured with CHO cells, which show the phagocytosis post co-incubation for 1, 3, 6, 12 and 24 hr. Control GI, CHO cells in DMEM; Control GII, CHO cells in DMEM mixed with Nelson’s medium; Exp GI, CHO cells with N.

fowleri trophozoites; Exp GII, CHO cells with N. fowleri cysts. Nf, N.

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2) 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 Nf-profilin 유전자의 시간별 발현량 변화

A. RT-PCR 결과

표적세포와 파울러자유아메바를 혼합배양 하였을 때 발현되는 Nf-profilin 유전자의 시간별 발현량의 차이를 확인하기 위하여, 시간별로 혼합배양한 세포 를 모아 cDNA 를 합성하여 RT-PCR 을 수행하였다. 결과를 보면, 아메바 영 양형을 혼합배양한 실험군 I 에서는 Nf-profilin 유전자의 발현레벨이 1 시간부 터 낮은 레벨을 보였으며 24 시간까지 거의 동일한 양상을 나타냈다. 반면, 포 낭형을 혼합한 실험군 II 에서는 영양형을 혼합배양한 실험군에 비해 1 시간에 가장 높은 발현 수준을 보였고, 3 시간부터 낮아지기 시작하며 6 시간부터 24 시간까지 약하게 발현하였다(Fig. 11). 한편 Nf-actin 및 nfa1 유전자는 파울 러자유아메바 영양형에서 주로 발현 레벨이 높았고, 혼합배양 시간에 크게 영 향을 받지 않았다(Fig. 11).

Fig. 11. Nf-profilin gene expression levels in N. fowleri co-cultured with CHO cells for 24 hr. 1, CHO cells in DMEM; 2, CHO cells in mixture medium with DMEM and Nelson medium; 3, CHO cells with N. fowleri trophozoites; 4, CHO cells with N. fowleri cysts. Nf-actin and Nfa1 gene were used for the trophozoite-dominant gene, CHO GAPDH, Nf-GAPDH and Nae3 gene were used for the control group.

M, DNA size marker.

- 38 - B. Real-time RT-PCR 결과

앞서 실험한 RT-PCR 을 정량화 하기위하여 real time RT-PCR 을 수행한 결과, CHO 세포와 혼합배양한 파울러자유아메바의 영양형에서는 배양이 안정적으로 되기 시작하는 3 시간 이후로는 큰 변화폭 없이 일정하게 낮은 발 현 수준을 보였다(Fig. 12). 파울러자유아메바의 포낭형만 혼합배양한 실험군 II 에서는 1 시간 경과 했을 때, 영양형을 배양한 실험군 I(1.608)보다 2.5 배 이상 높은 발현레벨(4.124)을 보였다. 혼합배양 3 시간 경과 시 포낭형들이 전포낭형으로 변화해가면서 Nf-profilin 유전자 발현 레벨이 감소하였고, 시 간이 경과할수록 발현레벨이 감소하였으며, 영양형만 혼합한 실험군 I 과 동일 하게 6 시간 이후로는 일정한 발현레벨을 보였다(Fig. 12). 결과는 대조군으 로 사용한 Nf-GAPDH 유전자의 CT 값과 Nf-profilin유전자의 CT 값의 상 대적인 차이를 이용하는 comparative 2-∆∆CT 방법으로 분석하였으며, 실 험은 3 번 이상 반복한 평균값을 이용하였다.

Fig. 12. Nf-profilin gene expression level of N. fowleri co-cultured with CHO cells, which was estimated with real time RT-PCR for 24 hr. Control GI, CHO cells in DMEM; Control GII, CHO cells in DMEM mixed with Nelson’s medium; Exp GI, CHO cells with N. fowleri trophozoites; Exp GII, CHO cells with N. fowleri cysts.

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4. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바 Nf-profilin 단백질의 발현 위치

1) 형광 현미경 관찰 결과

파울러자유아메바가 숙주세포를 포식 할 때 Nf-profilin 유전자가 관여 하는지 알아보기 위하여, CHO 세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 혼합배양 후 면역형광염색법(Immunofluorescence assay)을 수행하여 Nf-profilin 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 파울러자유아메바의 포낭형을 CHO 세포와 혼합배양한 실험군 II의 배양 1시간 후, 아메바들은 CHO 세포 에서 따로 떨어져있거나 CHO 세포에 가까이 붙어있어도 대부분 포낭형태를 유지하였으며 Nf-profilin 단백질의 발현 위치변화가 크게 없었다. Nf-profilin 단백질은 아메바 포낭형 전체에서 발현하는 것으로 보였다. 혼합배양 3시간 경과 후 포낭형에서 위족이 생성되며 액포(vacuoles)가 팽창하기 시작하였고, 아메바가 둥근 모양을 유지하고 있는 부분에서 주로 Nf-profilin 단백질이 발 현하였으며, 세포질 전체에서 발현하던 Nf-profilin 단백질이 세포의 안쪽 또 는 위족의 끝으로 몰리는 듯한 양상을 보였다(Fig. 13). 배양 6시간 경과 후 파울러자유아메바 포낭형들은 대부분 완전한 영양형으로 변화하여 여러개의 위족과 food-cups이 생성되었으며, 분화를 시작해 핵이 여러개인 세포도 있 었다. Nf-profilin 단백질은 대부분 아메바 안쪽으로 들어가는 듯한 경향을 보이며 발현 양이 매우 감소하였다(Fig. 13). 혼합배양 12시간 이후로는 CHO 세포 주위에 아메바의 영양형이 많이 붙어서 포식작용을 하는 것이 관 찰되었고, CHO 세포 수는 감소하였으며 CHO 세포의 세포막이 깨지며 대부 분 둥근 모양으로 변화하였다. 이 때 Nf-profilin 단백질은 영양형 위족의 말

단이나 세포 내부에서만 약하게 발현하였다(Fig. 13). 반면, 파울러자유아메 바의 영양형을 CHO 세포와 혼합배양한 실험군 I에서는 1시간부터 24시간까 지 Nf-profilin 단백질이 세포 안쪽에서만 약하게 발현하는 비슷한 양상을 보 였다(Fig. 14).

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Fig. 13. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri cysts co-cultured with CHO cells by immunofluorescence assay using Nf-profilin monoclonal antibody. Arrows, N. fowleri cysts and trophozoites; Arrow head, CHO cells. Scale bar, 20um. x400.

Fig. 14. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri trophozoites co-cultured with CHO cells by immunofluorescence assay using Nf-profilin monoclonal antibody. Arrows, N. fowleri trophozoites and cysts; Arrow head, CHO cells. Scale bar, 20um. x400.

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추가적으로 Nf-profilin과 관련된 Nf-actin 단백질의 발현 양상을 관찰한 결과, 아메바 포낭형을 CHO 세포와 혼합배양한 실험군 II에서는 1시간에 대부 분 Nf-actin 단백질의 발현이 매우 약하였는데, 3시간에 food-cups가 형성되 기 시작하면서 CHO 세포를 포식하고 있는 아메바의 세포질 전체에서 발현하 며 특히, food-cups 부위에 강하게 발현하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 15). 혼 합배양 6시간 경과 이후부터는 대부분 완전한 영양형으로 변화하여 여러개의 위족과 food-cups이 생성되었고 특히, CHO 세포에 접촉되어있는 food-cups 에서 Nf-actin 단백질이 강한 발현을 보였다(Fig. 15). 반면, 아메바 영양형을 CHO 세포와 혼합배양한 실험군 I에서는 1시간부터 CHO 세포에 붙어서 포식 작용을 하며 Nf-actin 단백질이 food-cups에서 강하게 발현하는 양상을 보였 다(Fig. 16). 이후 배양시간대도 동일한 결과를 보였으며, CHO 세포는 시간이 경과 할수록 아메바의 포식작용에 의해 수가 줄어들고 세포막이 깨지며 둥근 모양으로 변화하였다(Fig. 16).

Fig. 15. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri cysts co-cultured with CHO cells by immunofluorescence assay using Nf-actin antibody. Arrows, N. fowleri cysts and trophozoites; Arrow

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Fig. 16. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri trophozoites co-cultured with CHO cells by immunofluorescence assay using Nf-actin antibody.

Arrows, N. fowleri cysts and trophozoites; Arrow head, CHO cells.

Scale bar, 20um. x400.

2) 공초점 레이저 주사현미경 관찰 결과

파울러자유아메바의 포낭형이 영양형으로 변화해가는 과정에서 Nf-profilin 단백질의 위치변화를 1시간부터 24시간까지 공초점 레이저 주사현미경으로 관 찰한 결과, 1시간의 포낭형 내부 전체에서 높은 발현량을 보였으며 혼합배양 3 시간부터 아메바 포낭형에 위족이 형성되기 시작하면서, 세포질 전체에 발현하 던 Nf-profilin 단백질이 위족이 시작되는 부분으로 몰리는 경향을 보였다. 6 시간 이후부터는 대부분의 아메바가 완전한 영양형으로 변화하면서 세포 내부 에서만 약하게 발현하였다(Fig. 17).

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Fig. 17. Localization of Nf-profilin protein in N. fowleri cysts co-cultured with CHO cells for 24 hr by a confocal microscope.

Arrows, N. fowleri trophozoites and cysts; Arrow head, CHO cells.

Scale bar, 20um. x400.

IV. 고 찰

중추신경계를 침투하여 급성의 아메바성 뇌수막염을 일으키는 것으로 알려 져있는 파울러자유아메바(N. fowleri)는 전세계 도처에 분포하고 있다. 토양이 나 따뜻한 담수가 주요 서식지이며, 대부분의 감염환자들이 수상레포츠 등으로 비강과 후신경을 통해 감염이 되는 것으로 알려져 있지만 가정의 수돗물에서도 검출된다는 보고도 있다(Marciano-cabral, 1988; Kang 등, 2020). 또한, 최 근 미국 CDC의 역학조사 결과, 미국 텍사스주의 수돗물 11개 샘플 중 3개의 샘플에서 파울러자유아메바가 검출되어 재난지역으로 선포되기도 하였다(Hamaty 등, 2020). 지구온난화로 인한 기온 상승은 호열성인 파울러자유아메바의 서식 지 확대를 야기하여 더 많은 감염이 발생할 수 있을 것으로 보고되고 있다 (Siddiqui 등, 2016). 파울러자유아메바가 오염된 물이 사람들의 코로 접촉하 게 되면 아메바들이 비강을 통해 들어가게 되고 후신경을 침투하여 중추신경계 로 들어가 뇌조직을 파괴하게 되는데, 인체 내 뇌 감염이라는 병리적 특성 때 문에 임상적 증상만으로 쉽게 진단이 어렵다(Barnett 등, 1996).

파울러자유아메바의 병인기전은 숙주세포에 아메바의 접촉 및 세포용해물질 등을 분비하여 숙주세포의 세포사멸을 유도하는 세포병변효과가 일어난다고 보 고되고 있는데, 기존 연구를 정리하면 파울러자유아메바의 병인기전으로는 다 음과 같은 가설이 가능하다. 첫째, 파울러자유아메바로부터 수용성의 용해물질

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의 접촉성 병인기전이 있다(Cho 등, 2003; Sohn 등, 2019). 이와 관련된 nfa1 유전자는 아메바의 위족에 특이적으로 발현한다고 보고되었다(Shin, 2010). 또한, molecular charperon으로서 food-cups 형성과 관련된 hsp70 유전자가 보고되었다(Song 등, 2008). 한편, 세포의 골격구조변화에 관여하는 Nf-actin 단백질은 polymeric fibrous actin (F-actin)과 monomeric globular actin (G-actin)의 polymerization에 수반되는 단백질이며, 아메바의 식세포 작용을 위해 생성되는 소기관 중 하나인 food-cups에 많이 발현한다고 알려 져 있다(Sohn, 2010, Sohn 등, 2019). 이처럼 위족운동과 식세포작용이 활발 한 영양형에서 nfa1 및 Nf-actin 유전자가 클로닝 되었지만 포낭형에 더 많이 발현하는 유전자에 대한 연구는 아직도 미미한 편이다.

파울러자유아메바는 핵과 세포질 내에 공포(cytoplasmic vacuoles), 식포 및 수축포들을 많이 갖고 있으며 온도, 환경 및 영양상태 등에 따라 영양형에 서 포낭으로 바뀌는데 이를 포낭형성과정(encystation)이라 한다. 포낭형성과 정에서 아메바는 먹이 부족과 건조로부터 자기 자신을 보호하는 역할을 가진 다. 아메바의 포낭형성은 항생제를 약효를 저해시키는 주요 요인으로 알려져있 는데(Moon 등, 2009), 포낭형에서 많이 발현되는 유전자를 통해 포낭형성을 억제할 수 있는 기전을 밝혀낸다면 아메바의 병원성을 분석하는데에 도움이 될 것이라고 생각한다. 따라서 먼저 파울러자유아메바의 포낭형에서 많이 발현되 는 유전자(단백질)들을 클로닝하고, 유전자의 세포 내 발현 양상을 관찰하는 것이 중요하다. 앞선 연구에서는 포낭형에서 과발현되는 Nf-profilin 유전자가 클로닝 되었으며 제반정보를 이용하여 생산된 재조합 단백질(Nf-profilin)을 이용하여 실험에 적용하였다. Profilin은 동물 및 식물, 바이러스 등에서 actin 에 결합하는 단백질로써 생물체 내에서 필수적으로 존재한다. 다수의 결합 단

백질과의 상호작용을 통해 세포골격구조 변화의 활성인자로서의 기능을 한다고 알려져있으며, 세포의 분화와 새로운 핵 형성을 저해한다고 한다. 높은 농도의 profilin은 세포골격구조에 영향을 주며 actin polymerization을 방해하게 된다 (Gunning 등, 2015; Alvarado 등, 2014). 따라서 본 연구에서는 파울러자유 아메바의 영양형과 포낭형에서 다르게 발현하는 Nf-profilin 유전자의 발현량을 비교하였으며, 표적세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 배양하여 표적세포에 대한 아메바의 식세포작용 및 형태학적 변화에 따른 Nf-profilin 단백질 발현량을 확인하는 실험을 진행하였다. 먼저, 파울러자유아메바의 영양 형을 포낭형성배지에서 배양하여 포낭형을 유도하였고, 형성된 포낭형과 영양형 의 Nf-profilin 유전자 발현 양을 RT-PCR, real-time PCR 그리고 Western blotting을 통해 측정하였다. RT-PCR 결과, 포낭형에서 450 bp 크기의 발현 을 확인하였고 영양형에서는 포낭형보다 확연히 낮은 발현을 보였다. 반면 Nf-actin 유전자는 파울러자유아메바 영양형의 1.2 kb 크기에서 강하게 발현 한 밴드를 확인할 수 있었지만, 포낭형에서는 영양형에 비해 확연히 낮은 발현 수준을 확인하였다. 또한 Western blotting을 수행하였을 때에도 RT-PCR과 비슷한 결과를 얻었는데, 영양형에서는 Nf-profilin 유전자의 발현이 거의 되 지 않았지만 포낭형에서는 22kDa의 반응대에서 뚜렷하게 발현된 단백질을 볼 수 있었다. 따라서 Nf-profilin 유전자는 아메바 영양형보다 포낭형에서 확연 하게 많이 발현한다는 것을 확인하였다.

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단백질은 직접적으로 관여하지 않는다고 생각되어진다. 식세포작용을 하지 않 는 포낭형에서는 세포의 액포(vacuoles)부분을 제외한 세포 전체에서 발현되 는 것이 관찰되었는데, 영양형에서 점차 포낭형으로 형태가 변화할 때 포낭형 의 세포질 전체에서 발현 양이 증가하는 것으로 생각된다.

이후 표적세포에 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형의 혼합배양실험을 진행하였다. 표적세포인 CHO 세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 혼합배양한 후 시간별로 파울러자유아메바의 형태학적 변화를 관찰하였 다. 각각의 실험군 모두 배양시간이 경과함에 따라 표적세포의 수는 감소하였 으며, 살아있는 표적세포들은 모양이 둥근 형태로 변화하였다. 이는 주로 기생 충에서 분비되는 시스테인분해효소에 의해 표적세포의 구조단백질이 파괴되어 표적세포의 영양분을 파울러자유아메바가 섭취하였기 때문이라고 생각되어진다 (Na 등, 2006; Long 등, 2015). 아메바 영양형을 혼합배양 한 1시간부터 파 울러자유아메바가 위족운동을 통해 표적세포로 향하는 모습이 많이 관찰되고, 이미 표적세포에 달라붙어 빠르게 식세포작용을 하는 모습을 관찰할 수 있었다.

혼합배양 시간이 경과함에 따라 식세포작용에 의해 표적세포의 수는 매우 빠르 게 감소하였으며 파울러자유아메바만 분열하여 증식하였다. 포낭형만 처리한 실험군에서는 1시간에는 대부분 배지에서 약간 떠있는 상태로 관찰되었으며 3 시간에는 포낭형이 표적세포의 근처에서 발견되고 위족이 약간 튀어나온 전포 낭 형태를 많이 볼 수 있었다. 이는 식세포작용을 위하여 표적세포를 향해 움 직이기 위해서 위족이 형성된 것으로 보인다. 혼합배양 6시간부터는 포낭형의 80% 이상이 영양형으로 변화한 형태가 관찰되었으며 아메바 내에 액포(vacuoles) 가 많이 형성되었다. 표적세포에 달라붙어서 포식하는 속도가 매우 빠르며 food- cups이 형성되어 식세포작용을 하는 양상을 보였다. 12시간부터는 다수의 아

메바가 여러개의 위족과 food-cups을 가진 완전한 영양형으로 변화하였으며 표적세포의 수가 눈에 띄게 감소하였다. 표적세포의 세포막이 완전히 파괴되고 죽은 세포의 흔적만 남은 것을 볼 수 있었다.

표적세포와 혼합배양 시 Nf-profilin 유전자의 발현이 어떻게 변화하는가를 알아보기위해 표적세포와 아메바를 혼합배양시간별로 세포를 얻은 후에 RT- PCR을 진행하여 비교하였다. 그 결과 포낭형만 혼합배양한 실험군에서 1시간 에 가장 높은 Nf-profilin 유전자의 발현 레벨이 보이며, 배양시간이 지날수록 감소하고 이후 6시간부터 24시간까지는 거의 비슷한 발현 레벨을 보였는데 이 것은 아메바가 영양형으로 바뀌면서 Nf-profilin 유전자의 발현이 저하된 것으 로 생각된다. 영양형만 혼합배양한 실험군에서는 1시간, 3시간에는 다른 시간 보다 조금 높은 듯 하다가 6시간 이후로 24시간까지 일정한 발현량을 보였으 며 , 포낭 형 만 혼합 한 실 험군 보다 확연 히 적은 발현 량을 보였 다. 이 러 한 RT-PCR 결과를 정량화하기 위하여 RT-qPCR을 진행하였을 때, 포낭형만 처리한 실험군이 영양형만 처리한 실험군보다 배양 1시간에서 2.5배 이상 높 은 발현 레벨이 확인되었다. 3시간부터는 시간이 지날수록 발현량이 감소하였 는데, 식세포작용을 통한 영양분 섭취로 인해 포낭형의 아메바가 점차 영양형 으로 변화하며 Nf-profilin 유전자의 발현 레벨이 줄어든 것으로 생각된다. 영 양형만 혼합한 실험군의 1시간에서 다른 시간대보다 발현 레벨이 높은 이유는 혼합배양 전에 아메바를 PBS로 여러번 워싱하면서 아메바의 영양형이 안정되

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화를 관찰한 실험 결과, 아메바 포낭형만 혼합배양한 실험군에서 배양 1시간에 서 대부분 완전한 포낭 형태의 아메바의 세포질 전체에서 Nf-profilin 단백질 이 발현된 것을 관찰할 수 있었다(표적세포는 SNARF-Red 염색을 통해 아메 바와 구분하였고 혼합배양한 아메바에 Nf-profilin 항체를 처리 후 포낭형에서 영양형으로 변화하는 과정에서 Nf-profilin 단백질은 형광염색-Green). 3시 간에서 포낭형에서 위족이 나오기 시작하면서 표적세포 쪽으로 위족이 향하는 모습을 볼 수 있었으며, Nf-proflin 단백질이 세포의 한쪽 방향으로 몰리는 듯 한 양상이 관찰되었다. 아메바에서 위족이 생성되는 부분과 반대편에 주로 위 치하다가 완전한 영양형이 된 6 시간 경과 후에는 아메바 위족 또는 food-cups 의 일정부분으로 모이며 발현량이 더욱 감소하였다.

Nf-profilin 단백질과 비교하기 위해 Nf-actin 단백질을 같은 방법으로 실 험을 진행하여 형광 현미경을 관찰하였을 때, 포낭형을 표적세포와 1시간 혼합 배양한 실험군에서 아메바 포낭형에서 Nf-actin 단백질은 거의 발현하지 않았 으며 3시간 경과 후 food-cups이 형성된 전포낭 형태에서 CHO 세포와 접촉 된 food-cups 부분에 특이적으로 발현하는 Nf-actin 단백질을 확인할 수 있 었다. 특히, 혼합배양 시간이 경과함에 따라 아메바가 대부분 영양형으로 변화 하여 표적세포에 부착된 food-cups 부분에서 Nf-actin 단백질이 강한 발현을 보이는 것을 확인하였다. 또한 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포 내부에서 발현되는 Nf-profilin 단백질을 관찰한 결과, 혼합배양 1시간에 포낭형의 세포 내부 전체에서 강한 발현을 보였다. 3시간에 포낭형에서 위족이 나오기 시작하 면서 아메바의 위족이 시작되는 부분에 Nf-profilin 단백질이 모여드는 경향을 보였다. 6 시간 이후 포낭형이 대부분 완전한 영양형으로 변화하면서 Nf-profilin 단백질은 세포 내부의 핵 근처 또는 위족 말단에서만 적은 양으로 발현하였다.

이러한 결과는 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 결과와 반대의 현상으로 본 실 험의 가설을 입증한 것으로 생각된다.