6). 내부 정도관리
Blank 측정 오염 여부 확인, 영구 표준 시료로 계측, 변이계수 측정 7). 외부정도관리
각 검사실 간의 검사값의 비교, 저농도, 중간농도, 고농도의 검사
8). 정도관리의 관리도 정도 관리도의 작성
9). 검사의 실수
검체, 시약, 실험조작, 계산, 기록 및 보고
※. 오차의 체계적인 원인 규명 방법 제1단계 문제점의 구분
제2단계 관련된 사람 모두 문제점 토의 제3단계 기능성 원인 목록 작성
Reagent 환경 측정기기
tracer antibody
Standard sol.
poor serum 분리시약 buffer
temp.
time pH
간섭물질
pipette 측정기기 calculation 냉장, 냉동고 centriguge mixer
Test tube
12. 검사의 수행 및 관리 1). 검체의 관리
①. 검체의 채취와 보관에서 여러가지 간섭 물질들이 오염되어 예측치 못한 값을 나타낼 수 있으므로 검체의 조건(Hemolysis, 고지방혈, 고빌리루빈혈 등)을 검사실에서 도착 즉시 기록한다.
②. 호르몬을 검사시 일내변동과 주기분비의 특성 때문에 채혈 시간을 기록.
③. 채혈하여 혈장은 항응고제(EDTA, 헤파린, 또는 ACD)와 혼합하여 분리.
빈 시험관에 채혈, 실온 또는 4℃에서 30분이상 방치 후 원심분리하여 혈청 분리.
④. 항온수조 온도, 냉장고나 냉동고의 온도 계측기의 안정성을 매일 기록과 점검하여 검사결과에 미치는 영향을 감시한다.
⑤. 정도관리된 파이펫을 사용하여 기구오차를 최소화 한다.
2). 키트(Reagent)의 관리
①.방사성의약품 키트를 수령하면 즉시 키트 별로 규격, 수량, 유효기간 반드시 확인
②. 키트내의 표준액, 표지항원, 항혈청등 시약병이 파괴되지 않았나 확인하고 이상이 있으면 따로 보관한다.
③. 각 키트들의 보관, 저장방법을 확인하여 냉장실(4℃)또는 냉동고(-20℃)에 검사종목 키트별로 정리정돈 한다.
④. 꼭 유효기간 순서대로 사용하도록 한다.
※. 키트 선택시 고려할 사항
① 정밀도와 정확도를 일차적으로 고려한다.
② 검사에 걸리는 시간, 검체의 준비, 검사과정의 간편성, 필요한 검체량, 특수 과정의 필요성, 계수시간, 키트공급원의 신뢰도, 가격등을 고려한다.
③ 키트의 평가는 물질마다 고, 중, 저농도 범위에서 측정한다
④ 방사면역 측정용 키트내에 함유된 표지항원, 항혈청, 표준액, 항원유리혈청과 또한 분리방법으로 이용되는 제 2항체 단백질등은 주의해서 저장하지 않으면 파괴되기 쉽다.
⑤ 정상적으로 키트의 유효기간은 표지항원의 반감기에 의해 제한된다.
⑥ 단백질시약: 단백질 시약은 반복적으로 얼리고 녹이는 것을 피해야 한다.
⑦ 탈수된 단백질 시약
4℃ 냉장이 필요하며 시약을 복원한 후 일주일 이내에 사용해야 한다.
⑧ 얼린 단백질 시약
키트를 받는 즉시 시약병을 -20℃에 보관하고 각각의 검사를 시작할 때 냉동고로 부터 꺼내 사용한다.
⑨ PEG(polyethyleneglycol)와 DCC
PEG 는 4℃에 보관하고 DCC는 분말로 구입하여 복원시킨 후엔 반드시 냉장
3). 검사수행
①. 검체 및 검사 준비
ⅰ). 검체를 냉장고나 냉동고에서 꺼내 30분이상 해동시킨다.
ⅱ). 증류수를 첨가하여 검사시약을 재구성하고 해동한 검사 시약을 30분 이상 실온에 방치하여 준비한다.
ⅲ). 검사할 계획표를 작성하고 시험관 또는 트레이에 번호를 기록한다.
ⅳ). 표준액과 시료중 동결된 상태에서 해동한 것은 진탕후 원심분리하여 침전물을 제거한 상층액을 사용한다.
②. 검사
ⅰ). 준비된 시험관에 표준액, 정도관리혈청, 검체를 키트검사지시서에 지시된 일정량씩 넣는다.
ⅱ). 설명서에 따라 시약을 넣는다.
ⅲ). 지정된 시간동안 반응시킨다.
ⅳ). 반응이끝나면 결합형과 유리형을 분리한다.
ⅴ). 계측기에서 방사능을 계측한다.
4). 측정 : 방사능 계측기(Beta, Gamma counter)
① 감마선 계측기는 시험관을 바로 계측한다.
② 베타선 게측기는 액체섬광 계측기로서 액체 섬광체를 사용한다.
③ 액체섬광체는 베타선의 에너지를 받아서 빛으로 바꾸는 역할을 하는 물질이며 이것은 유기용매 중에서 여러가지의 섬광물질을 용질로 용해시키는 것이다.
④ 액체 섬광체는 ppo 5g popop 0.1g
Triton X-100 333ml
Toluene 667ml 의 비율로 혼합하여 만든다.
⑤ 혼합된 액체섬광체를 10ml씩 측정용기에 넣어 진탕기에 시료를 넣고 혼합 후 계측한다.
⑥ 소광 표준액으로부터 얻은 파라메터와 계측효율의 관계식으로부터 시료의 계측효율을 정하고 효율로 나누어 붕괴율 즉 방사능을 구한다.
5). 검사방법은 경합반응과 비경합반응으로 나눈다.
경합반응: 방사면역측정법, 방사수용체측정법, TSH결합억제면역글로불린측정법
비경합반응: 면역방사계수측정법, 방사성알레르겐흡수검사법, 포화분석법이 있다.
6). 방사면역측정법은 표지항원을 시료와 항체와 함께 넣고 반응시키는 평형방법 (equilibrium method)과 표지항원을 나중에 넣는 비평형방법(disequilibrium method)로 나눈다.
7). 결합/유리형 분리법 ① 제2항체 방법,
② 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ; PEG)
③ 황산암모늄으로 침전후 상층액을 쏟거나(decant) 흡인하는 방법 ④ 고형상법으로 셀룰로스(cellulose)미소구슬, polyacrylamide beads, polupropylene tube에 2nd Ab를 부착하여 쏟거나(decant), Asp.
2nd Ab에 철성분(iron oxide)를 부착하여 결합분획을 시험관에 바닥에 부착된
13. 검사 자체의 소요시간
1). 항원과 항체 및 표지항원을 함께 넣은 후 반응 시간은 37℃에서 1시간 이상 또는 4℃에서 24시간이 표준이다.
2). 검사구성에 따라 반응시간과 조건을 달리하게 된다.
3). 비평형방법의 경우는 항원과 항체를 먼저 일정시간, 37℃에서 1시간 이상 또는 4℃에서 24시간 방응 시킨다. (일차반응)
4). 표지항원을 첨가하고 2차반응은 37℃또는 실온에서 1시간에서 8시간까지 또는 4℃에서 24시간 반응시킨다.
5). 이중항체를 첨가하고 실온 또는 4℃에서 1시간 이내 반응시킨다.
6). 고형상법을 쓴 경우 10분간 원심분리후 흡인 또는 버리기, 세척, 상층액버리기 등 의 조작으로 분리한다.
7). 검사자체의 소요시간은 각각의 반응시간에 피펫조작 시험관 조작 등 반응사이의 과정에 각각 10분씩 소요된다.
14. 데이터 처리 및 보고
1) 표준액 함량에 따른 계측값으로 표준곡선을 만든다.
2) 반복측정쌍의 계측값을 읽고 계측변이계수를 구한다.
3) 정밀도 프로필을 작도한다.
4) 평균뱃치 변이계수나 프로필자체를 과거의 정밀도 프로필과 비교하여 검사자체 의 승인여부를 정한다.
5) 정밀도 프로필에서 측정범위 (working range)를 정한다.
6) 표준곡선에서 검체의 값을 찾는다.반복쌍측정변이계수를 과거의 정밀도 프로필 에 비추어 해당 검체의 수용여부를 정한다.
7) 희석하여 측정범위를 검사하고 희석배수를 곱하여 검체값을 정한다.
15. 방사면역측정법의 문제점 및 가능한 원인
문제점 가능성한 원인
어떤 시험관에서도 결합형이 없다 (모든 시험관이 비특이결합시험관 과 동일한 계측값을 갖는다
항체가 첨가되지 않음
표지항원이나 항체를 잘못 첨가 잘못된 분리방법(PEG 또는 이중
항체법에서 시험관에 침전물이 없음) 모든 시험관에서의 낮은 결합률 오래된 표지항원의 사용. 희석된 표지항원
이 너무적거나 혹은 희석된 항체가 너무많 거나, 그릇된 완충액의 pH
표준액이 0인 시험관(B0)과 같은 계측값을 갖는다
첨가된 표준액이 없다.
표준액이 잘못 첨가됨
높은 비특이결합률(NSB) 오래되거나 손상된 또는 부적절히 보관된 표지항원의 사용. 비특이결합 시험관에 항 체 첨가(비특이결합 시험관이 표준액이 0인 시험관과 동일)
표준곡선의 완만한 경사 사용된 표준액을 지나치게 희석 표지항원과 항체를 과다하게 사용 표준곡선의 급격한 경사 표준액의 희석률 차이가 많다.
표지항원과 항체를 너무 적게 사용 높은 정도관리혈청의 값 지나치게 희석된 표준액
보관하는 동안 혈청의 수분의 증발 낮은 정도관리혈청의 값 표준액의 낮은 희석
보관하는동안 변질된 정도관리혈청 이중항체법에서 침전물이 없슴 정상혈청, 제2항체가 첨가되지 않음 이중실험의 정확성 미흡 미흡한 기술 , 미흡한 피펫
낮은 총방사능 계측값 (total cpm) .
지나치게 희석된 표지항원
농축된 표지항원액에 방사능이 없음 시험관에서의 방사능 계측값이 표지항원이 첨가되지 않음
16. 외부정도 관리
1). 월 1회 또는 그 이상의 간격으로 학회 정도관리위원회의 시료를 받아 검사에 포함시켜 측정한다.
2). 정도관리위원회의 전체검사실에서 추린 평균값을 바람직한 검사값으로 두고 평균으로부터 표준편차의 1,2,3배 범위 내에 위치하는 횟수를 기록해 간다.