Background: Alpha-enolase (ENO1) is a multifunctional glycolytic enzyme ubiquitously expressed in the cytoplasm. Citrullinated

항 에놀라제-1 자극항체가 류마티스관절염 활액막 섬유세포의 조직 침습성에 미치는 작용연구

서울대학교 의과대학 내과학교실

신 기 철

Background: Alpha-enolase (ENO1) is a multifunctional glycolytic enzyme ubiquitously expressed in the cytoplasm. Citrullinated

Histologic analysis indicates that ENO1 is expressed in fibroblast-like synoviocytes (FLS), monocytes, and endothelial cells in the synovium. In pro-inflammatory conditions, ENO1 is translocated to the cell surface where it activates plasminogen. Its expression in monocytes mediates migration of the cells into inflamed lung tissues in animal models. The aim of this study was to investigate whether ENO1 can induce migration of FLS, the key constituent of pannus in RA synovium. Methods: FLS from RA synovial tissues were isolated and cultured in vitro. ENO1 expression on the cell surface was assessed by confocal microscopy. Cell surface-expressed ENO1 was stimulated with a mouse anti-human ENO1 monoclonal antibody. Stimulation with an isotype antibody was performed in parallel. Scratch test of cultured FLS and transwell experiments under platelet-derived growth factor (PDGF) were performed to assess FLS migration. Cytoskeletal rearrangement was analyzed after staining FLS with an anti-fillagrin antibody. Fluo-4 fluorophore was used for calcium-flux assays directly on discs plated with FLS. Results: Cell surface ENO1 expression was low in (5-6 passages) cultured FLS. However, TNF-alpha (10 ng/ml) induced ENO1 translocation to the cell surface, which peaked at 24 hours. Stimulation of cell surface-expressed ENO1 induced faster repopulation of FLS in the scratch test assay, and increased PDGF-induced transwell migration. Cytoplasmic actin filament rearrangement in FLS was markedly enhanced with ENO1 stimulation. Moreover, ENO1 stimulation induced a positive calcium flux response in FLS under intravital confocal microscopy. Conclusion: Translocation of cytoplasmic ENO1 to the cell surface in RA FLS is potentiated by TNF-alpha. Our results indicate that ENO1 can contribute to migration of RA FLS, especially in a pro-inflammatory milieu.

서 론

류마티스 관절염은 한국인의 1%가 이환되어 있는 만성 염증성관절염 질환으로 관절뿐만 아니라 전신을 침범하는 자가면역질환이다. 비록 최근에 항TNF-α 길항제를 비롯한 생물학적제제들의 등장으로 류마티스 관절염 치료의 획기적 인 발판을 마련했지만, 이 약제들에 치료반응이 없거나 부작 용에 의해 치료에 어려움을 겪고 있는 환자들이 적지 않은 실정이다. 류마티스 관절염의 병인에 대한 이해가 부족한 실 정이며, 유전적 및 환경적 요인, 적응면역(adaptive immunity) 의 기전에 대한 연구들이 진행 중이며, 최근에는 자가항체, 특히 시투룰린화(citrullinated) 자가항체에 대한 연구에 관심이

높이지고 있다. 항 CCP (citrullinated cyclic peptide) 항체를 포함한 인체 항 시투룰린 펩티드 항체(anti-citrullinated protein/

peptide antibody, ACPA) 중 최근 항 시투룰린 α-에놀라아제 항체가 37-62%의 류마티스 관절염 환자의 혈액에서 발견되고 있지만 이의 생물학적 효과에 대해서는 아직 규명된 바가 없다. 이 항체는 정상인이나 기타 자가면역질환을 가진 환자 에서는 3% 미만에서 발견되고 있다.

에놀라아제-1 (2-phospo-D-glycerate hydrolase, α-enolase, enolase-1, ENO-1)는 해당작용(glycolysis)에 관여하는 핵심 세포내 단백효소로서 해당작용외에도 암세포의 병태생리, 폐내 염증세포의 침윤, 플라스미노겐의 활성화에 기여하는 것으로 밝혀져 있다. 최근에 밝혀진 ENO-1의 특성으로 세포

Figure 1. Overview of the proposal.

를 활성화하는 자극(lipopolysaccharide, conconavalin A 등) 후 세포표면으로 이동하는 것으로 알려졌다. 세포표면에 발 현된 ENO-1의 기질로 플라스미노겐이 알려져 있으며 ENO-1에 의해 플라스민으로 전환된다. 이로써 ENO-1은 염 증반응, 단핵구의 이행(transmigration) 등에 관여하는 것으로 밝혀져 있다.

최근 류마티스 관절염 환자들의 말초혈액과 관절액에서 단핵구세포들을 분리하여 분석한 결과 처음으로 이 세포들이 ENO-1을 강하게 발현하고 있고 항 ENO-1 단일클론항체의 자극으로 TNF-α와 IL-1β 의 생성이 증가함이 규명되었다. 하 지만 활액막을 구성하는 기타 세포계열 중에서 ENO-1의 발 현 및 이의 생물학적 작용에 대해 연구된 바 없다. 류마티스 관절염 활액막조직의 중요한 소견은 판누스(pannus)에 의한 관절의 파괴이며, 판누스는 마치 암세포와 같이 증식성, 침 습성의 특징을 가지며 신생혈관의 증가를 동반하고 있다. 활 액막섬유세포(synovial fibroblast, fibroblast-like synoviocyte, FLS)는 판누스를 형성하는 가장 주된 세포로, 활액막섬유세 포의 활성화 기전에 TNF-α 같은 시토카인, LTB4 등의 케모 카인, 성장인자, protease-activated receptor 등에 대한 연구들 이 있어 왔으나, 세포표면으로 이동한 수용체를 매개로한 활 액막섬유세포의 활성화에 대한 연구는 이루어진 바가 없다.

본 과제는 항 ENO-1 자극항체를 이용한 활액막섬유세표의 활성화 및 이동성 증가에 초점을 맞추어 연구를 수행하였다.

연구범위 및 연구수행 방법(Fig. 1)

1. 활액막조직의 면역조직화학 염색 및 병리조직학적 분석 관절치환술을 받은 류마티스 관절염과 골관절염 환자의 활액막 조직을 채취하여 고정한 뒤 파라핀블록을 만들고 유 리슬라이드 위에 3um 두께의 조직을 올려놓은 뒤 ENO1 항 체를 사용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다(horse radish peroxidase-DAB). 광학현미경 관찰하에 저배율과 고배율에서 활액막 조직내 ENO1을 발현을 분석하였다.

2. 활액막섬유모세포 배양

위에서 언급한 수술 검체중 일부를collagenase 처리한 후 DMEM으로 wash한 뒤, 10% fetal bovine serum-DMEM을 사 용하여 실험실내 FLS 세포주를 배양하였다. 이하 실험에서 는 passage 5-7인 FLS 세포만을 이용하였다. ENO1의 세포표면

발현을 위해 실험 전 6 시간 동안 TNF-α (10 ng/mL)를 처리 하였고, 쥐 항ENO1 항체로 자극전 overnight serum starvation 조건을 유지하였다.

3. FACS 분석

FLS를 TNF-α (10 ng/mL)로 자극한 뒤, 1, 6, 12, 24 시간 째 FLS를cell-dissociation buffer로 세포를 분리하여 부유시키 고 일차항체인 쥐 항ENO1 항체를 붙인 뒤, washing에 이어 이차항체인 PE conjugated 항 쥐IgG 항체를 더한 후, washing 후 FACS로FLS의 ENO1 발현을 분석하였다.

4. 동일초점 현미경 검사(confocal microscopy) 100 mm dish에 배양된 FLS를 트립신으로 분리하여 25 mm 유리 디스크 위에 배양시킨 뒤, TNF-α 자극후 FLS의 ENO1 발현이나, 항ENO1 항체 자극 후 세포골격 재배열을 관찰 하기 위하여(anti-phalloidin 항체 이용) 형광현미경을 이용한 분석을 실시하였다. 세포골격은 항체 자극 후 10, 30분째 염 색을 시행하였으며, anti-phalloidin 항체를 1:1000로 희석하여 FLS에 1시간 반응시켰고, 이어 2% paraformaldehyde로 고정 하였다.

5. FLS의 이동성 측정

FLS가 단층 배양된 접시 표면을 200 uL 파이펫 팁으로 가 볍게 단일선으로 긁은 뒤 세 부위를 접시 바닥에 표시하여 현미경하에서 사진을 찍었다(baseline). 이어 배양액을 각 조건에 맞추어 바꾸고 24시간 뒤, 같은 부위 사진을 동일 조 건으로 찍고 baseline과 이동된 세포수를 측정하였다(scratch test). Transwell test는 transwell (Corning)의 윗 방에 FLS과

Figure 2. ENO-1expression in the synovium. (Top) ENO-1 expression in negligible in the synovium whereas ENO-1 is robustly expressed in the synovium of both the CIA and K/BxN model. (Bottom) ENO-1 expression is more profound in rheumatoid arthritis (RA) synovium compared with osteoarthritis (OA). Representative figures of 3 repeated experiments.

배양액을, 아랫방에 PDGF (platelet-derived growth factor)를 처리하여 6시간 뒤에 아랫 방으로 이동한 FLS의 숫자를 측 정하였다. 세포골격 재배열은 25 mm 커버글라스 위에 FLS을 키운 뒤 FLS를 30분간 각 조건으로 처리하고 세포를 고정 한뒤 Alexa 488-phalloidin으로 염색하여 동일초점 현미경하 에서 관찰하였다. 세포 증식 측정은 MTT assay를 이용하였다.

6. 생체내 칼슘 플럭스(calcium flux) 검사

18 mm 커버글라스위에 배양된FLS를 배양한 뒤, Fluo-4 (Invitrogen)으로 30분간 세포를 염색하고 washing 후 차광하 였다. 동일초점 현미경에 커버글라스를 위치시키고 각 조건 하에 FLS을 자극한 뒤 2초에 한번 사진을 찍어 총 5분간 변 화를 관찰하였다.

7. 시토카인, 금속 단백분해효소(metalloproteinase) 측정 각 조건으로 자극한 FLS의 배양액을 24시간 뒤에 모은 뒤

Luminex 200 (xMAP technology)으로 시토카인(IL-1, IL-6, IL-8, IL-15)과 금속 단백분해효소(MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9) 를 측정하였다.

연구수행 내용 및 결과

1. 활액막 조직내ENO-1 발현 특성

쥐의 활액막 조직을 분석한 결과 정상 쥐에서는 ENO-1발 현을 관찰할 수 없으나 콜라겐-유발 관절염이나 K/BxN 관절 염의 활액막조직에서는 단핵구, 중성구, 혈관내피 세포, 그 리고 섬유모세포에서 ENO-1의 발현이 관찰되었다(Fig. 2).

류마티스 관절염 환자와 골관절염 환자의 활액막 조직에서 도 이와 같은 분포를 확인하였으며, 염증성 관절염인 류마티 스 관절염에서 단핵구, 중성구의 증가와 더불어 판누스를 구 성하는 섬유모세포 수의 증가로 ENO-1 발현증가를 관찰할 수 있었다.

Figure 3. Increased ENO-1 surface expression in RA FLS after TNF-α stimulation. Baseline ENO-1 expression is minimal in in vitro conditions, and TNF-α (10 ng/mL) stimulation resulted in restoration of ENO-1 surface expression.

Figure 4. Migration of RA FLS after ENO-1 stimulation. (A) Increased RA FLS mobility after ENO-1sAb treatment (24 hours, scratch test). Representative of 3 independent experiments. (B) Transwell experiment shows increased PDGF-mediated translocation of RA FLS with ENO-1sAb treatment (24 hours, PDGF 5 ng/mL as positive control). Average data shown after 4 independent experiments.

2. TNF-α 매개 FLS 세포 표면의 ENO-1 발현 증가 류마티스 관절염 환자의 활액막 섬유모세포 표면의 ENO-1 의 발현 특성을 실험실내 조건에서 조사하기 위해 환자의 활액막에서 FLS를 분리하였다. 섬유모세포(passage 5)의 ENO-1의 발현을 관찰한 결과 기본 배양조건에서는 세포 표 면에 ENO-1 발현은 미미했으며, 류마티스 관절염의 병인에 기여하는 TNF-α로 세포를 자극하였더니 3시간 이후부터 발 현이 증가하여 12시간 후 80% 이상의 세포에서 표면 ENO-1 양성임을 확인하였다(Fig. 3). Passage 1의 FLS에서도 TNF-α 자극 전 ENO-1 발현이 높지 않았음이 확인되어, FLS의 배양 조건에서는 TNF-α 등의 자극이 있어야만 류마티스 관절염 활액막 조직소견에서 관찰되었던 표면 ENO-1 증가를 재현 할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서, 후속 실험들은 TNF-α를

처리한 FLS를 이용하여 실험을 진행하였다.

3. 세포표면 ENO-1 자극에 의한 FLS 이동성 증가 TNF-α로 FLS를 자극하여 ENO-1을 세포표면에 발현시킨 후, ENO-1 자극 항체(ENO1 stimulating antibody, ENO1sAb) 를 처리하여 FLS의 이동성 실험을 시행하였다. Scratch test 에서는 ENO1sAb 자극 조건에서 대조군 항체 처리군보다 세 포의 이동이 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다. 또 다른 이 동성 검사 방법인 transwell 실험에서도 ENO1sAb의 자극이 FLS의 이동성을 증가시키는 경향을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

RA FLS의 이동 증가가 ENO1sAB 자극에 의한 FLS 증식 에 기인한 것이 아니란 것을 조사하기 위해 ENO1sAb 처리 후 72시간 째 시행한 MTT assay에서 세포 증식이 촉진되지

A B

Figure 5. Enhanced cytoskeletal rearrangement after ENO1sAb treatment in RA FLS. At 30 minutes, FLS treated with ENO1sAb shows increased grouping of actin filaments as well as pseudopodia formation. Representative of 3 independent experiments. Graph in right depicts fluorescence intensity in average RA FLS in each group (PDGF used as positive control).

않음을 확인하였다(data not shown).

4. 세포표면 ENO-1 자극에 의한 FLS의 세포골격의 재배열 항진

이처럼 ENO-1 자극이 FLS의 이동성 증가에 기여함을 확 인한 뒤, FLS 이동 초기 세포변화의 가장 근간이 되는 세포 골격의 변화에 대해 조사하였다. 예상대로 ENO1sAb를 처리 한 FLS를 30분째 동일초점 현미경하에 관찰하였을 때 대조 항체를 처리한 FLS보다 세포골격의 재배열이 항진되고, 위족(pseudopod) 형성이 증가되어 세포 이동성 증가의 단세 포적 측면을 보여주었다(Fig. 5).

5. 세포 표면 ENO-1 자극에 의한 FLS의 칼슘 플럭스 증가 RA FLS 표면의 다양한 수용체를 통하여 각기 다른 세포 내 신호 전달체계를 통해 활액막내의 염증 반응이나 이동성, 침습성을 나타나게 된다. 이중 대표적인 신호전달은 수용체 자극에 의한 칼슘 이온 통로의 활성화를 꼽을 수 있다.

ENO1이 세포표면에서 단백분해효소의 기능이 아닌, 세포내 신호전달에 관여할 수 있을 것이라는 가설 하에 ENO1aAb로 세포를 자극한 뒤, 생체내 칼슘 플럭스를 측정하였다. 실험 결과 대조군 항체를 처리한 FLS에서는 5분간 관찰하였을 때 아무런 신호를 발견할 수 없었으나 ENO1sAb로 자극 한 FLS

Figure 6. Intravital calcium flux in RA FLS after ENO1aAb stimulation. Trypsin (5 ug/mL) was used as a positive control. Representative of 4 independent experiments.

에서 약 2 분경에 칼슘 플럭스 신호를 확인할 수 있었다(Fig. 6).

6. 세포표면 ENO-1 자극 후 FLS의 염증매개물질 생성변화 RA FLS를 ENO1sAb로 자극한 후 24시간 뒤 모은 배양액 에서 시토카인 IL-1, IL-6, IL-8, IL-15과 금속 단백분해효소 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9를 측정한 결과 대조 항체 처리군과 차이를 발견할 수 없었다(data not shown).

요약 및 결론

이상의 연구결과로 ENO1은 정상 FLS에서 세포질내에 존

재하다가 RA와 같은 염증성 활막염에서 TNF-α 등 염증 유 발 물질에 의해 RA FLS의 세포 표면 발현이 증가된다. 세포 표면 ENO1를 자극함으로써 RA FLS의 이동성이 증가되며, 특히 RA FLS 세포골격의 재배열 및 세포 이동을 위한 위족 생성이 항진된다. 세포표면 ENO1 자극이 FLS에서 이동성을 증강시키는 염증매개물질 생성을 유발하지는 않으나, 세포 표면 ENO1 자극이 RA FLS의 칼슘 이온채널을 활성화시키 며, 이로써 세포표면 ENO1 자극이 칼슘를 매개로 한 세포골 격의 변화, 나아가 FLS 이동성 증가에 기여할 수 있다고 생 각한다.

A

B

C