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2018년 8월 석사학위 논문

세포 내의 PGE 2 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

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세포 내의 PGE ₂ 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

Synthesis and structure-activity relationship(SAR) analysis of new ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives for

regulating intracellular concentration of PGE

2

2018년 8월 24일

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

나 아 리

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세포 내의 PGE 2 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

지도교수 조 훈

이 논문을 공학 석사학위신청 논문으로 제출함

2018년 04월

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

나 아 리

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나아리의 석사학위논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 유지강 (인)

위 원 조선대학교 교수 최재곤 (인)

위 원 조선대학교 교수 조 훈 (인)

2018년 05월

조선대학교 대학원

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Prostaglandin (PG) plays a crucial role in generating inflammatory reactions. It is also involved in key reactions in acute inflammation where it performs various physiological functions. Prostaglandin E2 is a type of PG related to both the inflammatory and anti-inflammatory effects that suppress excessive inflammatory reactions and enhance normal wound healing processes. However, when PGE2 is produced during PG biosynthesis, it is rapidly oxidized to 15-keto PGE2 by the NAD⁺-dependent 15-PGDH, which reduces the physiological activity of PGE2. Thus, the present study focused on developing a powerful inhibitor of 15-PGDH to increase the concentration of physiologically active PGE2.

To design the novel drug, 39 new derivatives were synthesized by altering the structure of TD203, one of several TD derivatives synthesized based on ciglitazone that exhibited good inhibitory effects. To estimate the inhibitory effects of these synthetic compound against 15-PGDH, DNA encoding 15-PGDH was inserted into the pGEX-2T expression vector and transformed into Escherichia coli BL-21 DE3 cells to produce highly pure 15-PGDH protein. Purified 15-PGDH was treated with the different compounds, and the

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concentration of the produced NADH was measured with a fluorescence spectrophotometer to obtain IC50 values for each compound. Subsequently, the concentration of PGE2 produced from A549 cells depending on each compound was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Compounds 4, 22, 23, 38, and 39 were selected as lead compounds, as they led to an increase in PGE2 concentration of greater than 100% compared to that observed for the control. To verify their effects on cellular healing, scratch wound healing assays were carried out. Compounds 4, 22, 38, and 39 showed far greater wound healing effects than the positive control transforming growth factor-β1. These results show that phenylpropyl substituent of compound was considered essential for increasing the PGE2

concentration.

Furthermore, the strongest effects on wound recovery of greater than 200% was exhibited by 4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl)phenyl 4-phenylbutanoate (compound 39), indicating that this compound can be used to develop novel derivatives in future studies.

Therefore, lead compounds (2, 22, 38, 39) will be valuable for the therapeutic management of various diseases caused by PGE2 deficiency.

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1. Introduction

조직 손상 시 성인 피부 상처 치유는 각기 다른 피부 조직과 세포의 상호작용을 필 요로 하는 복잡한 과정이며 급성 상처는 일반적으로 지혈, 염증, 증식 및 개조로 별개 의 단계를 거쳐 진행된다[1, 2]. 이 중 염증은 감염과 상해에 대한 면역 체계의 반응으 로써 잠재적인 병원균을 제거하고 생리 기능을 회복시키는 정상적인 조직 항상성을 유 지하기 위한 중요한 과정이다[3].

급성 염증이 해결되지 않을 시에는 만성 이형성 염증 및 과도한 조직 손상 또는 만 성 폐쇄성 폐질환 (COPD)과 같은 염증성 질환이 유발될 수 있으며 많은 연구에서 상 처 치유 과정 중 염증기는 최종 외상 결과에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있 다[4].

이러한 염증 반응의 생성에 Prostaglandin (PG)은 중요한 역할을 지니며 급성 염증의 주요 징후 발달에 기여한다. 또한 Prostaglandin E2 (PGE2)는 신체에서 생산되는 가장 풍부한 PG 중 하나로 통증, 염증 및 세포 증식에 관여하는 내인성 신호 전달 분자이며 조직 손상 시 염증기의 호중구의 수를 현저하게 감소시켜 상처 치유 회복을 향상시키 는 후보 물질로 알려져 있다[5, 6].

염증 반응 동안 PG 생성의 수준과 윤곽은 크게 변화된다. PG의 생산은 일반적으로 비 발진 조직에서 매우 낮지만 백혈구를 모집하고 면역세포가 침투하기 전에 급성 염 증에서 즉시 증가한다[3]. Figure 1.과 같이 PG은 막 인지질로부터 Phospholipase A2

(PLA2)에 의해 방출되는 Arachidone acid (AA) 및 기타 다중 불포화 지방산의 생물학적 활성 유도체이다. AA의 초기 변형은 Cyclooxygenase (COX) 효소에 의해 불안정한 중 간체인 Prostaglandin G2 (PGG2)가 산소화 및 고리화를 수반하여 생성되며 동일한 효소 로부터 별도의 Peroxidase 부위를 통해 PGG2를 Prostaglandin H2 (PGH2)로 감소시킨다.

다양한 Isomerase와 Oxidoreductase가 PGH2를 4종류의 Prostaglandin (PGE2, PGD2, PGF2, PGI2)과 Thromboxane A2 (TXA2)로 구성된 Eicosanoid의 그룹을 생성한다[7, 8].

현재 염증성 질환에서 가장 흔히 사용되는 약물은 비 스테로이드 성 소염진통제 (NSAIDs)로서 위 생합성 과정에서 PG 형성을 촉매하는 2개의 Cyclooxygenase isoforms 인 COX-1과 COX-2를 억제한다. 하지만 NSAIDs은 위장 부식, 신방 및 간부전증, 단백 뇨, 급성 신장 기능 부전 등 여러 부작용이 따르며 COX 억제에 의존적이라는 연구 결 과가 있다[9]. 따라서 NSAIDs의 임상 효능에도 불구하고 PGE2는 염증의 촉진과 해소

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모두에 기능할 수 있어 상처 치유 효능에 도움을 줄 것으로 기대된다.

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PG 생합성 과정으로부터 생성된 PGE2는 즉시 확산되어 7개의 Transmembrane G-protein-couplued 수용체 군에 속하는 특정 E-Prostanoid receptor (EP1-EP4)를 활성화시 킨다. PGE2는 하나 이상의 수용체에 결합하여 국소적으로 작용하며 각각의 EP 아형은 별개의 신호 전달 특성을 가지므로 PGE2는 다양한 생리적 기능을 발휘한다. Figure 2.

와 같이 EP1은 Gq를 통한 세포 내 Ca²⁺농도를 상승시키며 EP2 및 EP4는 Gs와 결합하 여 Adenyl cyclse (AC) - cyclic adenosine monophosphate (cAMP) - protein kinase A (PKA) 경로를 자극한다. 대조적으로 EP3는 Gi와 결합하여 AC 활성을 억제하여 cAMP 농도를 감소시킨다[10, 11].

특히 PGE2와 결합 친화력이 가장 높은 EP4 수용체는 cAMP 신호전달 외에도 β -arrestin 경로를 통한 Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) 활성화를 유도하여 혈관 확장, 뼈 재형성, 위장 항상성 등 생리 기능을 유지하는 역할을 지닌다. 최근 연구에서 수지상 세포 (DC)와 T 세포의 PGE2-EP4 신호가 Th1과 Interleukin-23 의존성 Th17 분화를 촉진 하여 다발성 경화증, 류마티스 성 관절염 및 접촉성 피부염 등 다양한 면역 질환에서 염증을 매개하는 것으로 나타났다. 또한 Th1 분화, B 세포 기능 및 알레르기 반응을 억제하며 호중구 및 Natural killer (NK) 세포와 같은 선천성 면역 세포에 대한 항염증 작용을 일으킬 수 있음을 밝혀냈다. 따라서 PGE2는 관련 조직에서 수용체 유전자 발현 의 조절을 통해 염증 효과 및 항염증 효과에 모두 관여함으로써 과도한 염증 반응을 억제하고 정상적인 상처 치유에 중요한 역할을 할 것으로 보여진다[12].

Figure 2. Action of PGE2 with EP receptors

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하지만 PGE2는 NAD⁺ 의존성 15-Prostaglandin dehydrogenase (15-PGDH)라는 세포질 효소에 의해 15-Keto PGE2로 산화됨으로써 빠르게 대사되기 때문에 생체 내에서 짧은 수명을 가진다. 이러한 PGE2의 빠른 산화는 조직 복구 및 재생에 부정적인 결과를 초 래하므로 생체 내에서 PGE2의 수준을 상승시키기 위해 15-PGDH에 대한 강력하고 안 전한 억제제의 발견을 목표로 삼았다. 15-PGDH는 포유류 조직에 특히 편재되어 있으 며 약 29 KDa의 분자량을 가진 동일한 서브유닛으로 구성된 이량체로 알려져 있지만 최근 증거에 의하면 15-PGDH는 원래 형태로 단량체 일 수 있다.

15-PGDH는 2가지의 유형이 존재한다. Type 1은 NAD⁺에 특화되어 Prostaglandin에 대 한 Km이 낮은 반면, Type 2는 NADP⁺를 선호하며 훨씬 더 넓은 기질 특이성을 가지면 서 높은 Km을 나타낸다. 따라서 PGE2 대사에 관한 본 연구는 더 빠른 불활성화를 가 져오는 Type 1의 NAD⁺에 초점을 맞추었다. 분자 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션을 통 해 얻어진 15-PGDH－NAD⁺－PGE2 복합체 전체의 3차원 (3D) Model을 Figure 3.에 나 타내었다[13, 14].

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위의 3D Model을 통해 PGE2와 15-PGDH의 상세한 결합이 확인되었다. 15-PGDH의 Tyrosine 151, Lysine 155, Serine 138은 PGE2의 산화 과정에서 특히 결정적이며 이러한 3개의 아미노산 외에도 Glutamine 148의 측쇄 산소 원자가 기질과 강한 수소결합을 이 루면서 촉매 mechanism에 영향을 주는 것을 확인하였다[15]. 이러한 15-PGDH－NAD⁺에 의한 PGE2 산화 반응 메커니즘을 Figure 4.에 도식화하였다.

Figure 4. Proposed catalytic mechanism of 15-PGDH [15]

이렇듯 15-PGDH는 PGE2 산화 반응의 주요 물질로서 관여하기 때문에 15-PGDH 억 제제 발견을 목표로 많은 연구들이 진행되어왔다. 당뇨병 치료제로 처음 개발되어진 Ciglitazone은 생체 내에서 안정성이 검증되었으며 15-PGDH 효소 활성의 가장 강력한 길항제로 보고되어진다. 따라서 이전 연구들은 이러한 Ciglitazone을 기준으로 구조식 변화를 통해 많은 유도체들을 합성하여 억제제 효능을 검증해왔다.

대표적으로 Ciglitazone의 중심 Phenyl ring에 2,4-Thiazolidindione을 연결하는 탄소 사 슬을 이중결합으로 대체한 약물인 CT-8이 유도체로서 존재하며 이 약물 또한 우수한

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억제 효능을 보였다. 또한 2,4-Thiazolidindione (TD)의 좀 더 세부적인 구조 변화가 억 제 효능을 현저하게 감소시킨다는 결과와 함께 이러한 TD 구조는 15-PGDH 억제 효능 에 필수적임을 밝혀내었다. 따라서 본 연구는 TDs계 약물 설계에 초점을 맞추어 선행 연구에서 가장 효능이 좋았던 TD203을 기준으로 유도체를 합성하였다. Figure 4.에 약 물 Ciglitazone, CT-8, TD 203의 구조식을 각각 나타내었다[16-18].

Figure 5. Structures of the 15-PGDH inhibitors Ciglitazone and CT-8 and TD203

TD203은 기존 TD 유도체에서 Ether를 Ester 결합으로 바꿔 합성하면서 Methoxy기가 중심 Phenyl ring에 연결된 화합물이다. 이러한 TD203을 기준으로 Methoxy기를 제외하 고 Ester 결합의 위치를 meta로 바꾼 1-18의 화합물을 합성하였으며 화합물 19-37의 경

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단일 결합으로 환원시켜 각 화합물을 합성하였다.

합성한 화합물들의 15-PGDH 억제 효능을 확인하기 위해 15-PGDH의 DNA를 pGEX-2T expression vector의 BamHI와 EcoRI 사이에 삽입한 후 재조합 Plasmid를 사용 하여 chemically competent E. coli BL21-DE3 cell 50을 형질 전환하였다. 이후 Affinity chromatography, Bradford protein assay, SDS-PAGE 과정을 통해 순도 높은 15-PGDH를 정제하여 15-PGDH inhibition assay를 실시하였다. 형광분광광도계로부터 각 화합물에 대한 NADH 생성 정도를 측정함으로써 15-PGDH 활성을 50% 억제하는 IC50 값을 도출 하였다. 또한 화합물들이 15-PGDH를 억제함으로써 세포 내 PGE2 농도에 얼마나 영향 을 주는지 보기 위해 competitive ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) 방법을 통해 A549 cell로부터 생성된 PGE2 농도를 측정하였다. 이 결과를 바탕으로 control 대 비 100% 이상의 PGE2 농도 증가율을 보이는 4, 22, 23, 38, 39 화합물들을 lead compound로 선정하였으며 이들을 Scratch wound healing assay 실시하여 증가한 PGE2

농도로부터 상처를 낸 Hacat cell의 상처 치유 효능을 확인하였다.

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2. Experimental procedures

2.1. Reagents and analysis apparatuses

실험에 사용된 모든 시약과 용매는 TCI(Japan), Sigma aldrich(USA), Alfa aesar(UK), Acros(USA), Samchun(Korea)에서 순도 99% 이상의 것들로 구매하였다. 합성한 화합물 들의 구조를 분석하기 위한 ^H-NMR 스펙트럼은 DMSO(dimethyl sulfoxide)용매를 사용 하여 JEOL JNM-LA 300 spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)에서 기록되었다. chemical shift 는 ppm (part per million; ), signal은 s (singlet), d (doublet), t (triplet), dd (double of doublet), dt (double of triplet), td (triple of doublet), m (multiplet)으로 표시하였다.

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2.2. Synthesis of ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives

2.2.1. General procedures for the synthesis of compounds 1-18

Scheme 1. Synthesis of compounds 1-18 reagents and conditions; (ⅰ) acetic acid, piperidine, toluene (ⅱ) DCC, 4-DMAP, dichloromethane (CH2Cl2)

compounds 1-18의 전체적인 합성 방법을 scheme 1.에 도식화 하였다. ⅰ,ⅱ 과정의 구체적인 실험방법은 아래 a와 1의 과정에서 나타내었으며 나머지 합성물들의 실험 방 법은 모두 동일하므로 생략하였다.

5-(3-Hydroxy-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione (a)

toluene 15 ml에 3-Hydroxybenzaldehyde 1 g (8.19 mmol)와 2,4-thiazolidinedione 0.78 g (1.0 eq; 8.19 mmol)를 용해시킨 후 acetic acid 0.23 ml (0.5 eq; 4.10 mmol), piperidine 0.4 ml (0.5 eq; 4.10 mmol)를 넣어준다. 혼합물이 든 둥근 flask에 dean-stock 장치를 장 착한 후 90℃에서 overnight 반응시킨다. 반응의 종결을 TLC로 확인한 후 methanol으로 부터 불순물을 씻듯이 제거하며 감압여과 한다. 얻은 고형물은 재결정하여 순수한 황 색의 결정 a를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

(24)

yield : 95.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.61 (s, 1H), δ 9.85 (s, 1H), δ 7.69 (s, 1H), δ 7.35 (t, J=3.84, 1H), δ 7.05 (d, J=4.02 Hz, 1H), δ 6.97 (s, 1H), δ 6.89 (dd, J=4.02 Hz, 1H) (Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl benzoate (1)

용매 Dichloromethane 5 ml에 앞서 합성한 화합물 a 0.5 g (2.26 mmol)과 Benzoic acid 0.276 g (1 eq, 2.26mmol), 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP) 0.0232 g (0.084 eq, 0.19 mmol)를 넣고 0℃에서 약 5분간 반응시킨다. 그 후 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 0.429 g (0.92 eq, 2.08 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 적가한다. 실온에서 약 8시간 반응 후 TLC로 반응의 종결을 확인한 뒤 생성된 dihexylurea (DHU)를 여과한다. 남은 여액 의 불순물을 제거하기 위해 0.5M HCl과 포화 NaHCO3 용액으로 산, 염기 추출을 반복 하여 진행 하고 unhydrous MgSO4로 탈수시킨다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성 된 고체는 ethanol로 재결정하여 순수한 결정 1을 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 85.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.69 (s, 1H), δ 8.17 (m, 2H), δ 7.81 (m, 2H), δ 7.66 (m, 3H), δ 7.55 (m, 2H), δ 7.44 (m, 1H)

(25)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 2-phenylacetate (2)

화합물 1과 동일한 반응으로 화합물 2를 얻는다.

yield : 87.8%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.65 (s, 1H), δ 7.77 (s, 1H), δ 7.60 (m, 9H), δ 4.00 (s, 2H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 3-phenylpropanoate (3)

화합물 1과 동일한 반응으로 화합물 3을 얻는다.

yield : 91.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.78 (s, 1H), δ 7.59 (m, 2H), δ 7.32 (m, 7H), δ 3.01 (m, 4H)

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(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 4-phenylpentoate (4)

yield : 88.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.60 (m, 2H), δ 7.37 (m, 7H), δ 2.71 (m, 4H), δ 2.00 (quin, J=3.66 Hz, 2H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 5-phenylpentanoate (5)

yield : 86.9%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.59 (t, J=4.04 Hz, 1H), δ 7.49 (d, J=3.86 Hz, 1H), δ 7.34 (m, 7H), δ 2.64 (d, J=1.28 Hz, 4H), δ 1.67 (s, 4H)

(27)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 2-phenylpropanoate (6)

yield : 92.0%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.78 (s, 1H), δ 7.58 (d, J=4.04 Hz, 1H), δ 7.49 (m, 7H), δ 7.17 (d, J=3.48 Hz, 1H), δ 4.17 (q, J=3.66 Hz, 1H), δ 1.53 (d, J=3.48 Hz, 3H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 2-phenylbutanoate (7)

yield : 89.1% ¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.65 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.58 (t, J=4.02 Hz, 1H), δ 7.49 (d, J=4.02 Hz, 1H), δ 7.42 (d, J=2.01 Hz, 4H), δ 7.35 (m, 1H), δ 7.25 (s, 1H), δ 7.15 (d, J=1.61 Hz, 1H), δ 3.91 (t, J=3.84 Hz, 1H), δ 2.15 (quin, J=3.30 Hz, 1H), δ 1.84 (quin, J=3.48 Hz, 1H), δ 0.95 (t, J=3.66 Hz, 1H)

(28)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 2-methyl-2-phenylpropanoate (8)

yield : 94.9% ;

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.69 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.59 (t, J=4.04 Hz 1H), δ 7.49 (m, 5H), δ 7.33 (m, 2H), δ 7.17 (d, J=4.02 Hz 1H), δ 1.73 (s, 6H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl cyclohexanecarboxylate (9)

yield : 92.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.69 (s, 1H), δ 7.81 (s, 1H), δ 7.61 (t, J=4.02 Hz 1H), δ 7.50 (d, J=3.84 Hz 1H), δ 7.36 (s, 1H), δ 7.25 (d, J=3.86 Hz 1H), δ 1.85 (m, 6H), δ 1.34 (m, 5H)

(29)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 2-cyclohexylacetate (10)

yield : 88.2%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.67 (s, 1H), δ 7.78 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=3.84 Hz 1H), δ 7.49 (d, J=3.66 Hz 1H), δ 7.36 (s, 1H), δ 7.25 (d, J=4.38 Hz 1H), δ 2.01 (d, J=6.23 Hz 2H), δ 1.75 (m, 11H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 3-cyclohexylpropanotate (11)

yield : 85.1%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.67 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.58 (t, J=3.84 Hz 1H), δ 7.50 (d, J=4.03 Hz 1H), δ 7.35 (s, 1H), δ 7.26 (d, J=3.84 Hz 1H), δ 2.64 (t, J=3.86 Hz 2H), δ 1.75 (m, 7H), δ 1.23 (m, 5H)

(30)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 4-cyclohexylbutanoate (12)

yield : 87.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.80 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=3.84 Hz 1H), δ 7.35 (s, 1H), δ 7.26 (s, 1H), δ 7.26 (d, J=3.48 Hz 1H), δ 2.61 (t, J=3.66 Hz 2H), δ 1.73 (m, 8H), δ 1.27 (m, 7H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 5-cyclohexylpentanoate (13)

yield : 91.9%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.65 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=4.02 Hz 1H), δ 7.50 (d, J=4.02 Hz 1H), δ 7.34 (s, 1H), δ 7.25 (d, J=3.86 Hz 1H), δ 2.63 (t, J=3.66 Hz 2H), δ 1.71 (m, 7H), δ 1.42 (m, 1H), δ 1.22 (m, 6H), δ 0.91 (m, 2H)

(31)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl cyclopentanecarboxylate (14)

yield : 92.1%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=4.04 Hz 1H), δ 7.49 (d, J=3.84 Hz 1H), δ 7.38 (s, 1H), δ 7.26 (d, J=3.86 Hz 1H), δ 3.10 (quin, J=4.22 Hz 1H), δ 1.97 (m, 4H), δ 1.68 (m, 4H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 3-cyclopentylpropanoate (15)

yield : 87.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=3.84 Hz, 1H), δ 7.50 (d, J=4.02 Hz, 1H), δ 7.36 (s, 1H), δ 7.26 (d, J=3.48 Hz, 1H), δ 2.64 (t, J=3.66 Hz, 2H), δ 1.86 (m, 11H), δ 1.27 (m, 4H)

(32)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl cyclobutanecarboxylate (16)

yield : 92.6%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.61 (t, J=4.04 Hz, 1H), δ 7.49 (d, J=3.84 Hz, 1H), δ 7.38 (s, 1H), δ 7.28 (d, J=4.04 Hz, 1H), δ 3.51 (quin, J=4.40 Hz 1H), δ 2.06 (m, 2H), δ 1.73 (m, 2H), δ 1.27 (m, 2H)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl cyclopropanecarboxylate (17)

yield : 87.9%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 7.79 (s, 1H), δ 7.60 (t, J=4.04 Hz, 1H),

(33)

(Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl thiophene-2-carboxylate (18)

yield : 92.9%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.68 (s, 1H), δ 8.13 (dd, J=2.37 Hz and J=2.47 Hz 1H), δ 8.07 (dd, J=2.03 Hz and J=1.93 Hz 1H), δ 7.82 (s, 1H), δ 7.66 (t, J=4.22 Hz 1H), δ 7.55 (m, 2H), δ 7.44 (d, J=3.66 Hz 1H), δ 7.35 (t, J=1.94 Hz 1H)

2.2.2. General procedures for the synthesis of compounds 19-37

Scheme 2. Synthesis of compounds 19-37 reagents and conditions; (ⅰ) acetic acid, piperidine, toluene (ⅱ) DCC, 4-DMAP, dichloromethane (CH2Cl2)

compounds 19-37 의 전체적인 합성 방법을 scheme 에 도식화 하였다. ⅰ,ⅱ 과정의 구 체적인 실험방법은 아래 b와 19의 과정에서 나타내었으며 나머지 합성물들의 실험 방 법은 모두 동일하므로 생략하였다.

(34)

5-(3-Hydroxy-4-methoxy-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione (b)

Toluene 15 ml에 Isovanillin 1 g (6.57 mmol), 2,4-thiazolidinedione 0.77 g (1.0 eq; 6.57 mmol)를 용해시킨 후 acetic acid 0.19 ml (0.5 eq; 3.29 mmol), piperidine 0.32 ml (0.5 eq; 3.29 mmol)를 넣어준다. 혼합물이 든 둥근 flask에 dean-stock 장치를 장착한 후 9 0℃에서 overnight 반응시킨다. 반응의 종결을 TLC로 확인한 후 methanol으로부터 불순 물을 씻듯이 제거하며 감압여과 한다. 얻은 고형물은 재결정하여 순수한 황색의 결정 a를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 88.3%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.49 (s, 1H), δ 9.52 (s, 1H), δ 7.65 (s, 1H), δ 7.11 (d, J=4.58 3H), δ 3.86 (s, 3H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl benzoate (19)

용매 Dichloromethane 5 ml에 앞서 합성한 화합물 b 0.5 g (1.99 mmol)과 Benzoic acid

(35)

mmol)를 넣고 0℃에서 약 5분간 반응시킨다. 그 후 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 0.38 g (0.92 eq, 1.83 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 적가한다. 실온에서 약 8시간 반응 후 TLC로 반응의 종결을 확인한 뒤 생성된 dihexylurea (DHU)를 여과한다. 남은 여액 의 불순물을 제거하기 위해 0.5M HCl과 포화 NaHCO3 용액으로 산, 염기 추출을 반복 하여 진행 하고 unhydrous MgSO4로 탈수시킨다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성 된 고체는 Ethanol로 재결정하여 순수한 화합물 19를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 93.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 8.15 (d, J=3.66 Hz 2H), δ 7.80 (t, J=3.66 Hz 1H), δ 7.65 (m, 4H), δ 7.38 (d, J=4.40 1H), δ 3.84 (s, 3H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-phenylacetate (20)

화합물 19와 동일한 반응으로 화합물 20을 얻는다.

yield : 88.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.53 (dd J=4.2 Hz and J=4.21 Hz 1H), δ 7.39 (m, 8H), δ 3.99 (s, 2H), δ 3.81 (s, 3H)

(36)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 3-phenylpropanoate (21)

yield : 86.0%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.73 (s, 1H), δ 7.53 (d, J=3.29 Hz 1H), δ 7.35 (m, 7H), δ 3.81 (s, 3H), δ 2.98 (m, 4H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 4-phenylbutanoate (22)

화합물 19와 동일한 반응으로 화합물 22를 얻는다.

yield : 87.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.56 (s, 1H), δ 7.73 (s, 1H), δ 7.53 (d, J=3.29 Hz 1H), δ 7.36 (m, 7H), δ 3.85 (s, 3H), δ 2.72 (t, J=3.66 Hz 2H), δ 2.62 (t, J=3.66 Hz 2H), δ 1.97 (t, J=3.84 Hz 2H)

(37)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 5-phenylpentanoate (23)

yield : 89.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.52 (d, J=4.40 Hz 1H), δ 7.33 (m, 7H), δ 3.81 (s, 3H), δ 2.63 (d, J=1.29 Hz 4H), δ 1.67 (s, 4H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-phenylpropanoate (24)

yield : 91.2%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.73 (s, 1H), δ 7.51 (d, J=4.40 Hz 1H), δ 7.41 (d, J=2.21 Hz 4H), δ 7.34 (m, 3H), δ 4.16 (q, J=3.48 Hz 1H), δ 1.52 (d, J=3.66 Hz 3H)

(38)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-phenylbutanoate (25)

yield : 89.8%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.56 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.51 (dd, J=4.22 Hz and J=4.31 Hz 1H), δ 7.41 (t, J=2.20 Hz 5H), δ 7.34 (m, 2H), δ 7.25 (d, J=1.11 Hz 1H), δ 3.90 (t, J=3.68 Hz 1H), δ 3.75 (s, 3H), δ 2.15 (quin, J=3.66 Hz 1H), δ 1.85 (quin, J=3.66 Hz 1H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-methyl-2-phenylpropanoate (26)

yield : 89.6%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.51 (m, 5H), δ 7.33 (m,

(39)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl cyclohexanecarboxylate (27)

yield : 87.3%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.51 (d, J=4.40 1H), δ 7.33 (m, 2H), δ 3.83 (s, 3H), δ 2.67 (m, 1H), δ 1.98 (d, J=6.4 2H), δ 1.75 (d, J=6.05 2H), δ 1.63 (m, 7H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-cyclohexylacetate (28)

yield : 91.2%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.75 (s, 1H), δ 7.52 (dd, J=4.40 Hz, 1H), δ 7.34 (m, 2H), δ 3.83 (s, 1H), δ 2.47 (d, J=3.48 Hz, 2H), δ 1.81 (m, 6H), δ 1.29 (m, 6H)

(40)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 3-cyclohexylpropanoate (29)

yield : 94.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.53 (dd, J=4.20 Hz, 1H), δ 7.33 (m, 2H), δ 7.29 (s, 2H), δ 3.84 (s, 3H), δ 2.62 (t, J=3.84 Hz, 2H), δ 1.75 (m, 8H), δ 1.23 (m, 5H), δ 0.92 (q, J=5.49 Hz, 2H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 4-cyclohexylbutanoate (30)

yield : 89.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.53 (dd, J=4.40 Hz and J=1.11 Hz, 1H), δ 7.33 (m, 2H), δ 3.83 (s, 3H), δ 2.56 (t, J=3.66 Hz, 2H), δ 1.72 (m, 8H), δ 1.28 (m, 7H), δ 0.93 (m, 2H)

(41)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 5-cyclohexylpentanoate (31)

yield : 85.6%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.52 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.53 (dd, J=4.22 Hz, 1H), δ 7.32 (m, 2H), δ 3.83 (s, 3H), δ 2.60 (t, J=3.48 Hz, 2H), δ 1.71 (m, 10H), δ 1.43 (m, 12H), δ 0.91 (m, 2H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl cyclopentanecarboxylate (32)

yield : 89.4%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.51 (dd, J=4.17 Hz, 1H), δ 7.36 (m, 2H), δ 3.83 (s, 3H), δ 3.09 (quin, J=4.04 Hz, 1H), δ 1.95 (m, 4H), δ 1.67 (m, 4H)

(42)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 2-cyclopentylpropanoate (33)

yield : 91.3%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.75 (s, 1H), δ 7.52 (d, J=4.40 Hz, 1H), δ 7.34 (m, 2H), δ 3.84 (s, 3H), δ 2.60 (d, J=3.66 Hz, 2H), δ 2.28 (quin, J=3.84 Hz, 1H), δ 1.87 (m, 2H), δ 1.66 (m, 4H), δ 1.29 (m, 2H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl 3-cyclopentylpropanoate (34)

yield : 90.5%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.58 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.52 (dd, J=4.22 Hz, 1H), δ 7.34 (m, 2H), δ 3.83 (s, 3H), δ 2.62 (t, J=3.84 Hz, 2H), δ 1.85 (m, 10H), δ 1.15 (m,

(43)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl cyclobntanecarboxylate (35)

yield : 91.2%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.52 (dd, J=4.40 Hz, 1H), δ 7.35 (s, 1H), δ 7.31 (m, 2H), δ 3.84 (s, 3H), δ 3.49 (quin, J=4.22 Hz, 2H), δ 2.35 (m, 4H), δ 2.05 (m, 2H)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl cyclopropanecarboxylate (36)

yield : 92.7% ¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 7.74 (s, 1H), δ 7.51 (dd, J=4.20 Hz, 1H), δ 7.37 (s, 1H), δ 7.31 (d, J=4.40 Hz, 1H), δ 3.84 (s, 3H), δ 1.95 (m, 1H), δ 1.11 (m, 4H)

(44)

(Z)-5-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)-2-methoxyphenyl thiopene-2-carboxylate (37)

yield : 92.5%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.57 (s, 1H), δ 8.13 (dd, J=12.09 Hz and J=2.39 Hz, 2H), δ 7.77 (s, 1H), δ 7.59 (m, 2H), δ 7.38 (m, 2H), δ 3.86 (s, 3H), δ 1.95 (m, 1H), δ 1.11 (m, 4H)

2.2.3. General procedures for the synthesis of compounds 38

Scheme 3. Synthesis of compounds 38. reagents and conditions; (ⅰ) acetic acid, piperidine, toluene (ⅱ) CoCl2·H2O, dimethylglyoxime, NaBH4, THF, DMF (ⅲ)DCC, 4-DMAP,

(45)

compounds 38의 전체적인 합성 방법을 scheme에 도식화 하였다. ⅰ,ⅱ, ⅲ 과정의 구 체적인 실험방법은 아래 (c), (d), (37)의 과정에서 나타내었다.

(Z)-4-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)benzoic acid (c)

Toluene 15 ml에 Terephthalaldehydic acid 1 g (6.66 mmol), 2,4-thiazolidinedione 0.78 g (1.0 eq; 6.66 mmol)를 용해시킨 후 acetic acid 0.19 ml (0.5 eq; 3.33 mmol), piperidine 0.33 ml (0.5 eq; 3.33 mmol)를 넣어준다. 혼합물이 든 둥근 flask에 dean-stock 장치를 장착한 후 90℃에서 overnight 반응시킨다. 반응의 종결을 TLC로 확인한 후 methanol으 로부터 불순물을 씻듯이 제거하며 감압여과 한다. 얻은 고형물은 재결정하여 순수한 황색의 결정 c를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 96.2%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.97 (s, 1H), δ 8.05 (d, J=4.22 Hz, 2H), δ 7.80 (s, 1H), δ 7.70 (d, J=4.22 Hz, 2H)

4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl)benzoic acid (d)

(46)

100 ml 둥근 flask에 CoCl2·H2O　 2.43 mg (0.019 mmol), dimethylglyoxime 86.97 mg (0.749 mmol)을 용매 H2O 10 ml에 용해시킨다. 뒤이어 1.0 N NaOH를 spuit를 이용하여 4방울 정도 가해주고 NaBH4 472.19 mg (12.48 mmol)를 넣어준 후 ice bath에서 교반하 며 0℃까지 맞춰준다. 그 후 앞서 합성한 e 화합물 1 g을 THF (Tetrahydrofuran) 10 ml 와 DMF (dimethylformamide) 5 ml 용액에 용해시킨 혼합물을 20분에 걸쳐 천천히 넣어 준다. 실온에서 18시간 동안 반응시킨 후 반응의 종결을 TLC로 확인한다. 더 이상 반 응이 진행되지 않으면 Acetic acid로 혼합물의 pH가 대략 6이 될 때까지 맞춰준다. 불 순물 제거를 위해 Ethyl acetate와 H2O를 이용하여 여러 번 추출을 진행한 후 MgSO4로 부터 수분을 완전히 제거한다. 회전식 감압증류기로 감압하여 흰색의 순수한 결정 f를 얻는다.

yield : 75.3%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.95 (s, 1H), δ 12.08 (s, 1H), δ 7.89 (d, J=4.02 Hz, 2H), δ 7.38 (d, J=4.02 Hz, 1H), δ 4.99 (q, J=2.19 Hz, 1H), δ 3.48 (dd, J=6.96 Hz and J=2.21 Hz, 1H), δ 3.26 (m, 1H)

3-phenylpropyl 4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl)benzoate (38)

용매 Dichloromethane 5 ml에 앞서 합성한 화합물 d 0.5 g (1.99 mmol)과 Benzoic acid 0.271 g (1 eq, 1.99 mmol), 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP) 0.02 g (0.084 eq, 0.16 mmol)를 넣고 0℃에서 약 5분간 반응시킨다. 그 후 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 0.38 g (0.92 eq, 1.83 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 적가한다. 실온에서 약 8시간 반응 후 TLC로 반응의 종결을 확인한 뒤 생성된 dihexylurea (DHU)를 여과한다. 남은 여액

(47)

하여 진행 하고 unhydrous MgSO4로 탈수시킨다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성 된 고체는 ethanol로 재결정하여 순수한 화합물 38를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 55.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.07 (s, 1H), δ 7.91 (m, 2H), δ 7.45 (m, 2H), 7.31 (m, 5H), δ 4.99 (m, 1H), δ 4.27 (t, J=3.11 Hz, 2H), δ 3.49 (m, 1H), δ 3.28 (m, 1H), δ 2.76 (t, J=3.68 Hz, 2H), δ 2.07 (quin, J=3.11 Hz, 2H)

2.2.4. General procedures for the synthesis of compounds 39

Scheme 4. Synthesis of compounds 39. reagents and conditions; (ⅰ) (NH4)2,HPO4, H2O, (ⅱ) CoCl2·H2O, dimethylglyoxime, NaBH4, THF, DMF (ⅲ)DCC, 4-DMAP, dichloromethane (CH2Cl2)

compounds 39의 전체적인 합성 방법을 scheme에 도식화 하였다. ⅰ,ⅱ, ⅲ 과정의 구 체적인 실험방법은 아래 (e), (f), (39)의 과정에서 나타내었다.

(48)

(Z)-5-(4-hydroxybenzylidene)thiazolidene-2,4-dione (e)

4-Hydroxybenzaldehyde 1 g (8.19 mmol), 2,4-thiazolidinedione 0.96 g (1.0 eq; 8.19 mmol), Diammonium hydrogen phosphate 0.1 g (0.1 eq; 0.82 mmol)를 100 ml 둥근 flask 에 넣고 condensor를 장착시킨 후 용매 H2O 5 ml에서 reflux 하에 교반시킨다. 2시간 후 전개용매 Hexane : Ethyl acetate = 1:1를 이용하여 TLC로부터 반응의 진행 정도를 확인한다. 더 이상 반응이 진행하지 않으면 Methanol로 불순물을 씻듯이 제거하며 감 압 여과하여 황색의 순수한 결정 e를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통 해 확인하였다.

yield : 94.8%

H NMR (DMSO, 300 MHz)  12.46 (s, 1H),  10.32 (s, 1H),  7.69 (s, 1H),  7.46 (d, J=8.79 Hz, 2H),  6.92 (d, J=8.40 Hz, 2H)

5-(4-hydroxybenzyl)thiazolidine-2,4-dione (f)

100 ml 둥근 flask에 CoCl2·H2O　 2.91 mg (0.022 mmol), dimethylglyoxime 104 mg (0.896 mmol)을 용매 H2O 10 ml에 용해시킨다. 뒤이어 1.0 N NaOH를 spuit를 이용하여

(49)

며 0℃까지 맞춰준다. 그 후 앞서 합성한 e 화합물 1 g (4.52 mmol)을 THF (Tetrahydrofuran) 10 ml와 DMF (dimethylformamide) 5 ml 용액에 용해시킨 혼합물을 20 분에 걸쳐 천천히 넣어준다. 실온에서 18시간 동안 반응시킨 후 반응의 종결을 TLC로 확인한다. 더 이상 반응이 진행되지 않으면 Acetic acid로 혼합물의 pH가 대략 6이 될 때까지 맞춰준다. 불순물 제거를 위해 Ethyl acetate와 H2O를 이용하여 여러 번 추출을 진행한 후 MgSO4로부터 수분을 완전히 제거한다. 회전식 감압증류기로 감압하여 흰색 의 순수한 결정 f를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

yield : 69.7%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 11.98 (s, 1H), δ 9.33 (s, 1H), δ 7.04 (d, J=4.04 Hz, 2H), δ 6.94 (d, J=4.02 Hz, 2H), δ 4.84 (m, 1H), δ 3.27 (m, 1H), δ 3.03 (m, 1H)

4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yl)methyl)phenyl 4-phenylbutanoate (39)

용매 Dichloromethane 5 ml에 앞서 합성한 화합물 f 0.5 g (1.84 mmol)과 Benzoic acid 0.303 g (1 eq, 1.84 mmol), 4-dimethylaminopyridine (4-DMAP) 0.019 g (0.084 eq, 0.15 mmol)를 넣고 0℃에서 약 5분간 반응시킨다. 그 후 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 0.35 g (0.92 eq, 1.69 mmol)를 20분에 걸쳐 천천히 적가한다. 실온에서 약 8시간 반응 후 TLC로 반응의 종결을 확인한 뒤 생성된 dihexylurea (DHU)를 여과한다. 남은 여액 의 불순물을 제거하기 위해 0.5M HCl과 포화 NaHCO3 용액으로 산, 염기 추출을 반복 하여 진행 하고 unhydrous MgSO4로 탈수시킨다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 생성 된 고체는 Ethanol로 재결정하여 순수한 화합물 39를 얻어 ^H NMR (Nuclear magnetic resonance)를 통해 확인하였다.

(50)

yield : 61.5%

1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.07 (s, 1H), δ 7.33 (m, 7H), δ 7.08 (d, J=4.22 Hz, 2H), 4.94 (q, J=2.01 Hz, 1H), δ 3.42 (m, 2H), δ 3.17 (m, 1H), δ 2.69 (t, J=3.66 Hz, 2H), δ 2.59 (t, J=3.66 Hz, 2H), δ 1.98 (quint, J=3.66 Hz, 2H)

(51)

2.3. Expression and purification of 15-PGDH

15-PGDH의 DNA를 pGEX-2T expression vector의 BamHI와 EcoRI 사이에 삽입한 후 Recombinant DNA를 chemically competent E. coli BL21-DE3 cell 50에 형질 전환하였다.

이어서 Ampicillin을 함유하는 500 ml LB 배지에서 37℃로 overnight 배양한 후 다음 날 생성된 단일 colony를 15ml의 LB배지에 접종하여 shaking incubator를 이용해 37℃, 220rpm에서 성장시켰다. 이후 단백질 발현을 유도하기 위해 배양액을 1.5L LB 배지에 접종하였고 wave length 600nm에서 흡광도 값이 약 0.6에 도달하였을 때 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 1 M 농도로 첨가하여 20℃에서 추가로 12시간 동안 성장시켰다.

Figure 6. Map of the pGEX-2T expression vector showing the reading frames and main features [19].

(52)

15-PGDH 단백질을 용출하기 위해 먼저 배양액을 4℃에서 15분간 centrifuge하여 상 등액을 제거한 후 cell pellet을 1 mM EDTA 및 0.1 mM DTT를 함유하는 세포 용해 완 충액 [1×DPBS buffer (pH 7.4)]에 현탁시켰다. 이후 세포 파괴를 위해 4회 반복하여 초 음파 처리를 진행하였고 생성된 세포 용해물을 20000 -force에서 30분간 centrifuge하 여 제거하였다. 4℃에서 column 상에 column buffer [1 mM EDTA 및 0.1 mM DTT를 함유하는 PBS 완충액 (pH 7.4)]로 평형화 시킨 Glutathione-sephatose 4B bead를 이용하 여 상등액에 용해되어있는 단백질을 bead에 binding시켰다. 이후 washing buffer [50 mM Tris-HCl, pH 7.7]로 binding 되지 않은 단백질들을 세척하였으며 단백질을 용출시키기 위해 Elution buffer [50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0]를 이용하여 5 분 동안 실온에서 incubation하여 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질은 1×Bradford reagent 을 이용하여 발색을 통해 육안으로 확인하였다.

2.4. Bradford protein assay

15-PGDH의 농도를 측정하기 위해 Bradford assay를 실시하였다. 먼저 표준곡선을 얻 기 위해 bovine serum albumin (BSA)를 멸균 증류수를 이용하여 5 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.156 mg/ml 농도로 희석하였다. 단백질 정량 시약으로는 Bradford reagent을 사용하였으며 spectrophotometer로부터 BSA를 넣지 않은 1 ml의 Bradford reagent를 blank 값으로 지정하였다. 이어서 농도별로 희석한 BSA 3 μl 와 Bradford reagent 997 μl를 섞은 후 595 nm에서 각각의 흡광도 값을 측정하였다. 측 정값을 통해 표준 곡선을 작성하였고 회귀 식[y=0.1868x+0.0116, R2=0.9914]을 도출하 였다. 이 후 정제된 15-PGDH를 같은 조건에서 흡광도를 측정하여 회귀 식을 통해 농 도[1.0246 mg/ml]를 계산하였다.

2.5. SDS-PAGE

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 Polyacrylamide

(53)

을 확인하기 위해 SDS-PAGE를 실시하였다. 미리 plate와 casting frame을 조합하여 고 정한 후 12 % separation gel [4.9 ml H2O, 6.0 ml 30% acrylamide mix, 3.8 ml 1.5 M Tris ㅡHCl (PH 8.8), 150 µl 10 % SDS, 150 µl 10 % APS, 6 µl TEMED]을 plate 사이 에 넣어 gel이 굳을 때까지 방치하였다. 굳은 separation gel위에 8 % stacking gel [3.4 ml H2O, 0.83 ml 30% acrylamide mix, 0.63 ml 1.0 M Tris ^ㅡHCl (PH 6.8), 50 µl 10 % SDS, 50 µl 10 % APS, 5 µl TEMED]을 끝까지 주입한 후 comb를 꽂고 gel을 굳혔다.

gel이 굳은 것을 확인한 후 comb를 제거하고 plate를 전기영동 장치에 결합하여 설치하 였다.

15-PDGH는 앞서 얻은 농도를 통해 넣을 양을 계산하여 2×SDS와 1:1 비율로 혼합한 후 95℃에서 미리 열처리하였으며 장치의 mini tank에는 running buffer 1L [1g SDS, 3g Tris, 14.4g glycine]를 안쪽, 바깥쪽 모두 채워 준비하였다. molecular weight marker와 열 처리한 단백질 2, 4, 6 µg을 well에 차례로 주입하고 70V의 전압을 걸어 단백질을 분리 하였다. 전기영동을 마치면 plate로부터 gel을 분리하여 증류수로 반복하여 세척한 후 Methanol, Acetic acid, 증류수를 포함한 CBB staining solution과 destaining solution를 통 해 염색과 탈색을 차례로 진행하였다. Figure와 같이 Marker를 기준으로 15-PGDH의 크 기는 약 55 kDa임을 확인하였으며 이는 기존에 알려진 15-PGDH의 크기와 동일한 결 과로써 높은 순도의 단백질을 얻었음을 확인하였다.

Figure 7. SDS-PAGE of human 15-PGDH

(54)

2.6. 15-PGDH inhibition assay

NAD⁺ 의존성 15-PDGH는 PGE2의 15-hydroxyl의 산화를 촉매하며 동시에 환원된 NADH가 생성된다 [21]. 따라서 15-PGDH inhibition assay는 NADH의 감소 정도를 측정 함으로써 15-PGDH의 억제 활성 능력을 분석할 수 있다.

미리 제조해 둔 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 250 µM NAD⁺, 0.1 mM DTT, 21 µM PGE2

의 sample들은 ice bath에서 4℃를 유지하였다. 먼저 형광분광광도계 (fluorescence spectrophotometer; RF-5301)를 이용하여 wavelength은 excitation: 340nm, emission: 468nm, reaction time 70.00sec로 설정한 후 증류수로 깨끗이 씻은 4면이 투명한 석영 cuvette을 기기에 넣고 cell blank를 찍는다. 그 후 cuvette에 미리 희석해 둔 inhibitor stock (1, 0.1, 0.01 mM)과 sample들을 혼합한 후 정제된 15-PGDH를 넣어 총 부피 2 ml를 맞추어 측 정한다. cell blank와 동일한 조건에서 각 inhibitor들은 최소 6개 이상의 농도로 처리하 여 OD(optical density)값을 측정하였으며 5-65 sec 값을 기록하였다. 측정값을 통해 각 39개 inhibitor의 회귀 식을 얻었으며 inhibitor를 처리하지 않은 control의 절반 값을 대 입하여 15-PGDH 활성을 50% 억제하는 IC50 값을 도출하였다.

(55)

2.7. Determination of extracellular PGE



levels.

합성한 inhibitor들이 세포 내 PGE2 농도에 얼마나 영향을 주는지에 대한 실험을 진 행하였다. 실험에 사용된 세포는 A549 cell 로서 인간 폐포 기저막 상피 세포이며 이는 성질이 편평하고 생체 내에서 단층처럼 접착력 있게 성장한다[22]. PGE2의 정확한 농 도를 측정하기 위해 competitive ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) 방법을 사용하였고 이는 항원-항체 특이적 결합 반응과 효소를 이용한 발색 반응으로 sample 을 정성 및 정량 분석하는 기술을 가지고 있다. PGE2 농도를 측정하기 전 모든 실험은 UV 램프와 환기장치를 갖춘 clean bench에서 무균적으로 진행하였으며 모든 Vial과 sample 들의 표면은 70% 에탄올과 Alcohol 램프로 소독하였다. Korean Collection for Type Cultures Biological Resource Center로부터 구매한 A549 cell은 액화질소 탱크 (-196

℃)에 동결 보존한 후 실험 시 동결된 세포를 Water bath에서 1~2분간 신속히 녹여 사 용하였다. 녹인 세포는 37℃ Water bath에서 미리 항온시킨 RPMI-1640 medium [+ 10%

FBS, 1% Antibiotic-antimycotic (10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of amphotericin B)]에 현탁시킨 후 이를 2000 RPM, 200 sec, 25℃ 조건으로 5분간 centrifuge 하였다. 상층액을 제거한 cell pellet에 새로운 medium 10 ml을 넣고 cell을 잘 풀어준 후 polystyrene (PS) cell culture dish에 옮겨 5% CO2, 3 7℃, 90% 이상의 습도에서 이틀 간 배양하였다. 위와 동일한 조건으로 새로운 medium 으로 갈아주며 최소 3회 이상 계대 배양하였다.

PGE2 농도 측정 전 동일한 농도의 cell에 약물을 처리하기 위해 계대 배양 한 A549 cell을 회수하여 새로운 medium과 함께 2.5×10⁵ cells/ml 의 농도로 희석하였다. 이 후 48 well plate에 희석한 cell을 250 µl 씩 주입하여 CO2 incubator에서 약 24시간 동안 배 양하였다. cell이 대략 80% 정도 성장하였을 때 1×DPBS buffer(-)으로 희석해둔 500µM 농도의 inhibitors들을 각각 2.5 µl 씩 주입하여 5µM의 농도로 처리하였다. control 에는 약물 대신 1×DPBS buffer(-)를 2.5 µl 주입하였고 CO2 incubator에서 12시간 동안 배양 하였다. 축적된 PGE2 농도를 측정하기 위해 cell plate로부터 각각의 상층액을 멸균된 e-tube에 걷어내었다.

abcam^Ⓡ으로부터 구매한 ab133021-prostaglandin E2 ELISA kit를 사용하였으며 먼저 kit 내의 Prostaglandin E2 standard로부터 Table 과 같이 7개의 농도로 희석하였다. 이를 쥐 의 IgG 항체가 코팅되어있는 96well plate에 차례로 100 µl씩 주입하였으며 비표지 항

(56)

원인 걷어낸 39개의 sample들을 각 inhibitor 당 3 well에 100 µl 씩 첨가하였다. 이어서 같은 well에 표지 항원인 PGE2 alkaline Phosphatase Conjugate와 prostaglandin E2

Antibody를 50 µl 씩 빠르게 첨가한 후 well plate를 2시간 동안 vortexing하였고 이 때 항체에 대한 항원간의 경쟁반응으로부터 항원-항체 복합체가 생성된다. 2시간 후 1×washing buffer로 3회 반복하여 결합되지 않은 항체를 제거하였고 pNpp Substrate를 200 µl 씩 주입한 후 45분간 실온에서 배양하였다. sample 내의 PGE2 농도가 높을수록 표지된 항원과 substrate의 신호는 감소하게 된다. 이와 같은 측정에 대한 원리를 Figure 8.에서 도식화하여 설명하였다. 마지막으로 신호의 포화를 방지하기 위해 빠르게 Stop solution 50 µl를 주입한 뒤 micro plate spectrophotometer (Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek^Ⓡ, USA; light source: Xenon flash; data analysis software: Gen 5

™)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였고 PGE2 standard로부터 얻은 회귀식을 이용하여 각 inhibitor 당 PGE2 증가율을 도출하였다.

Table 1. PGE2 Standard preparation

standard

#

sample to dilute

Volume to Dilute

(µL)

Volume of Diluent

(µL)

Starting conc.

(pg/mL)

Final Conc.

(pg/mL)

1 Stock 50 9500 50,000 2,500

2 Standard 1 500 500 2,500 1,250

3 Standard 2 500 500 1,250 625

4 Standard 3 500 500 625 313

5 Standard 4 500 500 313 156

6 Standard 5 500 500 156 78.1

7 Standard 6 500 500 78.1 39.1

(57)

Figure 8. PGE2 enzyme-linked immunosorbent assay procedure.

(58)

2.8. Scratch-wound healing assay

in vivo에서 세포 단층에 물리적인 ‘상처’를 만든 후 약물을 처리함으로써 생성된 PGE2 농도가 세포 재생에 얼마나 효과를 주는지 확인하기 위해 scratch wound healing assay를 진행하였다. 사용된 세포는 HaCaT cell로서 성인 인간의 피부 조직에서 자발적 으로 변형된 각질 세포주이다 [23].

DMEM/high glucose medium [+ 10% FBS, 1% Antibiotic-antimycotic (10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of amphotericin B)]을 이용하여 cell을 풀어준 후 이틀간 CO2 incubator [5% CO2, 37℃, 90% 이상의 습도]에서 배양하였 다. 이를 최소 2회 이상 반복하여 계대 배양하였으며 모든 작업은 clean banch에서 무 균상태로 이루어졌다.

동일한 농도로 cell의 seeding을 위해 계대 배양을 마친 cell을 새로운 배지로 교체한 후 도립현미경을 이용하여 세포수를 counting하였다. 이를 배지와 함께 2.0×10⁵ cells/ml 의 농도로 희석시키고 6well plate에 2 ml씩 주입하여 24시간 동안 배양하였다. cell이 70 – 80% 정도 성장하였을 때 배지를 제거하고 1×DPBS buffer(-)으로 washing하였다.

세포의 분열을 억제하기 위해 FBS와 Antibiotic-antimycotic이 첨가되지 않은 DMEM/high glucose medium 2ml와 함께 mitomycin C를 30 µg/ml 농도로 처리하여 CO2

incubator에서 정치하였다. 2시간 후 남아있는 mitomycin C와 배지를 suction하여 제거하 였고 pipette tip의 끝을 이용하여 culture dish에 부착된 세포 단층에 물리적인 scratch를 내주었다. 이 과정에서 떨어져 나온 세포들을 제거하기 위해 1×DPBS buffer(-)으로 2회 washig한 후 광학 현미경 (biological microscope IX71, Olympus, Japan ; light source:

TH4-200 ; software : DP2-BSW) 을 이용하여 약물을 처리하지 않은 상태의 scratch 부 분의 이미지를 capture하였다.

상처를 낸 cell에 DMEM/high glucose medium 2ml 씩 주입한 후 inhibitor (4, 22, 23, 38, 39)을 5µM의 농도로 처리하였다. inhibitor대신 positive control에는 TGF-β1 1 ng/ml 와 negative control에는 1×DPBS buffer(-)를 inhibitor와 동일한 부피로 처리하였다. CO2

incubator에서 24시간 동안 배양한 후 광학현미경을 이용하여 약물 처리 전 촬영한 동 일한 위치를 capture하였다. 약물을 처리하기 전과 후에 촬영한 이미지로부터 cell의 scratch 사이의 너비를 각각 측정하여 비교하였다.

(59)

3. Results and Discussion

3.1. Inhibition effect of human 15-PGDH

앞선 연구에서 전체적으로 가장 효과가 좋았던 EJ-14, EJ-59 Figure 9.를 기준으로 Ester 결합을 포함한 구조 변형을 통해 39개의 억제제를 합성하였다.

EJ-14 EJ-59

Figure 9. Structure of EJ-14 and EJ-59 [24].

이 억제제들의 구조 변화에 따른 15-PGDH 효소 억제 활성 정도를 측정하기 위해 15-PGDH assay를 실시하여 IC50 값으로부터 비교 분석하였다. 각 억제제의 IC50 값은 Table 3.4.5에 각각 표기하였다.

2,4-Thiazolidinedione기로부터 Ester 결합이 para 위치에 존재하는 EJ-1~EJ-15와 달리 화합물 1-18은 5-(3-Hydroxy-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione로부터 합성하여 meta 위치 에 Ester결합이 존재하는 (Z)-3-((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl 유도체를 완 성하였다. Ester 결합 위치에 따른 IC50 값은 Figure 10.와 같이 전반적으로 para 위치 (EJ-1~EJ-15)에서 억제 활성 효능이 더 높은 것으로 보였으나 치환기 구조에 따른 IC50

값은 두 유도체 모두 비슷한 경향성을 보였다. 각각의 IC50 값은 Table 2.와 Table 3.에 나타내었다.

화합물 1-5의 Phenyl치환기를 보았을 때 IC50 값이 phenyl < phenylmethyl <

phenylethyl < phenylpropyl < phenylbutyl 순으로 낮아졌다. 즉 치환기의 –CH2– 그룹이 증가할수록 억제 효능이 증가하였으며 compound 6-8에서와 같이 Phenyl 치환기를 연결 하는 탄소사슬에 methyl, ethyl이 존재하면 IC50 값이 확연히 떨어짐으로써 이는 억제제

저작자표시

2018년 8월 석사학위 논문

세포 내의 PGE 2 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

세포 내의 PGE 2 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

Synthesis and structure-activity relationship(SAR) analysis of new ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives for

regulating intracellular concentration of PGE

2018년 8월 24일

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

나 아 리

세포 내의 PGE 2 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)

methyl)phenyl 유도체 합성 및 구조 -활성 상관관계 분석

지도교수 조 훈

이 논문을 공학 석사학위신청 논문으로 제출함

2018년 04월

조선대학교 대학원

신재생에너지융합학과

나 아 리

나아리의 석사학위논문을 인준함

위원장 조선대학교 교수 유지강 (인)

위 원 조선대학교 교수 최재곤 (인)

위 원 조선대학교 교수 조 훈 (인)

2018년 05월

조선대학교 대학원

CONTENTS

List of Tables

List of Schemes

List of Figures

Abbreviations

Abstract

1. Introduction

2. Experimental procedures

2.1. Reagents and analysis apparatuses

2.2. Synthesis of ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives

2.3. Expression and purification of 15-PGDH

2.4. Bradford protein assay

2.5. SDS-PAGE

2.6. 15-PGDH inhibition assay

2.7. Determination of extracellular PGE

levels.

2.8. Scratch - wound healing assay

3. Results and Discussion

3.1. Inhibition effect of human 15-PGDH

4. Conclusion

References

H NMR Spectra

List of Tables

List of Schemes

List of Figures

Abbreviations

Abstract

Synthesis and structure-activity relationship(SAR) analysis of new ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives for

regulating intracellular concentration of PGE

1. Introduction

2. Experimental procedures

2.1. Reagents and analysis apparatuses

2.2. Synthesis of ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)phenyl derivatives

2.3. Expression and purification of 15-PGDH

2.4. Bradford protein assay

2.5. SDS-PAGE

2.6. 15-PGDH inhibition assay

2.7. Determination of extracellular PGE

levels.

2.8. Scratch-wound healing assay

3. Results and Discussion

3.1. Inhibition effect of human 15-PGDH

세포 내의 PGE ₂ 농도 조절을 위한 새로운 ((2,4-dioxothiazolidin-5-ylidene)