4단계
비 교 관 찰
·배반포 발달율 확인
·고정, 핵염색
·세포사 확인
1단계
2단계 3단계
난자 검란 및 선별 BMP-15첨가배양
체 외 성 숙
정자전처리 체외수정 22시간
체 외 수 정
체외배양Ⅰ 체외배양Ⅱ (2회)
체 외 배 양
1. 개요
□ 연구목적
인간의 체외수정과 같이 소에게 있어서도 체내수정을 하지 못하는 경우 체외수정은 많은 이점이 있다. 하지만 체외에서 생산된 수정란의 성숙, 수정 및 발달률은 체내에 비하여 저조하며 그 원인은 아직 완전하게 밝혀지지 않았다.
배양 조건 및 배양액의 조성은 미성숙 난자의 성숙 및 후기 발달에 중대한 영향을 미친다. BMP15 또한 배양 조건에 영향을 주는 요인이다. BMP 15의 첨가 배양이 체 외수정란의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구를 시작하게 되었다.
체외성숙 배양시기 난자의 성숙에 관여하는 최적의 BMP-15 농도를 처리하여 소 미 성숙 난자의 체외수정 후 체외발달 및 질적 변화를 확인하고자 한다. BMP-15를 첨가 하여 체외 성숙 시 비정상적인 성숙 및 이후 발달을 보완하고자 한다.
□ 연구 범위
○ 연구 분야 및 범위
생명과학, 동물발생공학 분야의 연구로 선별된 소의 난자에 각각 다른 농도의 BMP-15를 첨가하여 배양한다. 최적의 BMP-15 농도를 찾기 위해 먼저 체외성숙이 얼 마나 잘 되었는가를 비교하고 실험을 마친 후 소 배아 난할율 및 배반포 발달율을 확인하고 핵염색, 세포사 염색 후 세포사의 차이를 확인한다.
○ 진행 단계
2. 연구수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구
Bone Morphorgenetic Protein 15 (BMP-15)는 난모세포(Oocyte)에서 분비되는 성장인자 로 발현 시기와 정도는 난포 발달 상태에 따라 달라지는데 보통 일차난포(Primary follicle) 이후에 강하게 발현되고 난자성숙에 관여한다.
전 세계적으로 관련 연구 분야의 과학자들은 비정상적인 난자성숙을 극복하기 위한 노력 으로 체내 난자를 이용하여 난자의 성숙시기에 발현되는 유전자를 조사하였고, 밝혀진 유전자를 이용하여 체외성숙의 효율을 높이기 위한 노력으로 다양한 첨가물을 통해 미성숙 체외 난자의 정상적인 성숙을 유도하여 최적의 배양 조건을 찾고 있다.
어떤 첨가물을 통한 난자의 성숙율과 수정란의 발달율은 배양액의 종류에 따라 사 용될 농도와 그 결과가 다양하다. 그래서 이번 연구를 시작하기 전에 이전에 보고된 논문을 참고하여 농도(0, 50, 100, 200 ng/mL)를 설정하였다. 쥐를 이용한 연구가 있 지만 소의 경우에는 그 연구가 많지 않다. 100 ng/mL BMP15와 FSH라는 호르몬을 같이 사용하거나, GDF9이라는 첨가물을 사용했을 때 수정란의 발달율이 증가된다는 것을 보고 한 적은 있다. 하지만 이때 사용되었던 배양액의 종류는 달랐으며, 사용한 난소도 외국 종에 국한 되어 있었다. BMP15만 처리하였을 때 난자의 발달 및 수정 란 발달에 대한 연구는 많지 않다. 그래서 이번 연구에서는 국내 한우의 난소를 이용 하여 국내 한우 난자의 성숙율과 수정 후 수정란의 발달율에 미치는 영향을 조사 하기 위해서 기존의 보고된 농도를 바탕으로 그 전/후의 BMP15의 농도를 세분화 하여 최적농도를 찾고자 하였으며, 수정란의 발달 및 질적 변화를 조사하였다.
□ 연구주제의 선정
○ 생명공학의 발전은 체내에서 일어나는 일련의 번식과정인 난자성숙, 수정 및 수정란 발달을 체외에서 가능하게 하였고, 이렇게 생산된 체외수정란을 대리모에 이 식하여 산자 생산도 가능하게 하였다. 하지만 체외에서 이루어지는 수정에는 한계가
시기 주요 활동 5월 자료 조사, 대학 방문 및 실험실 견학
5월 ~ 7월
1차 실험
1. 도축장 난소 채취 2. 난자채란 및 선별
3. 체외성숙배양(BMP-15) 22시간 1. 정자전처리
2. 체외수정(소 동결 정액 사용) 22시간 체외배양 day 8
1. 배반포 확인 2. 사진촬영 3. 고정 1. 핵염색 2. 세포사 염색 3. 사진촬영
있으며 이는 체외배양 시스템과 밀접한 관련이 있다. 우리는 체외 수정의 한계를 극 복하기 위한 방법들을 연구해보기로 하였다.
○ 자료를 조사하던 중 경상대학교 축산학과 동물발생공학연구실을 견학하게 되었 고 BMP 15에 대한 교수님의 이야기를 듣게 되었다.
○ 체내에서 분비되는 골형성단백질인 BMP-15가 소 배아의 발달에 영향을 줄 수 도 있다는 흥미로운 연구 자료를 접하게 되면서 BMP-15에 대한 관심이 증가하였고 동물발생공학연구실의 도움을 받아 골형성단백질 15(BMP-15)의 첨가 배양이 체외수 정란의 발달에 미치는 영향에 대한 연구를 시작하게 되었다.
□ 연구 활동 및 과정
○ 실험 설계 및 연구 추진 실적
-실험 장소: 경상대학교 축산학과 동물발생공학연구실
9월 ~ 10월 3차 실험
11월 실험결과해석 및 보고서 작성
○ 실험 과정
가. 1단계 - 체외성숙 (IVM; In Vitro Maturation)
① 도축장에서 소의 난소를 채취해온다.
② 난소를 38~40°C 식염수에 세척하고 채란한다.
(2~6mm 크기의 난포 속에
있는 미성숙 난자만 채취할 것) 소의 난자 채취 장면 난소의 모습
③ 난자를 검란 및 선별한다.
④ 선별된 난자를 BMP-15를
첨가한 체외성숙배양액에 넣어준다.
질 좋은 난자 난자 검란 및 선별
⑤ 인큐베이터에 22시간 동안 넣어둔다.
BMP-15의 농도(ng/mL) 난자의 수(개)
control 48
50 49
100 46
200 42
나. 2단계 - 체외수정(IVF; In Vitro Fertilization)
① 체외 수정을 위해 정자(동결 정액)를 준비한다.
*정자 전처리 - 정자의 수정능을 획득시키는 것
가) 액체 질소 속 보관된 정자를 37°~38°C 물에 30초 동안 담궈서 녹인다.
나) 정자가 들어있는 통에 식염수를 넣는다.
다) 정자가 아랫부분에 가라앉도록 원심분리기에 25°C에서 5분간 돌린다.
라) 식염수를 버리고 헤파린을 넣어 정자와 섞어준다.
① 수정란들을 각각 샬레에 옮기고 죽은 정자와 난구세포를 제거한다.
② 수정란을 세척한다.
죽은 정자와 난구세포 제거 IVC 주입
마) 15분 동안 38℃의 인큐베이터에 넣어둔다.
※ 헤파린 처리를 하는 이유
정자의 수정 능력의 획득을 위해서이다. 수정이 이루어지려면 정자 두부(머리)에 존재하는 막이 벗겨지고 효소가 나와야 난자를 둘러싼 난구세포 및 투명대를 뚫을 수 있다.
동결 정액 정액을 녹이는 과정 원심분리기 가라앉은 정자 사진
② 전날 난자가 보관된 샬레에서 체외성숙배양액을 제거한다.
③ ‘②’에 전 처리한 정자를 넣는다. (체외수정)
④ 인큐베이터에 22시간 동안 넣어둔다.
IVM 제거 장면 IVM제거 장면 인큐베이터 인큐베이터 안의 모습
다. 3단계 - 체외배양Ⅰ(IVC; In Vitro Culture)
(CR1-aa + 0.3% BSA)
③ 샬레의 밑바닥을 4등분 한 뒤 체외배 양액(IVC)를 100μL씩 떨어뜨린다.
④ 이물질이 닿지 않고 모양을 유지할
수 있도록 오일을 넣는다. 오일을 받는 모습 오일로 고정한 모습
※ 2일간 더 배양하는 이유
수정란이 유사분열을 통해서 난할이 일어나는 데 이 유사분열을 통해서 세포수가 급격히 증가하게 되고 7~8일 째 배반포의 핵 수가 많아지고 요구되는 영양소 또한 많아지게 된다.
일반적으로 배반포는 7~8일 경에 착상을 하며 그 때 까지 난할을 계속하게 된다.
체외수정 이후 배양 후 6일 째 요구되는 영양소 및 배양환경을 만들어주기 위해 새로운 IVC2로 바꾸어 한 번 더 배양액을 갈아준다.
⑤ ‘④’에 난자를 넣다.
⑥인큐베이터에 72시간 동안 넣어둔다.
라. 체외배양Ⅱ - IVC; In Vitro Culture
(CR1-aa + 10%FBS) 3일간 3단계와 동일한 과정으로 진행된다.
※ 체외배양Ⅰ과 체외배양Ⅱ의 차이점
체외배양Ⅰ은 초기배양으로서 체외배양액(IVC1)에 0.3%BSA를 첨가시켜 3일을 배양 시킨다. 이 기간에 체외수정란이 1~8cell 까지 난할이 일어난다. 체외배양Ⅱ는 후기 배양으로서 체외배양액(IVC1)에 10%FBS를 첨가시켜 3일간 배양시킨다. 이 기간동안 은 체외수정란이 8cell~배반포 까지 난할이 일어난다.
후기배양 때 BSA보다 FBS를 첨가했을 때 배반포의 발달율이 더 좋다는 보고가 있어 2단계 배양(초기배양과 후기배양)방법을 이용했다.
마. 체외배양Ⅱ - IVC; In Vitro Culture
(CR1-aa + 10%FBS) 2일간 3단계와 동일한 과정으로 진행된다.
바. 4단계 - 배반포 발달율 확인 및 고정
① 수정란이 수정 후 8일이 지났을 때까지 발달된 것을 현미경으로 확인한다.
② 배반포 지름 측정
※수정 후 8일째 배양한 배반포를 현미경하에서 확인 후에 연구실의 카메라가 부착 되어 있는 현미경을 이용하여 배반포의 지름을 측정하였다. 우선 XY clone system 의 software를 이용하여 배율을 200배로 설정한 다음 배반포를 관찰하고 사진을 촬영하고 software의 기능 중 길이를 측정하는 기능을 선택하여 각 그룹별 배반포 의 지름을 측정하였다. 각 그룹별 측정한 지금은 평균을 계산하고 분석 하였다.
▲배반포 사이즈 측정 기기 및 software (XY clone)
③ 배반포 고정을 위해 고정액을 3.7%로 희석한다.
(착상이 되지 않는다면 수정란이 죽기 때문에 그 상태로 고정시키는 것)
④ 샬레를 밀봉시킨다.
사. 5단계 - 핵 염색, 세포사 염색, 사진촬영 (관찰)
① 밀봉시켰던 샬레에서 배반포를 세척한다.
(배반포를 고정시켰던 고정액은 독성이 있기 때문에 두 번씩 5분 동안 세척)
② 염색을 위하여 배반포(세포질, 핵막)에 구멍을 내기 위해 난자를 용액에 30분 동 안 담근다.(Triton X-100 이용)
③ 두 번씩 5분 동안 세척한다.
④ 세포사 염색을 위해 TUNEL Stain 용액에 1시간 동안 담근다.
밀봉된 샬레 세척 과정 염색 과정 세척과정
* TUNEL Stain - 체외성숙, 수정, 배양을 하기 때문에 무언가의 힘에 의해 끊어 진 DNA(단일가닥)가 존재한다. TUNEL Stain에 의해 단일가닥이 염색되는데, TUNEL Stain 속에 있는 UdT라는 물질이 끊어진 단일 가닥에 연결되어(A-T, C-G) 형광 빛이 발생한다.
⑤ 두 번씩 5분 동안 세척한다.
⑥ 핵 염색을 위해 Hoechst 33342 용액에 15분 동안 담근다.
⑦ 두 번씩 5분 동안 세척한다.
⑧ 슬라이드에 ‘⑦’을 올리고 커버글라스로 덮은 후 관찰한다.
커버글라스 덮은 모습 관찰을 하기 위한 모습 관찰하는 모습 현미경 사진 관찰
□ 시행착오 및 극복방안
우선 계절적 영향으로 소는 번식시기가 정해져 있지 않고 연중 번식이 가능하나 온도가 높은 여름철에는 임신율, 산자 생산율, 난자의 발달율이 낮은 것으로 많이 보 고가 되어 있다. 1,2차 시기의 계절적 문제를 해결하기 위해 3차 실험은 선선한 날씨 의 난소를 적극 활용하여 실험을 진행하였다.
생소했던 소 난소 및 난자를 이용한 작업들 (난자채란, 난자 검란, 체외수정, 체외배 양, 질적 평가, 고가장비 활용)을 손에 익히기 위해서 방학과 주말을 적극 활용하여 실험에 참여하였다. 교수님의 충분한 설명과 선생님들의 일대일 실험방법 등을 배워 가면서 실험을 익히고 반복하여 실험하였다.
예산계정 지출내역 금액
연구장비 ․ 재료비
․ BMP-15 500,000원
․ 4 well culture dish 145,000원
․ BSA 400,000원
․ 0.1 ~ 2 ul 피펫 300,000원
․ 생리식염수 20,000원
.
․ 15ml tube 80,000원
․ 50ml tube 108,000원
1,500,000
연구 활동비 ․ 외부전문가 자문수당 100,000원 * 10회 = 1,000,000원
․ 참고도서 외 권 총 250,000원
․ 자료인쇄 및 사무용품 총 91,340원
1,341,340
연구과제
추진비 ․ 간식비 및 식비 총 12회 금액 210,000원
․ 회의비(협의회비) 총 4회 = 434,400원 644,400
연구수당 ․책임지도교사수당 200,000원 * 7개월 = 1,400,000원
․공동지도교사수당 100,000원 * 7개월 = 700,000원 2,100,000
합 계 5,585,740
본 연구가 정해진 시간에 이루어지는 부분이 있어 농도 측정과 동시에 확보한 난자 및 생산한 수정란을 시간적 제한을 받지 않은 실험과 시간적 제한을 받는 실험으로 일정을 나누어 실험을 진행하였다. 대학에서도 학생들의 참여에 중점을 두어 시간적 배려를 충분히 해주었다.
고가의 장비 사용은 대학교 선생님들의 방법 설명 후 지도하에 직접 측정이 가능했 다. 처음에는 그 사용방법 등이 어렵고 힘들었지만 반복 실험을 통해서 장비 사용도 익숙해졌다. 그 외 나머지는 실체 현미경하에서 작업하는 것으로 이 부분도 반복을 통해서 할 수 있었지만, 체외에서 작업 시간이 많이 걸리게 되면 난자와 수정란의 발 달에 영향을 미치게 됨으로 이 부분에서는 선생님들의 도움이 있었다.
□ 연구비 사용 실적
교수 자문 내역
횟수 일시 자문내용 자문방법
1 2013.05.17 연구 주제 선정과 실험 design 및 가설 설정, Bone morphogenetic protein 15(BMP15)의
전반적인 기능 설명
대학 연구실에서
실험 수행 2 2013.06.08 연구 진행을 도와주실 연구원 소개 및 BMP15
제조 방법 및 처리 방법에 대한 구체적인 설명 〃
3 2013.07.26 익숙하지 않은 난소 작업에 대한 방법적 설명 및
좋은 등급의 난자 선별과 배양 후 변화 설명 〃 4 2013.08.05
체외 수정의 원리와 동결정액의 유용성에 대한 설명과 질 좋은 배반포의 선별법과 분석할
실험의 종류와 분석 방법에 대한 설명
〃
5 2013.08.24 현재까지 도출된 연구 결과에 대한 자문 및
데이터 정리 방법에 대한 설명 〃
6 2013.09.03 중간 성과 보고서 내용에 대한 자문 및
향후 실험 계획 수정 및 보완 사항에 대한 자문 〃
7 2013.09.28 이전 실험에서 추가할 실험 내용
및 방법에 대한 자문 〃
8 2013.10.15 추가 실험에서 얻은 결과 정리 및
이전 연구 결과와 정리 방법에 대한 자문 〃
9 2013.11.02 최종 연구 결과에 대한 자문 및 결론 도출 〃
10 2013.11.15 도출된 결과를 바탕으로 작성한
결과 보고서 검토 및 최종 수정 〃
□ 월별 추진실적 및 교수 자문 내역
체외 배양 1 비정상적인 난할 정상적인 난할 (8cell) 체외 성숙 체외 수정 체외 수정 22시간 후 죽은 정자와 난구세포 제거
3. 연구 결과 및 시사점
□ 연구 과정 요약
1단계 체외성숙 (BMP-15 첨가배양) 2단계 체외수정
3단계
체외배양Ⅰ(CR1-aa + 0.3% BSA) 체외배양Ⅱ (CR1-aa + 10%FBS 3일간) 체외배양Ⅱ (CR1-aa + 10%FBS 2일간) 4단계 배반포 발달율 확인 및 고정
5단계 핵 염색, 세포사 염색, 사진촬영
□ 실험 결과
※BMP-15처리를 통한 난자의 체외성숙율 조사 (추가 실험)
22시간 체외성숙배양 후 피펫으로 수 차례 피펫팅을 하여 난자에 붙어있는 난구 세포를 완전히 제거하고 Hoechst 33342 용액에 15분 동안 처리하여 핵을 염색시킨 다. 염색이 끝난 후 카메라가 부착된 현미경에서 중기 단계의 난자를 확인하였다.
(중기단계의 난자에서는 극체를 확인할 수 있다.)
핵염색 & 세포사 염색
핵염색 사진 세포사 염색 사진 핵+세포사 합성사진
처리그룹 난자개수 난할(개) 배반포 발달률(%)
0 (ng/mL) 146 85 (58.21%) 32(21.91) 50 (ng/mL) 148 78 (52.70%) 36(24.32) 100 (ng/mL) 145 79 (54.48%) 41(28.27) 200 (ng/mL) 134 75 (55.97%) 31(23.12)
배반포 발달율 확인
(0ng/mL - Day8) (50ng/mL - Day8) (100ng/mL - Day8) (200ng/mL - Day8)
것을 확인할 수 있다. 이로써 각 대조군과 실험군마다의 난할율을 조사할 수 있었다.
핵염색과 세포사 염색을 각각 시행하였다. 그 후 현미경 사진을 확대하여 소 배 반포의 전체 세포수와 세포사 개수를 헤아렸다. 핵 염색 사진과 세포사 사진을 합 성한 것을 보면 전체 세포수 중 세포사 개수가 얼마나 되는지를 비교해 볼 수 있 다.
□ 실험 결과 해석
가. 소 배아 난할율 및 발달율
Ⅲ. 결 론
표 1. 소 배아 난할율 및 발달율
BMP-15를 각각 처리하고 성숙된 소 난자를 이용하여 체외수정 후 배아 발달율을 측정하였다. 그 결과 체외수정 후 소 배아 난할율은 BMP-15의 농도에 따라 control 에서 58.21%, 50ng/mL(52.7%), 100ng/mL(54.48%), 200ng/mL(55.97%)를 처리한 그룹 과 비교하였을 때 큰 차이가 나지 않았다. 그리고 배반포 발달율(체외수정 후 7일)에 서도 통계적 차이가 나지 않았다. 뿐만 아니라 배반포 발달율도 통계적 차이가 나지 않았다. (control: 21.91%, 50 ng/mL: 24.32%, 100 ng/mL: 28.27%, 200 ng/mL:
23.12%, P > 0.05) 하지만 BMP-15 100ng/mL 그룹에서 다소 높은 발달율이 나오는 것을 확인하였다.
나. 배반포 지름 측정
그림1. 소 배반포 지름 측정
8일째 배반포의 지름을 측정한 결과, 그룹별 배반포의 지름은 유의적인 차이를 볼 수 없었다. (control: 241.95 ± 54.42 um, 50 ng/mL: 207.98 ± 63.57 um, 100 ng/mL:
234.88 ± 50.48 um, 200 ng/mL: 202.92 ± 51.3) 다. 소 배반포의 전체 세포수와 세포사 개수
그림2. 소 배반포의 전체 세포수(Total cell number)와 세포사(Apoptosis) 개수 그림3. 소 배반포 핵(Blue color) 염색 및 세포사(Red color) 염색
소 배반포의 질적 향상 정도를 확인하기 위해서 핵 염색 및 세포사 염색(그림2)을
처리그룹 난자개수 중기단계의 난자 (극체)
0 (ng/mL) 209 114 (54.54%)
50 (ng/mL) 226 138 (61.06%)
100 (ng/mL) 207 117 (56/52%)
200 (ng/mL) 202 123 (60.89%)
포수를 확인하였다(그림1).
하지만 BMP-15를 50mg/mL 와 200ng/mL 처리한 그룹과 비교했을 때는 유의적인 차이를 관측할 수는 없었다. 세포사를 확인해 본 결과 전 그룹에서 유의적인 차이를 확인할 수 없었다(그림1).
-BMP-15처리를 통한 난자의 체외성숙율 (추가실험)
표 2. BMP-15처리를 통한 난자의 체외성숙율
Ⅲ. 결 론
성숙난자의 특징인 극체의 염색을 통한 핵의 상태를 확인해았다. 실험그룹별 성숙정 도는 유의적인 차이가 없었다. (control: 54.54%, 50 ng/mL: 61.06%, 100 ng/mL:
56.52%, 200 ng/mL: 60.89%, P > 0.05)
□ 결 론
본 연구결과를 살펴보면, BMP15 처리별 난자의 성숙율과 발달율에서는 유의적인 차이를 볼 수 없었지만, 체외 성숙 배양 시 BMP-15를 100ng/mL 첨가하였을 때 체 외 수정 이후 8일 째 소의 배반포에서 수정란의 질적 평가 기준의 하나인 전체 세 포수의 개수가 control에 비하여 유의적으로 많은 것을 알 수 있었다. 따라서, BMP 를 첨가하여 성숙 배양한 소의 난자를 이용하였을 때 소 배반포 발달 및 질적 향상 을 가져온다는 것을 알 수 있었다.
□ 시사점
국내 한우종의 난자 및 수정란의 생산을 위한 배양체계의 정립을 위한 연구로써 수 정란의 생산성과 질적 변화에 대한 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대되었다. 본 연구 결과를 통해서 추가적으로 더 깊이 있는 연구도 진행이 가능하며, 지역적 특징으로 농가의 적용 가능성 정도를 판단할 수 있는 중요한 기초 실험이 될 것으로 판단이 된다. 아직까지 체외배양체계가 완전히 정립되지 않았으며, 전 세계적으로도 이 분야 에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 보다 안정적이고 질 좋은 수정란의 대량 생 산 방법에 대한 다양한 각도에서의 연구를 진행 중이다. 그 가치와 중요성은 아주 크 다고 이야기 할 수 있다. 모든 연구에서 좋은 결과를 도출하는 것이 그 연구의 기본 적인 기대이고 요구이다. 하지만 최고의 결과를 얻기 위해 과정 없이는 그 성과를 기 대하기 힘들다고 생각된다. 본 연구에서는 우리들의 주도적 참여 및 연구가 주 목적 이며, 이를 통한 과학 분야의 관심 및 참여를 끌어내고, 연구에서 얻어지는 결과를 통하여 성취감 및 미래지향적 목표를 가질 수 있는 좋은 기회라고 생각된다.
4. 홍보 및 사후 활용
□ 사후활용 방안
이런 배양 체계를 이용한다면 짧은 시간 내에 질 좋은 소의 수정란을 생산/이식하 여 질 좋은 소를 대량 생산이 가능하며, 나아가 복제 수정란 및 복제 소 생산에도 활용 가능할 것이다.
5. 참고문헌
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Buccione, R,. Vanderhyden, B.C., Caron, P.J., Eppig, J.J., 1990b. FSH-induced expansion of the mouse cumulus oophorus in vitro is dependent upon a specific factor(s) secreted by the oocyte. Dev. Biol. 138. 16-25
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