고찰

중추신경계를 침투하여 급성의 아메바성 뇌수막염을 일으키는 것으로 알려 져있는 파울러자유아메바(N. fowleri)는 전세계 도처에 분포하고 있다. 토양이 나 따뜻한 담수가 주요 서식지이며, 대부분의 감염환자들이 수상레포츠 등으로 비강과 후신경을 통해 감염이 되는 것으로 알려져 있지만 가정의 수돗물에서도 검출된다는 보고도 있다(Marciano-cabral, 1988; Kang 등, 2020). 또한, 최 근 미국 CDC의 역학조사 결과, 미국 텍사스주의 수돗물 11개 샘플 중 3개의 샘플에서 파울러자유아메바가 검출되어 재난지역으로 선포되기도 하였다(Hamaty 등, 2020). 지구온난화로 인한 기온 상승은 호열성인 파울러자유아메바의 서식 지 확대를 야기하여 더 많은 감염이 발생할 수 있을 것으로 보고되고 있다 (Siddiqui 등, 2016). 파울러자유아메바가 오염된 물이 사람들의 코로 접촉하 게 되면 아메바들이 비강을 통해 들어가게 되고 후신경을 침투하여 중추신경계 로 들어가 뇌조직을 파괴하게 되는데, 인체 내 뇌 감염이라는 병리적 특성 때 문에 임상적 증상만으로 쉽게 진단이 어렵다(Barnett 등, 1996).

파울러자유아메바의 병인기전은 숙주세포에 아메바의 접촉 및 세포용해물질 등을 분비하여 숙주세포의 세포사멸을 유도하는 세포병변효과가 일어난다고 보 고되고 있는데, 기존 연구를 정리하면 파울러자유아메바의 병인기전으로는 다 음과 같은 가설이 가능하다. 첫째, 파울러자유아메바로부터 수용성의 용해물질

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-의 접촉성 병인기전이 있다(Cho 등, 2003; Sohn 등, 2019). 이와 관련된 nfa1 유전자는 아메바의 위족에 특이적으로 발현한다고 보고되었다(Shin, 2010). 또한, molecular charperon으로서 food-cups 형성과 관련된 hsp70 유전자가 보고되었다(Song 등, 2008). 한편, 세포의 골격구조변화에 관여하는 Nf-actin 단백질은 polymeric fibrous actin (F-actin)과 monomeric globular actin (G-actin)의 polymerization에 수반되는 단백질이며, 아메바의 식세포 작용을 위해 생성되는 소기관 중 하나인 food-cups에 많이 발현한다고 알려 져 있다(Sohn, 2010, Sohn 등, 2019). 이처럼 위족운동과 식세포작용이 활발 한 영양형에서 nfa1 및 Nf-actin 유전자가 클로닝 되었지만 포낭형에 더 많이 발현하는 유전자에 대한 연구는 아직도 미미한 편이다.

파울러자유아메바는 핵과 세포질 내에 공포(cytoplasmic vacuoles), 식포 및 수축포들을 많이 갖고 있으며 온도, 환경 및 영양상태 등에 따라 영양형에 서 포낭으로 바뀌는데 이를 포낭형성과정(encystation)이라 한다. 포낭형성과 정에서 아메바는 먹이 부족과 건조로부터 자기 자신을 보호하는 역할을 가진 다. 아메바의 포낭형성은 항생제를 약효를 저해시키는 주요 요인으로 알려져있 는데(Moon 등, 2009), 포낭형에서 많이 발현되는 유전자를 통해 포낭형성을 억제할 수 있는 기전을 밝혀낸다면 아메바의 병원성을 분석하는데에 도움이 될 것이라고 생각한다. 따라서 먼저 파울러자유아메바의 포낭형에서 많이 발현되 는 유전자(단백질)들을 클로닝하고, 유전자의 세포 내 발현 양상을 관찰하는 것이 중요하다. 앞선 연구에서는 포낭형에서 과발현되는 Nf-profilin 유전자가 클로닝 되었으며 제반정보를 이용하여 생산된 재조합 단백질(Nf-profilin)을 이용하여 실험에 적용하였다. Profilin은 동물 및 식물, 바이러스 등에서 actin 에 결합하는 단백질로써 생물체 내에서 필수적으로 존재한다. 다수의 결합 단

백질과의 상호작용을 통해 세포골격구조 변화의 활성인자로서의 기능을 한다고 알려져있으며, 세포의 분화와 새로운 핵 형성을 저해한다고 한다. 높은 농도의 profilin은 세포골격구조에 영향을 주며 actin polymerization을 방해하게 된다 (Gunning 등, 2015; Alvarado 등, 2014). 따라서 본 연구에서는 파울러자유 아메바의 영양형과 포낭형에서 다르게 발현하는 Nf-profilin 유전자의 발현량을 비교하였으며, 표적세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 배양하여 표적세포에 대한 아메바의 식세포작용 및 형태학적 변화에 따른 Nf-profilin 단백질 발현량을 확인하는 실험을 진행하였다. 먼저, 파울러자유아메바의 영양 형을 포낭형성배지에서 배양하여 포낭형을 유도하였고, 형성된 포낭형과 영양형 의 Nf-profilin 유전자 발현 양을 RT-PCR, real-time PCR 그리고 Western blotting을 통해 측정하였다. RT-PCR 결과, 포낭형에서 450 bp 크기의 발현 을 확인하였고 영양형에서는 포낭형보다 확연히 낮은 발현을 보였다. 반면 Nf-actin 유전자는 파울러자유아메바 영양형의 1.2 kb 크기에서 강하게 발현 한 밴드를 확인할 수 있었지만, 포낭형에서는 영양형에 비해 확연히 낮은 발현 수준을 확인하였다. 또한 Western blotting을 수행하였을 때에도 RT-PCR과 비슷한 결과를 얻었는데, 영양형에서는 Nf-profilin 유전자의 발현이 거의 되 지 않았지만 포낭형에서는 22kDa의 반응대에서 뚜렷하게 발현된 단백질을 볼 수 있었다. 따라서 Nf-profilin 유전자는 아메바 영양형보다 포낭형에서 확연 하게 많이 발현한다는 것을 확인하였다.

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-단백질은 직접적으로 관여하지 않는다고 생각되어진다. 식세포작용을 하지 않 는 포낭형에서는 세포의 액포(vacuoles)부분을 제외한 세포 전체에서 발현되 는 것이 관찰되었는데, 영양형에서 점차 포낭형으로 형태가 변화할 때 포낭형 의 세포질 전체에서 발현 양이 증가하는 것으로 생각된다.

이후 표적세포에 파울러자유아메바의 영양형 및 포낭형의 혼합배양실험을 진행하였다. 표적세포인 CHO 세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭형을 각각 혼합배양한 후 시간별로 파울러자유아메바의 형태학적 변화를 관찰하였 다. 각각의 실험군 모두 배양시간이 경과함에 따라 표적세포의 수는 감소하였 으며, 살아있는 표적세포들은 모양이 둥근 형태로 변화하였다. 이는 주로 기생 충에서 분비되는 시스테인분해효소에 의해 표적세포의 구조단백질이 파괴되어 표적세포의 영양분을 파울러자유아메바가 섭취하였기 때문이라고 생각되어진다 (Na 등, 2006; Long 등, 2015). 아메바 영양형을 혼합배양 한 1시간부터 파 울러자유아메바가 위족운동을 통해 표적세포로 향하는 모습이 많이 관찰되고, 이미 표적세포에 달라붙어 빠르게 식세포작용을 하는 모습을 관찰할 수 있었다.

혼합배양 시간이 경과함에 따라 식세포작용에 의해 표적세포의 수는 매우 빠르 게 감소하였으며 파울러자유아메바만 분열하여 증식하였다. 포낭형만 처리한 실험군에서는 1시간에는 대부분 배지에서 약간 떠있는 상태로 관찰되었으며 3 시간에는 포낭형이 표적세포의 근처에서 발견되고 위족이 약간 튀어나온 전포 낭 형태를 많이 볼 수 있었다. 이는 식세포작용을 위하여 표적세포를 향해 움 직이기 위해서 위족이 형성된 것으로 보인다. 혼합배양 6시간부터는 포낭형의 80% 이상이 영양형으로 변화한 형태가 관찰되었으며 아메바 내에 액포(vacuoles) 가 많이 형성되었다. 표적세포에 달라붙어서 포식하는 속도가 매우 빠르며 food-cups이 형성되어 식세포작용을 하는 양상을 보였다. 12시간부터는 다수의 아

메바가 여러개의 위족과 food-cups을 가진 완전한 영양형으로 변화하였으며 표적세포의 수가 눈에 띄게 감소하였다. 표적세포의 세포막이 완전히 파괴되고 죽은 세포의 흔적만 남은 것을 볼 수 있었다.

표적세포와 혼합배양 시 Nf-profilin 유전자의 발현이 어떻게 변화하는가를 알아보기위해 표적세포와 아메바를 혼합배양시간별로 세포를 얻은 후에 RT-PCR을 진행하여 비교하였다. 그 결과 포낭형만 혼합배양한 실험군에서 1시간 에 가장 높은 Nf-profilin 유전자의 발현 레벨이 보이며, 배양시간이 지날수록 감소하고 이후 6시간부터 24시간까지는 거의 비슷한 발현 레벨을 보였는데 이 것은 아메바가 영양형으로 바뀌면서 Nf-profilin 유전자의 발현이 저하된 것으 로 생각된다. 영양형만 혼합배양한 실험군에서는 1시간, 3시간에는 다른 시간 보다 조금 높은 듯 하다가 6시간 이후로 24시간까지 일정한 발현량을 보였으 며 , 포낭 형 만 혼합 한 실 험군 보다 확연 히 적은 발현 량을 보였 다. 이 러 한 RT-PCR 결과를 정량화하기 위하여 RT-qPCR을 진행하였을 때, 포낭형만 처리한 실험군이 영양형만 처리한 실험군보다 배양 1시간에서 2.5배 이상 높 은 발현 레벨이 확인되었다. 3시간부터는 시간이 지날수록 발현량이 감소하였 는데, 식세포작용을 통한 영양분 섭취로 인해 포낭형의 아메바가 점차 영양형 으로 변화하며 Nf-profilin 유전자의 발현 레벨이 줄어든 것으로 생각된다. 영 양형만 혼합한 실험군의 1시간에서 다른 시간대보다 발현 레벨이 높은 이유는 혼합배양 전에 아메바를 PBS로 여러번 워싱하면서 아메바의 영양형이 안정되

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-화를 관찰한 실험 결과, 아메바 포낭형만 혼합배양한 실험군에서 배양 1시간에 서 대부분 완전한 포낭 형태의 아메바의 세포질 전체에서 Nf-profilin 단백질 이 발현된 것을 관찰할 수 있었다(표적세포는 SNARF-Red 염색을 통해 아메 바와 구분하였고 혼합배양한 아메바에 Nf-profilin 항체를 처리 후 포낭형에서 영양형으로 변화하는 과정에서 Nf-profilin 단백질은 형광염색-Green). 3시 간에서 포낭형에서 위족이 나오기 시작하면서 표적세포 쪽으로 위족이 향하는 모습을 볼 수 있었으며, Nf-proflin 단백질이 세포의 한쪽 방향으로 몰리는 듯 한 양상이 관찰되었다. 아메바에서 위족이 생성되는 부분과 반대편에 주로 위 치하다가 완전한 영양형이 된 6 시간 경과 후에는 아메바 위족 또는 food-cups 의 일정부분으로 모이며 발현량이 더욱 감소하였다.

Nf-profilin 단백질과 비교하기 위해 Nf-actin 단백질을 같은 방법으로 실 험을 진행하여 형광 현미경을 관찰하였을 때, 포낭형을 표적세포와 1시간 혼합 배양한 실험군에서 아메바 포낭형에서 Nf-actin 단백질은 거의 발현하지 않았 으며 3시간 경과 후 food-cups이 형성된 전포낭 형태에서 CHO 세포와 접촉 된 food-cups 부분에 특이적으로 발현하는 Nf-actin 단백질을 확인할 수 있 었다. 특히, 혼합배양 시간이 경과함에 따라 아메바가 대부분 영양형으로 변화 하여 표적세포에 부착된 food-cups 부분에서 Nf-actin 단백질이 강한 발현을 보이는 것을 확인하였다. 또한 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포 내부에서 발현되는 Nf-profilin 단백질을 관찰한 결과, 혼합배양 1시간에 포낭형의 세포 내부 전체에서 강한 발현을 보였다. 3시간에 포낭형에서 위족이 나오기 시작하 면서 아메바의 위족이 시작되는 부분에 Nf-profilin 단백질이 모여드는 경향을 보였다. 6 시간 이후 포낭형이 대부분 완전한 영양형으로 변화하면서 Nf-profilin 단백질은 세포 내부의 핵 근처 또는 위족 말단에서만 적은 양으로 발현하였다.

이러한 결과는 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 결과와 반대의 현상으로 본 실 험의 가설을 입증한 것으로 생각된다.

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