SDS-PAGE 및 Western blotting 분석

파울러자유아메바 형태에 따른 Nf-profilin 단백질 발현 차이를 비교하기 위해 파울러자유아메바의 포낭형 및 영양형의 전체 세포추출액(lysate)을 이용 하여 SDS-PAGE를 수행한 뒤 Nf-profilin 단클론항체를 처리하여 Western blotting을 수행한 결과, 아메바의 포낭형 세포추출액에서 Nf-profilin 단백질 발현이 22KDa 반응대에서 확인되었다(Fig. 6).

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-Fig. 6. Expression level of Nf-profilin protein in N. fowleri trophozoites and cysts. A, SDS-PAGE results of lysates of N. fowleri trophozoites and cysts. B, Western blotting results of N. fowleri trophozoites and cysts with Nf-profilin monoclonal antibody. Arrow indicates the reacting band with 22KDa molecular weight. T, N. fowleri trophozoites;

C, N. fowleri cysts; M, protein size marker.

2. 파울러자유아메바 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치

1) 형광 현미경 관찰 결과

파울러자유아메바 영양형 및 포낭형 내 Nf-profilin 단백질의 발현 위치 를 확인하고자 Nf-profilin 단클론항체(anti-Nf-profilin monoclonal antibody) 을 이용하여 면역형광염색법(Immunofluorescence assay)을 수행하였다. 그 결과, Nf-profilin 단백질은 파울러자유아메바 포낭형의 세포질 내 액포 (vacuoles) 부분을 제외한 전체에서 강하게 발현하는 것을 확인하였다. 반면, 영양형에서는 세포의 내부나 위족 부분에 한정적으로 약하게 발현하였다(Fig.

7A). 한편, Nf-profilin 단백질이 결합한다고 알려진 Nf-actin의 항체를 처 리하여 동일한 실험을 진행하였을 때, Nf-actin의 항체를 처리한 영양형에서 는 food-cups로 추정되는 부분에서 Nf-actin 단백질이 강하게 발현하였으나 포낭형에서는 세포질 내에 형성된 food-cups 부분에서만 약하게 발현되었다 (Fig. 7B).

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-Fig. 7. Localization of Nf-profilin and Nf-actin protein in the N. fowleri trophozoites and cysts by a fluorescence microscope. Immunofluorescence assay were carried out using Nf-profilin monoclonal antibody(A) and Nf-actin antibody(B) conjugated with DAPI and FITC, respectively.

T, N. fowleri trophozoites; C, N. fowleri cysts.

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2) 공초점 레이저 주사(confocal) 현미경 관찰 결과

아메바 영양형과 포낭형 내부에서 발현되는 Nf-profilin 단백질의 위치를 보기 위하여 앞선 결과에 추가적으로 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였 을 때, 영양형에서는 대부분 아메바의 위족 말단 부분에서 발현되는 경향을 보였으며 포낭형에서는 아메바 내부 전체에 Nf-profilin 단백질이 발현하는 것으로 관찰되었다(Fig. 8). 동일한 방법으로 실험을 진행하여 Nf-actin 단 백질의 위치를 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과, 영양형에서는 아 메바의 food-cups에 Nf-actin 단백질이 매우 강한 발현을 보였으며 포낭형 에서는 세포 내부에서만 약한 발현을 보였다(Fig. 9)

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-Fig. 9. Localization of Nf-actin protein in N. fowleri trophozoites and cysts by a confocal microscope. T, N. fowleri trophozoites; C, N.

fowleri cysts. x800.

3. 표적세포와 혼합배양 시 파울러자유아메바의 포식작용과 Nf-profilin 유전자 발현

1) 혼합배양시간에 따른 파울러자유아메바의 형태학적 변화

표적세포가 있을 때 파울러자유아메바의 포식작용 여부를 형태학적으로 관찰하기 위하여, 표적세포인 CHO 세포에 파울러자유아메바의 영양형과 포낭 형을 각각 혼합배양 후, 위상차 현미경을 이용하여 파울러자유아메바의 식세포 작용(phagocytosis) 등 형태학적 변화를 관찰하였다. 아메바를 처리하지 않은 CHO 세포(대조군 I 및 II)는 24시간 동안 계속해서 분열하여 증식하는 양상 을 보였다. CHO 세포에 아메바의 영양형과 포낭형을 각각 배양한 경우(실험군 I 및 II)에서는 시간이 경과함에 따라 아메바의 식세포 작용에 의해서 수가 줄 어들고 둥근 모양으로 변화하거나 culture flask 바닥에 CHO 세포가 붙어있던 흔적만이 남아있는 것을 볼 수 있었다(Fig. 10).

CHO 세포에 아메바의 영양형만을 혼합배양한 실험군 I에서는 배양 1시간 부터 아메바들이 포식작용을 하기 위해 숙주세포 주위에 모여들며, 이미 달라 붙어 있는 형태도 많이 관찰되었다(Fig. 10). 관찰 6시간부터는 아메바가 CHO 세포를 빠르게 포식하기 시작해 12시간 이후부터는 CHO 세포보다 아메 바의 수가 더 많이 관찰되었다. 배양 24시간에는 대부분의 CHO 세포는 흔적

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-이 관찰되었다(Fig. 10). 혼합배양 6시간부터는 포낭형의 아메바들-이 탈낭을 거쳐 영양형으로 변화하기 시작하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이미 영양형으 로 변화하여 CHO 세포에 붙어있는 양상 또한 볼 수 있었다(Fig. 10). 12시간 부터는 대부분의 포낭형이 영양형으로 변화하여 CHO 세포를 빠르게 포식하고 있었다. 혼합배양 24시간에는 포낭형을 거의 찾아보기 힘들고, CHO 세포의 개 체 수는 현저히 줄어든 것을 볼 수 있었다(Fig. 10). 실험군 모두 혼합배양 시 간이 경과함에 따라 CHO 세포의 수는 크게 감소하였다.

Fig. 10. Microscopic observation of N. fowleri co-cultured with CHO cells, which show the phagocytosis post co-incubation for 1, 3, 6, 12 and 24 hr. Control GI, CHO cells in DMEM; Control GII, CHO cells in DMEM mixed with Nelson’s medium; Exp GI, CHO cells with N.

fowleri trophozoites; Exp GII, CHO cells with N. fowleri cysts. Nf, N.