Screening of Cyclooxygenase-2 (COX-2) Inhibitors from Natural Products

천연물로부터 사이클로옥시게나제 -2 저해제 검색

문 태 철 *

*영남대학교 약학대학.

• 정규찬황 • 손 건 호 ?^ • 김 현 표 * ■ 강 삼 식 ** • 장 현 욱 "^

도안동대학식품영양학과. * 강원대학약학대학. ** 서울대학교 천연물과학연구소 (Received February 12, 1998)

Screening of Cyclooxygenase-2 (COX-2) Inhibitors from Natural Products

Tae Chul Moor/, Kyu Cham Chung*, Kun Ho Son*, Hyun Pyo Kim*

Sam Sik Kang** and Hyeun Wook Chang*® ^C ollege of Pharm acy, Yeungnam U niversity, K orea

* Departm **N *College of Pharm atural Products Res. Institute Seoul N ent Food & N acy, K utrition, Andong N angw an N ational U ational U ational U niversity, K niversity, K niversity, K orea orea orea

Abstract—Tissue distributions and association of cyclooxygenase-2 (COX-2) with inflammatory have led us to search for COX-2 selective inhibitors from natural products. Conceptually. COX-2 selective in­

hibitors should be expected to retain anti-inflammatory efficacy by inhibition of PGs production while reducing or eliminating the gastric, renal and hemostatic side effects commonly associated with NSAIDs use. Thus, a logical approach to the treatment of inflammatory diseases should involve the in­

hibitors of COX-2. To develope new COX-2 inhibitors from natural products, two-hundred crude drugs were Screened by inhibiting PGD2 generation in bone marrow derived mast cells (BMMC). Among them. 6 methanol extracts of crude drugs such as. Bletillae rhizoma, Aconiti koreani rhizoma, Belamcandae rhizoma, Nelumbinis semen, Gleniae radix, Aurantii immatri pericarpiuminhibited more than 85% of BMMC COX-2 activity at a concentration 2.5

Keywords □ Nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDS), Prostaglandins, BMMC.

inhibitor. Natural products.

Eicosanoid 생합성온 일반적으로 phospholipase A2(PLA2)에 외한 세포막 인지질로부터 arachidonic acid의 유리. cyclooxygenases(COXs) 에 의한 ara- chidoic acid의 P G G ^ 의 번환과. 동시에 PGGa의 환 원에 의한 PGHa로의 peroxidase 반응. 효^ hemato- poieic P G D2 synthase와 같은 마지막 단계의 효소에 의해서 이루어진다. ^ COXs는 두 중류의 isoform 즉.

C0X-1 과 C0X-2가 존재하는데 이둘의 분자량은 모두 약 70kDa정도^비며 두 isozyme은 약 60%의 아미노산 유사성을 가진다. " COK-2는 C O X rl과는 달리 C-말

* 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로 ( 전화) 053-810-2811 ( 팩스) 053-811-3871

단 부근에 18개외 아미노산이 삽입되어 있으나. 효소활 성에 중요하다고 여겨지는 모든 잔기는 동일하다.

C0X-1 은 소포체 (E R ) 의 lum inal side에 존재*^하는 반 면 C0X-2는 E R 뿐만 아니라 perinuclear envelope에 도 존재하는 것으로 알려져 있다.®^ C0X-1 은 거의 모든 조직이나 세포에 발현되어 있으며, 일반적으로 cy- tokine에 의한 유도는 아주 미 비 하 다 . " 세 포 에 서 의 C0X-1 외 역할은 그둘의 "House keeping activity" 를 조절하는데 필요한 prostanoid를 생산하는 것으로 예 를 들면. 혈소관에 의한 TXA2(throm boxane A2) 의 생 산이나, 혈관 내피세포에 의한 항혈전 prostacycline의 생산. 소화기 점막에서의 cytoprotective prostanoid 생산, 신장에서의 신혈류 조절작용을 갖는 prostanoid

214

천연물로부터 사이 클로옥시게나제-2 저해 제 검색 215

의 생산등이며, C0X-1 유전자 역시 다른 일반적인

"House keeping genes" 의 특징인 TATA-less pro- moter를 가지는 것으로 알려져 있다.*®

C0X-2는 각중 사 이 토 카 성 장 인 자 , 그람옴성균세 포의 세포벽 구성성분인 LPS(lipopolysaccaride), phorbol ester, cAMP-elevating agent, 그리고 몇몇 O p ro te in 관련시약 등에 대하여 반응하여 즉각적으로 유도되어진다. ^ ® 따라서, C0X-2 의 발현은 cAMP, protein kinase C, tyrosine kinase 경로등의 여러 가지 복합적인 정보전달계에 의해 조절되어질 것으 로 예상된다. C0X-2의 m R N A 는 m ultiple RN A ins­

tability sequences(AUUUA)가 3느untranslated 영 역에 존재하는데 이것이 RN A 분해조절에 의한 전사의 조절에 중요한 역할을 할 것이라 생각되고 있다.^®

최근 IL-3존재하에서 배양한 생쥐 골수유래 비만세 포 (B M M C )는 IL-10, IL - lp 의 흔합조건에서 c-kit ligand(K L) 또는 FceRI 교차에 의하여 활성화되면 C0X-2외 발현과 함께 prostaglandin DzCPGDa) 의 생산, 내재성 사이토카인의 발현 등이 유도된다고 보고 되었다/^ '호® 특히, arachidonic acid cascade 대사산 물이■나 사이토카인의 장시간의 점진적인 생산, 유리는 기관지 천식이나, 아토피성 피부염과 같은 만성적인 알 러지환자의 상태를 반영하는 것이기 때문에, 최근에는 비만세포 활성화시의 번화와 분자기전에 대한 관심이 높아지고 있다.

B M M C 는 in 에서 쉽게 배양될 수 있다는 사실 과 동시에 여러 사이토카인에 대해 반웅성을 가지며, 결 합조직형, 점막형 비만세포로의 분화 이전 미성숙 단계 세포라는점 등에서 비만세포의 병태생리학적 측면을 연구하는데 좋은 재료가 될 수 있다.

항 염증제인 텍사메타손은 C0X-2 m R N A 의 안정성 을 감소시키거나, C0X-2 유전자의 전사를 억제시켜 C0X-2 발현을 감소시키는 것으로 알려져 있다/^*®

비스테로이드성 항염증약(N SA ID s)는 CO Xs 활성을 저해하여 그 효능을 나타내는 것으로 알려겨 있으나, 소 화성궤양이나 신기능 이상 등외 부작용으로 사용이 제 한되고 있다. 이 현상은 C0X-1 의 저해에 의함이라고 알려졌다. 아스피린은 살리실산에서 C0X-1. C0X-2 활성자리의 serine 잔기로 acetyl group을 이동시켜 이들 효소를 비가역적으로 저해시키며/* ® 인도메타신 은 초기에는 C0X-1, C0X-2에 가역적인 비공유결합 성 결합을 일으키나. 곧이어 이둘 효소외 구조적 번화를

야기시켜 비가역적 결합을 하게 되는 것으로 알려져 있 다 .2*> 아스피린과 인도메타신은 C0X-2보다는 COX- 1에 더욱 특이성이 었기때문에 소화성 궤양이나. 신기 능 이상등의 부작용을 을 초래한다.® 최근에는 COX- 2에 강한 선텍성을 가진 NS-398®과 같은 아릴슬폰계 의 화합물이 소염 , 진통작용을 가지면서 N S A ID s외 부 작용을 경감시킴이 밝혀져^* 버교적 C 0X -2에 선텍성 이 특이적인 저해제가 유기합성등을 통하여 계속적으 로 개발되고 있다.

이상에서 기슬한 것과 같이 C0X-2 특이적 저해제는 진통, 소염등의 다양한 약리학적 효과는 지 니 면서 . 소화 성 궤양이나, 신기능 이상등과 같은 부작용이 없는 새로 운 항염중제가 될 것으로 기대된다. 따라 서, 본 연구진 은 지금까지 천연물에서 성분의 분리 및 구조결정에 관 한 다년간외 경험을 바탕으로 B M M C 를 이용하여 C0X-2의 특이적 저해제를 찾아서 새로운 차원의 항염 증제를 개발하는데 필요한 기초적인 자료를 제공하려 고 한다.

실험방법

실험재료 및 시약

실험재료 - 본 연구에 사용한 생약은 한약 도매시장 에서 구입하여 실험 재료로 사용하였다.

시약 - Recom binant mouse c-Kit ligand (K L), ILrlO , aspirin는 Sigma Chemical사 (St. Louis,M O ), IL-IP, IL-3, W EHI-3 cell는 일본 Showa 대학 Kudo Ichiro 교수로부터, Lipopolysaccaride (L P S)는 Difco Laboratories사 (Detroit, M I), RPMI-1640 M edium 는 G IB C O B R L사. Fetal bovine serum (FB S) 는 Hyclone사 , PG D2 radioim m unoassay (R IA ) sys- tem 은 Am ersham 사 . dimethylsulfoxide (D M S O )는 M E RC K 사에서 구입하여 사용했으며. 그 이외의 모든 시 약은 특급품을 사용하였다.

시료의 조제

건조한 시료 100 금을 m ethanol로 3시간 3회 열추출 하고 , 이 추출액을 합한후 농측 건조하여 이를 me- th an o l 추출물로 사용하였다. 각 m e thanol 추출물을 물로 현탁시 킨후 n-hexane, C H C I3, ethylacetate 및 n-butanol로 단계적으로 분획하고 마지 막 분획을 물분 확으로 하여 저해활성 검색에 사용하였다.

Vol. 42, No. 2, 1998

Treminaliae Fructus Puerariae Radix Puerariae Flos Chrysamthemi Flos Euphorbiae Kansui Radix Euryales Semen

Glycyrrhizae Radix Angelica© Koreanae Radix Curcumae Longae Radix Visci Herba

Cassiae Semen

Galli Stomachichum Corium Meliae Cortex

Angelicae Tenuissimae Tadix Caraganae Radix

Drynariae Rhizoma Melonis Calyx

Crassirhizomae Rhizoma Trichosanthis Semen Sophorae Fructus Sophorae Flos Dianthi Herba Limbricus

Testudinis Plastrum Citri Unshiu Semen Cobotii Rhizoma

Rosae Laeuigatae Fructus Lonicerae Flos

Platycodi Radix Raphani Semen Aloe

Cervi Comu Echinopsis Radix Angelicae Gigantis Radix Arecae Pericarpium Hydnocarpi Semen Rhei Rhizoma

Araliae Cordatae Radix Benincasae Semen Malvae Semen Eucommiae Cortex Aristolochiae Fructus Ephedrae Herba Ephedrae Radix Codomopsis Radix Viticis Fructus Liriopsis Tuber

Hordei Fructus Germinatus Gossypii Semen

Oystreae Testa Chaenomelis Fructus Moutan Cortex Radicis Equiseti Herba Akebiae Caulis Myrrha Buddleiae Flos Menthae Herba

Pharm. Soc. Korea Table I — Inhibitory activity of methanol extract of

crude drugs on COX-2 in mouse bone mar­

row derived mast cells (BMMC)

Korean ^ ^ COX-2

Name Pharmaceutical Name inhibition

%

BM M C 의 조제

M ale B A L B /cJ m ice로부터 채취한 골수세포는 50% enriched m edium (R P M I 1640 containing 100 u nits/m / penicillin, 100 m g/m / streptom ycin, 10 m g/m / gentam ycin, 2 m M L-glutam ine, 0.1 m M nonessential am ino acids and 10% fetal bo­

vine sem m )과 IL-3의 공급원으로 50% W EHI-3 cell-conditioned m edium 을 사용하여 배양하면 약 4주 후 98% 이상의 B M M C 룰 얻을 수 있었으며 , 10주 정도 배양이 가능하였다

COX-2 활성의 측정

B M M C 내의 C0X-1 를 불활성화시키기 위하여 B M M C 를 머리 lx l(y ^ cells/m / 농도로 하여 l(H ig / m l asp irin으로 2시간동안 배양한 후 C0X-2 발현을 위하여 B M M C 률 enriched m edium 으 3회 세척한 후 1X10® cells/mZ 농도로 하여 100 ng/mZ K L, 100 U /m l IL-10, 5 ng/m / IL - lp , 100 ng/m / LPS 및 천 연물 추출액 2.5 ng /m /의 혼합조건에서 37°C C O2

inubator내에서 8시간 동안 배양하였다. 반응은 120 x g, 4°C에서 5분간 원심분리하여 종결시키며, 원심분러 후 상층액을 PGD2 유리 량의 측정에 이용하였다.

배양 상층액내의 P G D2는 P G D2 assay kit(Am er- sham , B uckingham shire. U K ) 룰 사용하여 죽정한 후 C0X-2 활성으로 환산하였다.

결과 및 고찰

한방과 민간에서 사용되고 있는 생약을 무작위로 200종 선택하여, 유기용매범으로 추출한 후 염중반응 및 알러지등 여러질환에 관련된 PG s의 생산효소로 알 려진 C0X-2 저헤활성을 B M M C 를 이용하여 검색한 결과를 Table I에 요약하였다.

Table I의 결과에 B M M C 외 C0X-2 저해활성을 검 색한 결과는 다옴과 같다.

1. 909^이상의 저해활성을 나타내는 생약은 다옴과 같다.

사간. 원방풍 2중류의 생약에서 강한 저해활성이 있 옴을 알수 있었다.

2. 8 0 ^8 9 % 외 저해활성을 나타내는 생약은 다옴과 같다.

가자, 골쇄보, 내복자, 백급, 백단향. 백부자, 승마, 연

3 7 2 0 0 2 0 1 0 9 0 0 0 0 0 2 4 9 0 0 0 0 7 0 8 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 5

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가자 각갈근 갈화 감국 감수 감인 감초 강활 강황 겨우살이 결명자 계내금 고련피 고본 골담초근 골쇄보 과초 관중 괄루인 괴팍 괴화 구맥 구인 구관 글핵 금모구척 금앵자 금은화 길경 내복자 노회 녹각 누로 당귀 대복괴 대풍자 대황 득활 동과자자 령

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양강 Alpiniae OfTicinarum Rhizoma Artemisiae Asiaticae Herba 애엽

어성초 Hoittiyniae Herba 여정실 Ligudtri Fructus 연교 Forsythiae Fructus 연자육 Nelumbinis Semen 영신초 Polygalae Japonicae Herba

영지 Ganoderma

오가피 Acanthopanacis Cortex 오머자 Schizandrae Fructus 오수유 Evodiae Fructus 오적 골

와송

Sepiae Os Orostachys Herba 왕불유행 Melandrii Herba 용골 Fossilia Ossis Mastodi 용안육 Longanae Arilus 우슬 Achyranthis Radix 원방풍 Gleniae Radix 원지 Polygalae Radix 유근괴 Ulmi Pumilae Cortex

유황 Sulfur

육두구 Myristicae Semen

육계 Cinnamomi Cortex Spissus 육중용 Cistanchis Herba

익모초 Leonuri Herba 음양곽 Epimedii Herba

인진호 Artemisiae Capillaris Herba 일천궁 Cnidii Rhizoma

작약 Paeoniae Radix 저령 Polyporus

저실자 Broussonetiae Fructus 적석지 Halloysitum Rubrum

전층 Buthus

전호 Anthrisci Radix 정공피 Sorbus Cortex 조각자 Gleditsiae Spina

조구등 Uncariae Ramulus et Uncus 조협 Gleditsiae Fructus

중유석 Stalactium

죽여 Bambusae Caulis in Taeniam 죽엽 Bambusae Folium

지각 Auranthii Fructus 지모 Anemarrhenae Rhizoma 지부자 Kochiae Fructus 차전자 Plantaginis Semen 천마 Gastrodiae Rhizoma 천련자 Meliae Fructus 천산갑 M anitis Squama 천오 Aconitii Tuber 천화분 Trichosanthes Radix 청목향 Aristolochiae Radix

청괴 Aurantii Im matri Pericarpium 초과 Amomi Tsao-ko Fructus 조두구 Alpiniae Katsumadaii Semen 측백 엽 Biotae Orientalis Folium 텍란 Lycopi Herba

텍사 Alismatis Rhizoma 토복령 Smilacis Rhizoma 토사자 Cuscutae Semen 파고지 Psoraleae Semen Pinelliae Tuber

Ledebouriella Radix Sinapis Semen Alba Chelidonii Herba Bletillae Rhizoma Santali Album Lignum Ammomi Rotuni Fructus Pulsatille Radix

Ampelopsis Radix Imperatae Radix Cynanchi Radix

Aconiti Koreani Rhizoma Dictamni Radicis Cortex Thujae Semen

Angelicae Dahuricae Radix Tribuli Fructus

Atractylodes Rhizoma Alba Dolichoris Semen

Lilii Bulbus Amydae Carapax Strychni Ignatii Semen Hoelen

Rubi Fructus Hoelen Cum Radix Zedoary

Aconiti Tuber Spirodelae Herba Torreyae Semen Eriobotryae Folium Tokoro Rhizoma Belamcandae Rhizoma Quisqualis Fructus Torilidis Fructud

Sophorae Subprostratae Radix Curni Fructus

Dioscoreae Rhizoma Zizyphi Spimosi Semen Notoginseng Radix Loranthi Ramulus Phytolaccae Radix Vagina Ovorum Mantidis Rehmanniae Radix Dendrobii Herba Acori Graminei Rhizoma Curculiginis Rhizoma Inulae Flos

Cocadae Periostracum Asuasari Radix Tritici Semen Caesalpiniae Lignum Perillae Herba Perillae Semen Picrasmae Fructus Foeniculi Fructus Phlomidis Radix Cynomorii Herba

Rehmanniae Radix Preparata Cimicifugae Rhizoma Bupleuri Radix Magnoiiae Flos

Vol. ^42, No. 1, 1998

천연물로부터 사이클로옥시게나제-2 저해 제 검색 217

T able I —Continued Korean

Name Pharmaceutical Name COX-2 Inhibition

%

T a b le I — Continued Korean

Name Pharmaceutical Name COX-2 Inhibition

%

- 7 5 6 1 8 6 2 0 0 5 2 0 0 7 9 0 0 5 5 7 0 0 0 9 2 0 4 0 7 2 4 0 0 0 0 0 0 0 3 0 3 7 2 2 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 4 0 2 3 -

^ 2 5 8 8 7 3 7

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Monndae Radix Patriniae Radix

Polygoni Avicularis Herba Piperis Longi Fructus Glauber! te

Rosae Rugosae Root Kalopanacis Cortex Notarchi Eachii Ovum Cyperi Rhizoma Elsholtziae Herba Scrophulariae Radix Geranii Herba Corydalis Tuber Schizonepetae Herba Trigonellae Semen Sesami Semen

Polygoni Cuspidati Radix Picrorrhizae Rhizoma Carthami Flos Carthami Semen Betulae Cortex Astragali Radix Polygonati Rhizoma

자육. 청피 . 9종의 생약이었다.

저자등은 이러한 방법으로 오수유로부터 새로운 C0X-2 저해제를 성공적으로 분리하여 현재 in u/170에 서 그 효눙을 검토중에 있다.

금후 계속적으로 강한 C0X-2 저해활성을 나타내는 생약을 선택하여 유기용매분획을 통하여 저해제를 검색 하면 지금까지 보고된 저헤제와는 다른 구조를 가진 N SA ID s의 개발에 필요한 기초적인 자료가 제공될수 있으리라 기대된다.

감사의 말씀

본 연구는 보건복지부 신약개발과제에 외해 수행되 었 기에 이에 감사를 드럽니다.

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Table I — Continued_________________________________

Korean COX-2

Name Pharmaceutical Name inhibition

%

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genous prostaglandin D2 production is likely antigen-presenting cells-localization of g lu ­ tathione-requiring prostaglandin-D synthase in histiocytes, dendritic and kupffer cells in vari­

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9

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5

5

7

7

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천연물로부터 사이클로욕시게나제-2 저해 제 검색 219

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