DOI 10.17480/psk.2016.60.6.285
페닐피리딜부테노이드 이량체의 합성 및 일산화질소 생성 억제작용
방원영† · 박해일# 강원대학교 약학대학
(Received August 31, 2016; Revised November 2, 2016; Accepted November 2, 2016)
Synthesis of Phenylpyridylbutenoid Dimers and their Inhibitory activity against NO Production
Yuanying Fang† and Haeil Park#
College of Pharmacy, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Gangwon-Do, Republic of Korea
Abstract — Several naturally occurring phenylbutenoid dimers were reported to possess anti-inflammatory activity. Three phenylpyridylbutenoid dimers(#1, #2 and #3) were synthesized and evaluated for their inhibitory activities against NO production from LPS-induced RAW 264.7 cells. None of the tested phenylpyridylbutenoid dimers showed any inhibitory activity against NO production, exhibiting cytotoxicity at a concentrated(100µM) dose. These results imply that substitution of the benzene ring-A of the natural phenylbutenoid dimer(R=OMe) to a less hydrophobic pyridyl group results in loss of bioactivity.
Keywords □ phenylpyridylbutenoid dimers, anti-inflammatory, nitric oxide(NO) production
Zingiber cassumunar Roxb.는 동남 아시아에 넓게 분포되어 있는 열대 양강의 일종이며,1,2) 이 생약의 추출물은 오래 전부터 태국에서 마사지 오일로 사용되어 왔다. 추출물의 주성분으로 페 닐부테노이드 및 이들의 이량체 화합물이 알려져 있으며(Fig. 1), 이들 중 이량체 천연물인 트란스-3-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-4- [(E)-3,4-디메톡시스티릴]사벤젠환-이클로헥-1-엔(R=OH)과 트란 스-3-(3,4-디메톡시페닐)-4-[(E)-3,4-디메톡시스티릴]사이클로헥-1- 엔(R=OMe)이 유효물질로 분리되었다. 이들 물질은 RAW.264.7 세포를 사용한 실험에서 리포폴리사카라이드에 의해 유도된 프 로스타그란딘 E2생성을 강력하게 억제하는 사실을 규명한 논문 이 발표되었다.2,3)이와 같은 연구결과는 이들 페닐부테노이드 이 량체 구조가 신규 항염증제 개발의 천연 골격의 소재로 충분한
가치가 있음을 암시하고 있다.
최근 이들 천연 페닐부텐노이드 이량체 화합물의 비대칭 합성 에 관한 논문이 발표되었고,4,5)이들 물질에 대한 생리활성 측정 결과 항염증효과 뿐만 아니라 특정 암세포에 대해 세포독성을 갖 는 사실이 확인되었다.4)본 연구자는 선행 논문에서 페닐부테노 이드 화합물의 구조-활성 상관관계연구를 실행하여 두 개의 벤 젠환에 치환된 치환기가 일산화질소(NO) 생성억제에 미치는 영 향을 탐색한 결과 벤젠환-B의 3번, 4번 위치에 존재하는 치환기 의 변환은 벤젠환-A의 치환기 변환에 비해 약효에 비교적 큰 영 향을 나타내었으며 소수성의 증가가 약효 증강에 일부 작용하는 것을 고찰하였다.6)본 논문에서는 선행연구에서 관찰된 구조-활 성 상관관계 연구결과를 바탕으로 구조변환이 약효에 큰 영향을 미치는 벤젠환-B의 구조를 유지하고, 비교적 구조적 변환에 영 향이 적은 벤젠환-A의 3,4-디메톡시페닐기에 비해 소수성 값이 감소된 피리딜기를 도입한 화합물을 설계-합성하여(Fig. 2) 이들 물질의 일산화질소 생성억제력을 평가함으로서 구조변환에 따른 치환기의 소수성 값의 변화가 생물학적 활성에 미치는 영향을 탐 색할 목적으로 본 실험에 착수하였다.
#
Corresponding Author Haeil Park
†
National Engineering Research Center, Jiangxi University of Tra- ditional Chinese Mrdicine, 56 Yangming Road, Nanchang 330006, China
Tel.: 033-250-6920 Fax.: 033-259-5630
E-mail: [email protected]
Short Report
종설재료 및 방법
본 실험에 사용한 시약은 시판품을 사용하였고, 추출 및 컬럼 에 사용한 용매는 국내 시약사로부터 구매한 특급용매를 별도의 정제과정을 거치지 않고 그대로 사용하였으며, 무수용매는 HPLC 등급의 해당 용매를 구입 후 별도의 건조 및 증류과정을 거쳐 얻 어진 순수한 물질을 반응에 이용하였다. 1H-NMR(300 MHz, 400 MHz) 및 13C-NMR(100 MHz)은 Bruker Avance 300 및 400을 사용하여 측정하였으며 내부표준 물질로 tetramethylsilane (TMS)을 사용하였으며 질량분석(LRMS)은 AB SCIEX API 3200을 사용하여 측정하였다. 분석용 박층 크로마토그라피(TLC) 는 Merck 제품인 실리카 젤 60F254를 사용하였고, 일반 컬럼 크 로마토그라피는 Merck 제품인 Kieselgel 60(70-200 Mesh)를, 플 래시 컬럼 크로마토그라피는 Merck 제품인 Kieselgel 60(230- 400 Mesh)를 사용하였다.
생리활성 평가에 사용한 lipopolysaccaride(LPS)는 Sigma Chemical Co.에서 구매하였고, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 FBS(fetal bovine serum)를 포함한 기타 cell culture 시약들은 Gibco(California, USA)에서 구매하여 사
용하였다.
신규 페닐피리딜부탄노이드 이량체(#1~#3)의 합성
Fig. 2에서 제시한 신규 페닐피리딜부테노이드 이량체의 합성 을 위하여, 아래 도표 1에 제시된 합성경로를 이용하였다.6)즉, 피리딜 알데히드로부터 3 단계로 제조된 일라이드 화합물(3a~3c) 과 이미 선행논문에서 서술된 경로를 통하여 제조가 가능한 (1R,2S)-3’,4’-디메톡시-1,2,3,4-테트라히드로[1,1‘-바이페닐]-2-카발 데히드를6)축합하면 목적의 이량체화합물 E-isomer (#1~#3) 을 얻을 수 있다. 생성된 이량체화합물의 이중결합의 입체화학 은 선행 논문에서 언급된 바와 같이 이중결합의 두 수소 간의 결 합상수의 크기(J = 15.8 Hz ~ 18.0 Hz)를 고려하여 E-입체화학을 갖는 것으로 결정하였다.5)
일라이드 화합물(IIIa~IIIc)의 합성
시약으로 구매한 2-피리딜 알데히드 화합물(1.0 g, 9.3 mmol) 을 메탄올(10 mL)에 용해하고 온도를 0oC로 냉각 시킨 후, 수 소화붕소 나트륨(0.5 g, 12.6 mmol)을 가하고 실온에서 5 시간 교 반시켰다. 반응액에 3% 묽은 염산을 가하여 반응을 종료 시킨 후, 감압 농축하여 용매를 모두 제거하였다. 잔사를 디클로로메 탄에 다시 용해시킨 후, 물로 세척하고 다시 포화 식염수를 가하 여 추출하고 분리된 유기층을 무수 황산마그네슘을 가하여 건조 시켜 옅은 황색의 오일을 70% 수율로 얻었다. 감압-농축 하여 얻어진 조생성물(Ia)을 별도의 정제과정을 거치지 않고 다음반 응에 사용하였다. 시약으로 구매한 3-피리딜 알데히드, 4-피리딜 알데히드로 동일한 방법으로 환원하여 각각의 알콜 화합물(Ib 및 Ic)을 제조하였다.
Fig. 1 − Structures of phenylbutenoid dimers and phenylbutenoids isolated from Z. cassumunar.
Fig. 2 − Structures of designed phenylpyridylbutenoid dimers.
Scheme 1 − Synthetic pathway of phenylpyridylbutenoid dimers.
알콜 화합물 Ia를(0.70 g, 6.4 mmol)를 무수 디클로로메탄 (10 mL)에 용해시킨 후, 냉각 후 염화티오닐(0.80 g, 7.1 mmol)을 가하고 실온에서 1 시간 반응하였다. 반응액을 포화 중조수용액 및 식염수로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조 후 여과하여 여액을 감압-농축하여 옅은 황색 오일의 조생성물(IIa, 0.57 g, 77%)을 얻었다. 별도의 정제과정을 거치지 않고 다음 반응에 그 대로 이용하였다. 알콜 화합물 IIb 및 IIc를 동일한 방법으로 염 소화하여 각각의 할로겐 화합물(IIb 및 IIc)을 제조하였다.
할로겐 화합물 IIa를(0.57 g, 4.5 mmol)를 아세토니트릴(6 mL) 에 용해시킨 후, 트리페닐포스핀(1.30 g, 4.95 mmol)을 가하고 철 야 가열 환류하였다. 반응액을 냉각 시켜 석출하는 고체를 여과 하여 제거 후, 초산에틸 에스테르를 가한 후 포화 식염수로 세척 하고 무수 황산마그네슘으로 건조 후 여과하여 여액을 감압-농축 하여 옅은 황색의 고체로 조생성물(IIIa, 1.40 g, 82%) 얻었다. 별 도의 정제과정을 거치지 않고 다음 반응에 그대로 이용하였다. 할 로겐 화합물 IIb 및 IIc를 동일한 방법으로 염소화하여 각각의 일라이드 화합물(IIIb 및 IIIc)을 제조하였다. 생성된 일라이드 화합물(IIIa. IIIb 및 IIIc)은 기지물질로서 발표된 문헌의 핵자 기공명 스펙트럼 데이터와 비교하여 구조를 확인하였다.7)
2-((Chlorotriphenylphosphoranyl)methyl)pyridine(IIIa)
1H-NMR(300 MHz, CDCl3): δ 8.31(s, 1H), 8.07(d, J = 3.6 Hz, 1H), 8.00~7.51(m, 15H), 7.32(s, 1H), 7.15~7.05 (m, 1H), 6.95(d, J = 15.5 Hz, 2H).
3-((Chlorotriphenylphosphoranyl)methyl)pyridine(IIIb)
1H-NMR(300 MHz, CDCl3): δ 8.52(s, 1H), 8.15(s, 1H), 7.95(d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.91~7.62(m, 15H), 7.22~7.05(m, 1H), 6.81(d, J = 14.8 Hz, 2H).
4-((Chlorotriphenylphosphoranyl)methyl)pyridine(IIIc)
1H-NMR(300 MHz, CDCl3): δ 8.34(d, J = 5.1 Hz, 2H), 7.35 (bs, 2H), 7.90~7.57(m, 15H), 6.01(d, J = 16.2 Hz, 2H).
페닐피리딜부테노이드 이량체(#1~#3)의 합성
일리드 화합물 IIIa(530 mg, 1.36 mmol)를 무수 톨루엔에 용 해시킨 후, -20oC로 냉각하고 부틸리튬(1.36 mmol)을 서서히 가 하고 30분 교반하였다. 기지의 방법으로6)제조된 (1R,2S)-3’,4’- 디메톡시-1,2,3,4-테트라히드로[1,1‘-바이페닐]-2-카발데히드의 톨 루엔 용액을 반응액에 서서히 가하고 3 시간 동안 가열-환류하 였다. 반응액을 냉각 후, 포화 염화암모늄 수용액을 가하여 반응 을 종결 시키고 초산에틸 에스테르로 추출 후 포화 중조수용액, 포화 식염수로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조 후 여과하 여 여액을 감압-농축하여 얻은 조생성물을 컬럼 크로마토그라피 를 시행하여 정제하여 무색 오일로 생성물(#1) 140 mg(40%)을
얻었다. 일리드 화합물 IIIb 및 IIIc를 동일한 방법으로 (1R,2S)- 3’,4’-디메톡시-1,2,3,4-테트라히드로[1,1‘-바이페닐]-2-카발데히드 와 반응하여 목적의 무색 오일 상태의 페닐피리딜부테노이드 이 량체(#2 및 #3)를 각각 48%, 61% 수율로 제조하였다.
2-((E)-2-((1S,2R)-3',4'-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydro- [1,1'-biphenyl]-2-yl)vinyl)pyridine(#1)
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 8.49(d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.53(dt, J =1.8 Hz, 7.7 Hz, 9.4 Hz, 1H), 7.11(d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.04(dt, J = 0.7 Hz, 5.7 Hz, 7.3 Hz, 1H), 6.80~6.65(m, 4H), 6.27(d, J = 15.8 Hz, 1H), 5.91~5.87(m, 1H), 5.70~5.68 (m, 1H), 3.85(s, 6H), 3.30~3.21(m, 1H), 2.51~2.43(m, 1H), 2.20(bs, 2H), 2.02~1.85(m, 1H), 1.80~1.65(m, 1H); 13C- NMR(400 MHz, CDCl3): δ 156.3, 149.7, 148.9, 147.7, 139.0, 137.7, 136.7, 130.5, 129.8, 127.9, 121.9, 121.5, 120.6, 112.1, 111.3, 56.2, 47.9, 45.7, 27.9, 24.7; LRMS m/z 344.2(M + Na)+.
3-((E)-2-((1S,2R)-3',4'-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydro- [1,1'-biphenyl]-2-yl)vinyl)pyridine(#2)
1H-NMR(300 MHz, CDCl3): δ 8.49(s, 1H), 8.41(d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.55(d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.17(dd, J = 7.4 Hz, 4.8 Hz, 1H), 6.91~6.72(m, 3H), 6.40~6.11(m, 2H), 5.91(bs, 1H), 5.71 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.92(s, 6H), 3.31~3.22(m, 1H), 2.52~2.33 (m, 1H), 2.31(s, 2H), 2.01~1.82(m, 1H), 1.70~1.61(m, 1H);
13C-NMR(400MHz, CDCl3): 149.1, 148.3, 147.8, 137.5, 136.9, 133.6, 132.8, 130.5, 127.9, 126.1, 123.7, 120.8, 111.8, 111.3, 56.3, 48.2, 46.0, 28.0, 24.8; LRMS m/z 344.2(M + Na)+
4-((E)-2-((1S,2R)-3',4'-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydro- [1,1'-biphenyl]-2-yl)vinyl)pyridine(#3)
1H-NMR(300 MHz, CDCl3): δ 8.52(bs, 2H), 7.21(bs, 2H), 6.80~6.62(m, 3H), 6.52~6.43(m, 1H), 6.40(dd, J = 18.0 Hz, 7.8 Hz, 1H), 6.19(d, J = 18.0 Hz, 1H), 5.92(m, 1H), 5.73(m, 1H), 3.92(s, 6H), 3.36~3.28(m, 1H), 2.52~2.32(m, 1H), 2.31(s, 2H), 2.01~1.82(m, 1H), 1.73~1.63(m, 1H); 13C-NMR (400 MHz, CDCl3): 150.3, 149.1, 147.9, 145.4, 139.5, 137.4, 130.4, 127.9, 127.6, 120.7, 111.8, 111.3, 56.2, 48.1, 45.9, 27.8, 24.7; LRMS m/z 344.2(M + Na)+.
페닐피리딜부타노이드 이량체의 NO 생성억제력 측정
LPS로 처리한 RAW 264.7 cells을 사용하였으며, 이미 발표된 논문에 사용되었던 기지의 방법으로 측정하였다.8)합성된 신규 페닐피리딜부테노이드 이량체(#1, #2 및 #3)의 NO 생성 억제 능을 측정한 결과(Fig. 3) 및 세포독성에 관한 결과(Fig. 4)를 다
음 도표에 나타내었다.
실험결과 및 고찰
신규 페닐피리딜부테노이드 이량체의 합성은 구매한 피리딜(2-, 3- 및 4-) 알데히드로부터 3 단계 과정을 통하여 얻어진 일라이드 와 선행연구에 기술된 기지의 방법으로 제조한 (1R,2S)-3’,4’-디메 톡시-1,2,3,4-테트라히드로[1,1‘-바이페닐]-2-카발데히드를 ’비티히 반응‘을 개선한 조건에서 축합시켜 신규 페닐피리딜부테노이드 이 량체(#1, #2, #3)를 제조하였다. 3개의 신규 페닐피리딜부텐노 이드 이량체 화합물의 항염증 활성은 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 cells을 이용한 NO 생성억제력을 측정하여 평가하였다. 3 개의 신규 이량체 화합물은 저농도(10 μM 이하)에서 NO 생성억 제력이 거의 없었으나, 고농도(100 μM)에서는 NO 생성이 억제되 는 것이 관찰 되었으나(Fig. 3), 이와 같은 결과는 MTT 에세이 결과 고농도(100 μM)에서는 3개의 신규 이량체 화합물 모두가 세 포독성을 나타내기 때문인 것으로 사료된다(Fig. 4).
결 론
천연물 페닐부테노이드 이량체(R=OMe)의 벤젠환-A(3,4-디메 톡시페닐기)에 비해 소수성(비극성)이 감소한 피리딜기를 도입한 부테노이드 이량체 화합물(#1, #2, #3)를 합성하여 일산화질소 생성억제력을 측정한 결과 대조물질에 비해 현저히 활성이 감소 됨을 나타내었으며, 고농도(100 μM)에서 강한 세포독성을 나타 내는 결과를 관찰하였다. 또한 치환된 피리딜기 내의 질소원자 의 배치(2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜)가 일산화산소 생성억제력 에 영향이 없음을 확인하였다. 이 결과는 부테노이드 이량체의 벤젠환-A 위치에 소수성 환경이 상이한 치환기를 도입하면 일산 화질소 생성억제력을 크게 변화 시킬 수 있음을 암시한다. 즉, 본 연구결과는 보다 개선된 생리활성을 갖는 신규 합성 부테노이드 이량체의 개발을 위한 기초자료로서 벤젠환-A의 구조변환이 중 요함을 시사한다.
감사의 말씀
이 논문은 “2014년도 강원대학교 학술연구조성비로 연구하였 음(과제번호-120140260)” 되었으며, 실험에 필요한 물질구조 분 석 및 생리활성 검색에 사용된 기기 및 시설은 강원대학교 공동 실습관 및 신약개발연구소의 도움을 받아 연구되었음으로 이에 감사드립니다.
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Fig. 4 − MTT bioassay results of synthesized phenylpyridylbutanoid dimers(#1, #2 and #3).
Fig. 3 − Inhibitory activity of NO production by phenylpyridylbutanoid
dimers(#1, #2 and #3). Data represents arithmetic mean of
triplicate experiments. % Inhibition = 100 × [1 – NO of LPS
with the chrysin analogs treated group – NO of the basal) /
NO of LPS treated group – NO of the basal)]. Note: Most
compounds tested showed cytotoxicity at high doses(20 µM,
40 µM) on RAW cells by MTT bioassay.
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