유도인자 처리가 품종별 발아현미의 항산화 성분 및 활성에 미치는 영향 ⁃

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유도인자 처리가 품종별 발아현미의 항산화 성분 및 활성에 미치는 영향

⁃ 연구노트 ⁃

김민영․이병원․김미향․김현주․이진영․강문석․구본철․이유영 국립식량과학원 중부작물부 수확후이용과

Effects of Elicitor Treatment on Antioxidant Compound and Activity of Germinated Rough Rice (Oryza sativa L.) Depending on Cultivars

Min Young Kim, Byong Won Lee, Mi-Hyang Kim, Hyun-Joo Kim, Jin Young Lee, Moon-Suk Kang, Bon Cheol Koo, and Yu-Young Lee

Department of Central Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration

ABSTRACT This study was to investigate the effect of various elicitor on antioxidant compound and activity of germinated brown rice. Brown rice seeds were germinated at 25°C for 48 hours and sprayed with four followed by analysis of total polyphenol content, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) and 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, and reactive oxygen species (ROS) inhibitory effects against oxidative damage in HepG2 cells. Elicitation with indole acetic acid (IAA) in germinated brown rice significantly increased polyphenol accumulation enhanced antioxidant activities. The highest total polyphenol content (26.44∼27.83 mg gallic acid equivalent/g extract), ABTS radical scavenging activity (27.64∼30.30 mg ascorbic acid equivalent (AAE)/g extract), DPPH radical scavenging activity (5.83∼6.87 mg AAE/g extract) observed in germinated brown rice IAA treatment. Also, germinated brown rice most effectively inhibited intracellular ROS level oxidative stress induced HepG2 cell. These findings that elicitation with 0.01% IAA potentially improve the antioxidant properties and health benefits of germinated brown rice.

Key words: brown rice, germination, elicitor, antioxidant activity

Received 5 March 2020; Accepted 4 April 2020

Corresponding author: Yu-Young Lee, Crop Post-Harvest Technol- ogy Division, NICS, RDA, Suwon, Gyeonggi 16613, Korea E-mail: leeyy@korea.kr, Phone: +82-31-695-0621

서 론

벼는 세계 3대 곡물 중 하나로서 벼를 도정한 쌀은 세계인 구의 절반 이상이 주식으로 이용하고 있으며(Lim 등, 2005), 최근 건강에 대한 인식이 높아짐에 따라 쌀과 발아종자를 대체 건강식품으로 전환 및 가공시키는 연구가 많이 진행되 고 있다(Kang 등, 2003). 벼는 현미 80%, 왕겨 20%로 구성 되어 있으며(Kim과 Park, 2001), 그중 도정하지 않은 형태 의 현미는 항산화력이 우수한 tocopherol, phytic acid, phenolic acid, γ-oryzanol, GABA 및 ferulic acid 등이 함유되어 있다고 보고되었다(Kim 등, 2004).

식물 종자가 발아하면 씨눈과 배젖에 있는 비활성상태의 DNA 유전정보가 활성화되고 각종 효소의 활성 및 영양소가 증가하여 최대의 영양상태가 갖추어지게 된다(Bartnick와 Szafránska, 1987). 씨눈 부분이 발아되면서 단백질과 아미 노산, 지방산, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 식이섬유 등이 변 화하며, γ-oryzanol이나 arabinoxylan, GABA 및 비타민

E 등의 생리활성 성분들도 증가하고 발아 중에 효소가 활성 화됨으로써 영양성분들의 체내 흡수가 용이하게 되는 것으 로 알려져 있다(Lee 등, 2007). 따라서 조, 기장, 수수(Ko 등, 2011), 메밀(Lee와 Kim, 2008), 들깨(Ghung과 Kim, 1998), 대두(Kim 등, 2004) 등 다양한 종자의 발아에 따른 유용성분 및 생리활성의 변화에 대한 연구가 활발히 진행되 고 있다. 그중 본 연구에서 사용한 발아현미는 조직을 연화 시켜 질감을 개선시킬 뿐 아니라 발아과정 중 식이섬유, 비 타민 B1, B2, E, 칼슘, 인 등의 무기질과 γ-amino butyric acid(GABA), β-sitosterol 등 각종 미량 기능성 성분과 현 미의 주요 기능성분인 tocopherol, phytic acid, phenolic acid, γ-oryzanol, GABA 및 ferulic acid 등이 증가하는 것으로 보고하였다(Lee 등, 2007).

식물에서 방어기작을 증가시키는 물질을 “유도인자(elicitor)”라고 하며(Baenas 등, 2016), 이들을 식물에 처리하면 마치 병원균의 공격을 받았을 때와 같이 식물이 비슷한 반응 을 보이는 것으로 알려져 병충해에 대해 저항성이 있는 식물 을 재배하는 방법으로 이용되고 있다(Kim과 Park, 2001).

하지만 최근에는 재배분야뿐만 아니라 식물 체내에 유용성 분을 증진시키기 위한 방안으로 salicylic acid, chitosan,

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Fig. 1. Germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment. IP, Ilpumbyeo; WB, Wolbaek; DD, Dodamssal; BOC, Baekogchal. H2O, germinated brown rice; IAA, indol acetic acid; SA, salicylic acid; H2O2, hydroperoxide.

sucrose, methionine, glutamic acid, NaCl, mannitol 등의 다양한 유도인자 처리에 관한 연구가 진행되고 있다(Bae- nas 등, 2016; Gao 등, 2015; Kim 등, 2006). 유도인자 처리 에 따른 스트레스 조건은 식물체의 산화-환원 항상성의 유 지를 방해하여 2차 대사산물의 축적을 증대시키며(Gawlik- Dziki 등, 2013), 이에 따라 대두(Mendoza-Sánchez 등, 2016), 강낭콩(Limón 등, 2014) 및 렌틸콩(Świeca 등, 2014) 등의 두류를 중심으로 다양한 유도인자 처리에 따른 항산화 성분 및 활성에 대한 연구가 보고되었다.

이와 같이 발아를 통해 품종별 현미의 유용성분 및 생리활 성을 증대시키는 연구와 2차 대사산물의 축적을 위해 두류 를 중심으로 유도인자 처리 공정이 이용되고 있지만, 다양한 한국산 품종별 현미의 유용성분 및 생리활성을 증대시키기 위한 발아 및 유도인자의 병행처리기술의 적용에 대한 연구 는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 유용성분의 함량 을 강화하기 위한 방안으로 indole acetic acid(IAA), salicylic acid(SA) 및 hydrogen peroxide(H₂O₂) 등의 유도인 자를 처리한 4품종의 현미를 48시간 동안 발아시킨 후 항산 화 성분과 효능을 분석하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 발아

본 연구에 사용한 현미 품종은 일품벼(O. sativa L, cv.

Ilpumbyeo, IP), 월백(cv. Wolbaek, WB), 도담쌀(cv. Do- damssal, DD) 및 백옥찰(cv. Baekogchal, BOC) 등 총 4종 으로 국립식량과학원 중부작물부(경기 수원) 시험용 포장에 서 재배, 수확한 벼를 제현기(Model SY88-TH, Ssangyong Ltd., Incheon, Korea)를 이용해 왕겨를 분리하여 현미를 실험재료로 사용하였다. 품종별 현미는 0.01% IAA, SA, H2O2 용액과 증류수(H2O)를 6시간 연속 살수 후 20분 간격 으로 1분씩 살수하고 48시간 동안 25°C에서 종자를 발아하 였으며(Fig. 1), 발아시키지 않은 현미를 대조구로 하였다.

유도인자 처리 및 발아를 실시한 현미는 동결 건조한 다음

분쇄하여 -20°C에서 보관하면서 시료로 사용하였다.

추출물 제조

시료 중에 함유된 유용성분을 추출하기 위해 메탄올 추출 물을 제조하였다. 메탄올 추출물은 각각 시료 중량 대비 20 배량의 80% 메탄올(v/v)을 첨가하여 상온에서 24시간 동안 교반 추출하고, 이 추출물을 Whatman No. 2(Whatman In- ternational Ltd., Maidstone, UK)로 여과한 다음 감압농축 및 동결 건조하여 -20°C에서 보관하였으며, dimethyl sulf- oxide(DMSO)에 100 mg/mL 농도로 용해한 후 증류수 또 는 배지로 희석하여 생리활성 측정용 시료로 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Dewanto 등(2002)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 정색으로 발색하는 것을 원리로 측정하였다. 각 추출물 100 μL에 2% Na₂CO₃ 용액 2 mL를 가한 후 3분 방치하여 50% Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다. 실온에서 30분 방치 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sig- ma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 5, 10, 25, 50배 로 희석하여 사용했으며, 검량선 작성 후 총 폴리페놀 함량은 시료 1 g 중의 mg gallic acid로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능은 ABTS cation decolorization assay 방법(Choi 등, 2006)에 의하여 측정하였다. 7.4 mM 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS, Sigma-Aldrich Co.)와 2.6 mM potassium per- sulfate를 하루 동안 암소에서 방치하여 ABTS 양이온을 형 성시킨 후 이용액을 735 nm에서 흡광도 값이 1.4가 되도록 몰 흡광계수(ε＝3.6×10⁴M^-1cm^-1)를 이용하여 증류수로 희석하였다. 희석된 ABTS 용액 1 mL에 추출액 50 μL를 가하여 흡광도의 변화를 정확히 60분 후에 측정하였으며,

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Table 1. Total polyphenol content of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment Cultivar / Elicitor Total polyphenol contents (mg GAE/g extract, dry basis)

Con H2O IAA SA H2O2

Ilpumbyeo Wolbaek Dodamssal Baekogchal

14.74±0.18^Dc 19.66±0.79^Ba 17.34±0.48^Bb 16.76±0.90^Bb

24.42±1.47Âab 21.79±1.30^Bb 26.88±2.02Âa 24.49±4.12Âab

26.44±0.62Âa 27.22±1.26Âa 26.75±1.47Âa 27.83±1.02Âa

17.27±1.53^Cc 21.62±1.15^Bb 25.57±1.01^Aa 26.61±0.96^Aa

20.68±2.07^Bb 21.32±0.97^Bb 25.16±0.86^Aa 24.02±0.51^Aa Con: raw brown rice, H2O: germinated brown rice, IAA: indol acetic acid, SA: salicylic acid, H2O2: hydroperoxide.

Value are mean±SD of 3 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (P<0.05) among different elicitor treatment. Different small letters in the same items indicate a significant difference (P<0.05) among different cultivar.

표준물질로서 L-ascorbic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사 용하였다. 시료첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 mg ascorbic acid equivalent(AAE)/g extract로 표현하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능 은 (Choi 등, 2006)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉 10 mg/mL 농도의 추출물 0.2 mL에 0.2 mM DPPH(Sigma- Aldrich Co.) 용액 0.8 mL를 가하여 실온에서 60분간 방치 한 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시 료첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 mg AAE/g extract 로 표현하였다.

세포배양 및 독성 측정

본 실험에서 사용된 인체유래 간암세포주(HepG2, Hu- man liver cancer cell)는 한국세포주은행(Seoul, Korea) 에서 분양받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bo- vine serum(FBS; HyClone, Logan, UT, USA)과 100 U/

mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin을 첨가한 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 5% CO₂, 37°C 배양기(EYELA, Vision Scientific Co., Daejeon, Ko- rea)에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 tryp- sin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다. 유품종 및 유도인자 처리별 발아현미 추출물의 세포독성은 Ishiyama 등(1996)의 방법에 따라 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay를 이용 하여 측정하였다. HepG2 cell을 2×10⁴ cell/well 농도로 96-well plate에 100 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 배양기 에서 24시간 배양하였다. 시료는 일정농도가 되도록 DMSO 로 희석하여 사용하였으며, 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정농도로 희석된 시료를 첨가하여 다시 24시간 배 양하였다. 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT 시약을 well 당 10 μL씩 첨가한 다음 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 배양 후 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고, DMSO 100 μL를 가한 다음 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader(ELx 808, Bio-Tek Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 세포독 성은 세포생존율로 표시하였고, Hep G2 cell에서 세포독성 을 나타내지 않는 농도에서 세포 내 활성산소종(reactive

oxygen species, ROS) 생성 억제 효과를 측정하였다.

ROS 생성 억제능 측정

ROS는 fluorescent probe DCFH-DA 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 5×10⁴cell/well의 농도로 96-well plate 에 100 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 품종 및 유도인자 처리별 발아현미 추출물은 100 μg/mL 농도로 FBS free DMEM 배지로 희석하여 사용 했으며, 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 희석된 시료 를 첨가하였다. 24시간 동안 시료를 전 처리한 후 250 μM DCFH-DA를 37°C에서 1시간 동안 각 well에 첨가하였다.

세포를 PBS로 세척한 후 1 mM tert-butyl hydroperoxide(TBHP)를 첨가하였다. 세포 간에 상응하는 ROS는 fluorescent spectrophotometer(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)로 120분 동안 여기파장(excitation wavelength) 485 nm와 방출파장(emission wavelength) 530 nm에서 fluorescent intensity를 측정하였다.

통계분석

통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고 품종 및 유도인자 처리 간의 차이 유무를 각각 one-way ANOVA(analysis of variance)로 분석한 후 신뢰구간 P<

0.05에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의 성을 검정하였다. 또한 상관분석은 총 폴리페놀, ABTS 라 디칼 소거능, ROS 생성량 간의 상관성을 이변량 상관계수를 이용하여 신뢰구간 P<0.01 및 P<0.05에서 분석하였다.

결과 및 고찰

총 폴리페놀 함량

품종 및 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 총 폴리 페놀 함량 변화를 분석한 결과는 Table 1과 같다. 유도인자 를 처리하지 않은 대조구는 일품벼, 월백, 도담쌀, 백옥찰 품종에서 발아 전 총 폴리페놀 함량이 각각 14.74, 19.66, 17.34, 16.76 mg GAE/g이었지만, 48시간 발아 후에는 24.42, 21.79, 26.88, 24.49 mg GAE/g으로 모든 품종이 발아에 의해 총 폴리페놀 함량이 증가하였다. 이러한 결과는

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Table 2. ABTS radical scavenging activity of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment Cultivar / Elicitor ABTS radical scavenging activity (mg AAE/g extract, dry basis)

Con H2O IAA SA H2O2

25.56±0.41^Cab 26.32±0.48^Ba 24.42±1.14^Cbc 23.80±0.15^Cc

26.73±0.70^Ba 25.54±0.48^Cb 27.17±0.16^Ba 26.52±0.35^Ba

30.30±0.19Âa 28.44±0.11Âb 28.65±0.14Âb 27.64±0.39Âc

22.00±0.24^Cc 25.09±0.45^Ca 25.61±0.62^Ca 23.98±0.62^Cb

25.90±0.99^BCb 25.75±0.41^BCb 27.51±0.24^Ba 26.65±0.52^Bab Con: raw brown rice, H2O: germinated brown rice, IAA: indol acetic acid, SA: salicylic acid, H2O2: hydroperoxide.

삼광, 큰눈, 고아미 4호, 단미, 현품 등 다양한 품종의 현미가 발아에 의해 총 폴리페놀 함량이 증가한다는 Lee 등(2016) 의 연구와 유사하였다. 일반적으로 종자를 발아시키면 세포 벽 가수분해효소와 폴리페놀 생합성 효소의 활성화에 따라 6′-O-feruloyl sucrose, 6′-O-sinapoyl sucrose, ferulic acid 및 sinapic acid와 같은 페놀성 화합물의 함량이 증가 하는 것으로 알려져 있다(Tian 등, 2005). 또한 유도인자 처리에 따른 발아현미의 총 폴리페놀 함량 분석 결과에서는 도담쌀 품종을 제외한 일품벼, 월백 및 백옥찰 품종이 유도 인자의 종류에 따라 유의적으로 차이를 나타내었다. 특히 IAA를 살수 처리한 일품벼, 월백, 백옥찰 발아현미 추출물의 총 폴리페놀 함량은 각각 26.44, 27.22, 27.83 mg/GAE g으 로 도담쌀을 제외하고 가장 높게 나타났으며, 이는 일반현미 및 발아현미 대비 각각 138~179% 및 108~125% 증가한 값이다. 하지만 SA와 H2O2를 살수 처리한 발아현미는 각각 17.27~26.61 mg GAE/g과 20.68~25.16 mg GAE/g으로 일반현미에 비해서는 유의적으로 증가하였지만(P<0.05), 발아현미에 비해서는 감소하는 경향을 보였다. 유도인자 처 리에 따른 발아종자의 총 폴리페놀 함량 변화에 대한 연구는 유도인자 종류에 따라 다양하게 보고되어 왔으며, methyl jasmonate(Kim 등, 2006), 자당(Guo 등, 2011), 만니톨 (Świeca, 2015), 포도당(Wei 등, 2011), 메티오닌(Pérez- Balibrea 등, 2011), 시트르산(Sritongtae 등, 2017), UV 조사(Li 등, 2013) 등의 유도인자 처리가 발아종자의 총 폴 리페놀 함량을 효과적으로 증가시킨다고 하였다. 유도인자 처리에 의한 발아종자의 총 폴리페놀 함량 변화는 식물체의 방어기작으로 유도된 페놀화합물의 신생합성 및 변환과 관 련이 있다(Jeong 등, 2018). 즉 일반적으로 페놀화합물은 오탄당인산경로(pentose phosphate pathway), 시킴산경 로(shikimate pathway), 페닐프로파노이드 경로(phenyl- propanoid pathway)를 통해 합성되는데(Crtea 등, 2011), 유도인자 처리가 L-페닐알라닌을 암모니아와 trans-cin- namic acid로 전환하여 페놀화합물 합성경로의 주요 인자 로 작용하는 phenylalanine ammonialyase의 발현을 증가 시키며(Jeong 등, 2018), 유기산과 같은 일부 유도인자는 세포벽의 구조적 변화를 통해 결합형 페놀화합물의 용출을 용이하게 하여 총 폴리페놀 함량을 증가시킨다고 보고하였 다(Randhir 등, 2009). 하지만 Duenas 등(2015) 및 Randhir

와 Shetty(2007)의 연구에 따르면 ascorbic acid, folic acid 와 같은 유도인자 처리에 의해서는 발아팥의 총 폴리페놀 함량이 감소하였고, 이는 리그닌 및 리그난과 같은 중합체를 합성하는 경로의 주요 인자인 guaiacol peroxidase 효소 발현과 관련이 있다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 유도 인자 종류에 따라서 발아현미의 총 폴리페놀 함량이 다르게 나타난 것은 식물체의 방어기작으로 유도된 페놀화합물의 신생합성 및 변환에 따른 결과로 판단되며, 그중 IAA 처리가 발아현미의 페놀화합물 축적에 가장 효과적이었고, ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능, ROS 억제능과 같은 항산화 활성에 영향을 줄 것으로 생각된다.

ABTS 라디칼 소거능

품종 및 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 변화를 분석한 결과는 Table 2와 같다. 유도 인자 처리를 하지 않은 대조구의 ABTS 라디칼 소거능은 일품벼, 월백, 도담쌀, 백옥찰 품종이 각각 25.56, 26.32, 24.42, 23.80 mg AAE/g extract였으며, 48시간 발아 후 각각 26.73, 25.54, 27.17, 26.52 mg AAE/g extract로 월 백 품종을 제외하고 발아에 의해 증가하는 경향을 보였다.

이러한 결과는 Lee 등(2016)의 연구에서 발아 시 폴리페놀 을 비롯한 비타민 E 및 γ-oryzanol 등의 항산화 성분이 증 가함에 따라 항산화 활성도 증가한다는 결과와 일치하였다.

또한 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 ABTS 라디 칼 소거능의 변화는 모든 품종에서 유도인자의 종류에 따라 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타났던 IAA를 살수 처리한 발아현미 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 일품벼, 월백, 도담쌀, 백옥찰 품종이 각각 30.30, 28.44, 28.65, 27.64 mg AAE/g extract로 항산화 활성 또한 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 총 폴리페놀 함량 변화와 유사한 경향이었으며, IAA 및 methyl jasmo- nate와 같은 식물호르몬 처리에 의해 발아종자의 총 항산화 력이 약 125% 이상 증가한다는 Lee 등(2013)의 연구 결과와 일치하여 IAA 처리에 의해 식물체의 방어기작으로 축적된 페놀화합물이 항산화 활성에 영향을 미친 것으로 판단된다.

DPPH 라디칼 소거능

품종 및 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 DPPH

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0 20 40 60 80 100 120 140 160

Ilpumbyeo Wolbaek Dodamssal Baekogchal Cultivar

Cell viability (%) .

Con H2OH2O IAA SA H2O2H2O2

Fig. 2. Cell viability (%) for HepG2 cell of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment. Con, raw brown rice; H2O, germinated brown rice; IAA, indol acetic acid; SA, salicylic acid; H2O2, hydroperoxide. Values are mean±SD of 3 replicates.

Table 3. DPPH radical scavenging activity of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment Cultivar / Elicitor DPPH radical scavenging activity (mg AAE/g extract, dry basis)

Con H2O IAA SA H2O2

2.93±0.10^Da 3.05±0.17^Ca 2.11±0.18^Db 2.26±0.18^Cb

5.39±0.54^Ba 5.31±0.33^Ba 5.71±0.09^BCa 4.58±0.13^Bb

6.87±0.16Âa 6.87±0.99Âa 5.83±0.15^Bab 5.87±0.13Âb

4.30±0.39^Cc 5.77±0.7ÂBb 7.38±0.48Âa 5.93±0.44Âb

4.65±0.40^Cab 5.16±0.45^Ba 5.23±0.24^Ca 4.18±0.36^Bb Con: raw brown rice, H2O: germinated brown rice, IAA: indol acetic acid, SA: salicylic acid, H2O2: hydroperoxide.

라디칼 소거능 변화를 분석한 결과는 Table 3과 같다. 유도 인자 처리를 하지 않은 대조구의 DPPH 라디칼 소거능은 일품벼, 월백, 도담쌀, 백옥찰 품종에서 각각 발아 전 2.93, 3.05, 2.11, 2.26 mg AAE/g extract였지만, 48시간 발아 후에는 5.39, 5.31, 5.71, 4.58 mg AAE/g extract로 모든 품종의 DPPH 라디칼 소거능이 발아에 의해 225~277% 범 위로 크게 증가하였다. 또한 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 분석 결과 모든 품종이 유도 인자의 종류에 따라 유의적으로 차이를 나타내었다. 그중 IAA를 살수 처리한 일품벼, 월백, 도담쌀, 백옥찰 발아현미 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 6.87, 6.87, 5.83, 5.87 mg AAE/g extract로 대조구인 발아현미 추출물(4.58

~5.71 mg AAE/g extract)에 비해 증가하는 경향을 보였 다. 또한 SA 처리구의 경우 일품벼를 제외하고 월백, 도담 쌀, 백옥찰 발아현미 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 각각 5.77, 7.38, 5.93 mg AAE/g extract로 유도인자 처리에 의해 증가하였다. 하지만 H₂O₂를 살수 처리한 발아현미는 4.18~5.23 mg AAE/g extract로 일반현미에 비해서는 유 의적으로 증가하였지만, 발아현미에 비해서는 감소하는 경 향을 보였다. 이러한 결과는 ABTS 라디칼 소거능에 대한 결과와 마찬가지로 발아 및 유도인자 처리 시 2차 대사산물 인 γ-oryzanol, 비타민 E 및 페놀화합물 등의 항산화 성분 의 생성이 증대되며, 이에 따라 DPPH에 의한 전자공여능이 증가하였을 것으로 판단된다. 또한 발아 전후 현미 에탄올 추출물의 라디칼 소거능을 살펴본 연구 결과에서도 일반현 미에 비해 발아현미의 DPPH 라디칼 소거능이 삼광, 큰눈, 미소미, 단미 및 현품 품종에서 유의적으로 증가하였다는 결과와 유사한 경향을 나타내었으며(Lee 등, 2016), 다양한 유도인자 처리를 한 발아종자 추출물의 항산화 활성에 대한 연구에서 발아 시 SA, ethephon, sodium hydroxide-ex- tracted mycelial polysaccharide를 살수 처리한 대두, 녹 두 및 메밀 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 일반발아종자 에 비해 유의적으로 높게 나타난다는 결과와도 유사한 경향 을 나타내었다(Mendoza-Sánchez 등, 2016; Liu 등, 2013;

Zhong 등, 2016).

세포 내 ROS 생성 억제능

ROS는 자유 라디칼 및¹O₂, O₂^-･, H₂O₂, ･OH 등 다양한 형태의 활성화된 산소로 생명체의 항상성 유지기작을 통해

조절된다(Halliwell과 Gutteridge, 1990). 하지만 노화 및 산화적 스트레스로 조절능이 불안정화되면 ROS의 양이 많 아져 세포막 지질의 산화, 세포 단백질의 변성 및 DNA의 손상을 유발하게 되며, 결국 노화의 촉진 및 각종 성인병을 발병시켜 인간의 수명을 단축시키는 것으로 잘 알려져 있다 (Aruoma, 1998). 그러므로 세포 내 ROS의 축적은 살아있 는 세포의 산화적 손상의 좋은 지표이다. 세포 내에서 산화 적 스트레스에 의해 발생하는 ROS 생성에 대한 품종 및 유 도인자 처리별 발아현미 추출물의 억제 활성을 알아보기 위 해 HepG2 세포에서의 독성과 TBHP로 산화 스트레스를 유 도한 후 DCFH-DA probe를 이용하여 ROS의 양에 따른 형광발생 정도를 측정하였다. 먼저 품종 및 유도인자 처리별 발아현미 추출물이 HepG2 세포의 증식 및 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 이용하여 세포생존율 을 측정한 결과(Fig. 2), 100 μg/mL 농도에서 세포생존율이 모두 90% 이상으로 측정됨에 따라 100 μg/mL의 농도에서 는 세포독성이 없음을 확인하여 간세포 이용 ROS 억제 활성 검정 실험을 진행하였다(Fig. 3). 실험 결과 TBHP 1 mM을 4시간 동안 처리하여 산화 스트레스를 유발한 세포에서는 정상세포에 비해 ROS의 생성이 증가하였지만, 품종 및 유도 인자 처리별 발아현미 추출물을 전처리한 세포에서는 ROS 생성이 억제되는 효과를 나타내었다. 특히 IAA 처리구의 발 아현미 추출물 처리 시 세포 내 ROS 생성 억제에 효과적인

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Table 4. Correlation coefficients among total polyphenol content (TPC), ABTS and DPPH radical scavenging activity, intracellular reactive oxygen species (ROS) level in tert-butyl hydroperoxide induced HepG2 cell of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment

Factor TPC ABTS DPPH ROS

TPC ABTS DPPH ROS

1 0.629^**

1

0.781^**

0.508^**

1

−0.495^**

−0.371^**

−0.431^**

1 Significant at ^**P<0.01.

Aab Aa

Aab Ab

Cbc BCab

BCc BCa Aa

Cab Cb

Ba

ABa ABa

ABa Aa

Aa

ACa

Bb

Aa

0 50 100 150 200 250 300

(-) (-)

(-) (+)

Ilpumbyeo (+)

Wolbaek (+)

Dodamssal (+)

Baekogchal (+) Cultivar

Cellular ROS level (%) . ^Con ^H2O ÎAA ^SA ^H2O2^H²Ô ^H²Ô²^***

Sample TBHP

Fig. 3. Effect of germinated brown rice depending on cultivar and elicitor treatment on the intracellular re- active oxygen (ROS) formation induced by tert-butyl hydroperoxide (TBHP). Con, raw brown rice; H2O, germinated brown rice; IAA, indol acetic acid; SA, salicylic acid; H2O2, hydroperoxide. Values are mean±

SD of 3 replicates. ^***P<0.001 significant difference compared to control. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (P<0.05) among different elicitor treatment. Different small letters in the same items indicate a significant difference (P<0.05) among different cultivar.

것을 확인했으며, HepG2 세포에 TBHP로 산화 스트레스를 유도했을 때 대조구 대비 ROS 생성량이 242.03%까지 증가 했지만, IAA 처리구의 추출물을 전처리한 세포에 TBHP를 처리한 결과 ROS 생성량이 억제되어 100 μg/mL의 농도에 서는 각각 176.45, 167.37, 149.56, 177.93%까지 감소하 는 경향을 보였다. 즉 모든 품종에서 IAA 처리구의 발아현미 추출물이 산화적 스트레스에 대한 세포 내 ROS 생성을 효과 적으로 억제하여 유도인자 처리에 따라 산화적 손상 예방 효과가 증가하였다. 이러한 결과는 H₂O₂로 산화적 스트레스 를 유도한 간세포 모델에서 일반현미에 비해 발아현미 추출 물이 세포 내 ROS를 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 지질과 산화의 지표물질인 malondialdehyde의 함량을 감소시킨다 는 Debnath 등(2013)의 연구 결과와 일치하였으며, 유도인 자 처리에 따른 발아메밀의 기능성분 및 항산화 활성에 관한 Jeong 등(2018)의 연구에서 sucrose 처리 시 발아메밀의 토 코페롤, β-카로틴 및 플라보노이드 함량이 증가하고 HepG2 세포에 TBHP로 산화 스트레스를 유도한 결과 농도 의존적 으로 ROS 생성을 억제한 연구 결과와 유사한 경향을 보였다.

따라서 본 연구에서도 유도인자 처리에 따른 스트레스 조건 은 발아 시 종자의 방어기작으로 페놀화합물을 비롯한 2차 대사산물의 축적이 증대하였으며, 이에 따라 산화 스트레스 에 의한 ROS 생성 억제에 활성을 나타낸 것으로 판단된다.

상관관계 분석

품종 및 유도인자 처리에 따른 발아현미 추출물의 총 폴리 페놀 함량, ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능, 간 세포 내 ROS 생성량 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 4와 같이 총 폴리페놀 및 라디칼 소거능이 유의적인 양의 상관관계를 나타내었고, 간세포 내 ROS의 생성량과는 유의 적인 음의 상관관계를 보였다. 즉 폴리페놀은 ABTS 라디칼 소거능(R=0.629), DPPH 라디칼 소거능(R=0.781)과 유의 적으로 높은 양의 상관관계를 나타내었으며(P<0.01), ROS 생성량(R=-0.495)과는 유의적으로 낮은 음의 상관관계를 나타내었다(P<0.01). 이는 유도인자 처리에 따른 메밀싹의 영양성분 및 생리활성에 관한 연구(Jeong 등, 2018)에서

sucrose 처리에 의해 메밀싹의 페놀화합물을 비롯한 유용 성분과 항산화 활성이 증가하여 상관관계 분석 결과 비타민 C, 비타민 E, 플라보노이드 함량과 라디칼 소거능, 환원력, 산화적 스트레스에 대한 세포보호 효과 및 ROS 생성 억제능 과 유의적으로 높은 양의 상관관계를 나타냈다는 연구 결과 와 일치하였다. 특히 ABTS 라디칼 소거능은 비타민 C(R=

0.955), 베타카로틴(R=0.726), 비타민 E(R=0.617~0.781), 플라보노이드(R=0.902~0.966)와 유의적으로 높은 양의 상 관관계를 나타내었으며, ROS 생성량은 비타민 C(R=-0.880), 베타카로틴(R=-0.746), 플라보노이드(R=-0.808~-0.900) 와 유의적으로 높은 음의 상관관계를 보인다고 보고하였다 (Jeong 등, 2018). 따라서 본 연구에서 IAA를 살수 처리한 발아현미 추출물의 항산화 활성이 높게 나타난 것은 총 폴리 페놀 함량 결과와 높은 양의 상관성이 있으며, 항산화 활성 을 나타내는 페놀화합물이 유도인자 처리에 의해 다량 축적 됨에 따른 결과라 판단된다.

요 약

본 연구에서는 발아현미의 유용성분 및 생리활성을 증진시 키기 위해 indole acetic acid(IAA), salicylic acid(SA) 및 hydrogen peroxide(H2O2) 등의 유도인자를 처리한 현미를 발아시킨 후 항산화 성분과 효능을 분석하였다. 품종은 일품 벼, 월백, 도담쌀 및 백옥찰 품종을 사용하였고, 품종별 현미

(7)

는 0.01% IAA, SA, H₂O₂ 용액과 증류수(H₂O)를 6시간 연 속 살수 후 20분 간격으로 1분씩 살수하고 48시간 동안 25°C에서 종자를 발아하였으며, 발아시키지 않은 현미를 대 조구로 하였다. 총 폴리페놀, ABTS 라디칼 소거능, DPPH 라디칼 소거능 모두 IAA를 살수 처리한 발아현미 추출물이 각각 26.44~27.83 mg GAE/g extract, 27.64~30.30 mg AAE/g extract, 5.83~6.87 mg AAE/g extract 범위로 모 든 품종에서 가장 높게 나타났다. 또한 HepG2 세포에 TBHP 로 산화 스트레스를 유도한 후 유도인자 처리별 발아현미 추출물의 ROS 생성 억제 효과를 분석한 결과 IAA 처리구의 발아현미 추출물 처리 시 세포 내 ROS 생성 억제에 가장 효과적인 것을 확인하였다. 이상의 연구 결과로부터 발아 및 유도인자 병행처리에 의해 현미의 페놀화합물 및 항산화 활성이 향상됨을 알 수 있었으며, 그중 IAA 처리가 발아현미 의 페놀화합물 축적에 가장 효과적이었고, ABTS 및 DPPH 라디칼 소거능, ROS 억제능과 같은 항산화 활성에도 긍정적 인 영향을 미친 것으로 생각된다. 이러한 결과는 발아와 유 도인자 처리를 적용하여 국내산 현미로부터 고부가가치의 기능성 식품 소재로 개발하기 위한 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 식량작물의 유 용소재 함량에 따른 생리활성 분석, 세부과제번호: PJ0119 63042020)의 지원에 의해 이루어진 것입니다.

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