황 후 을 확
벤 조 산 유 도 체 의 C h ro m iu m T rio x id e 독 성 에 대 한 세 포 재 생 효 과
한두석 . 최병남 • 이재숙* • 최화정** • 백승화***
원광대학교 처과대학 구강해부학교실 , * 광주여자대학교 머용과학과,
** 생명공학연구원 천연외학연구부, *** 원광대학교 한의학전문대학원 한약자원개발학과
(Received June 18, 2008; Revised A ugust 25, 2008)
T h e C ell Regenerative Effect of Benzoic Acid D erivatives Against Chom ium Trioxide-Induced Cytotoxicity
Du Seok Han, Byung Nam Choi, Jae Sug Lee*, Hwa Jung Choi** and Seung Hwa Baek***'*
Department of Oral Anatomy, School of Dentistry, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea
^Department of Beauty Science, Kwangju Wonmen's University, Kwangju 506-713, Korea
**Natural Medicine Research Centre, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Taejeon 305-333, Korea ''^Department of Herbal Resources, Professional School of Oriental Medicine, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea
A b s tr a c t — In o rd e r to evaluate the c y to to x ic ity o f ch ro m iu m trio x id e , and th e cell re g e n e ra tive e ffe ct o f p h e no lic acid against ch ro m iu m trio xid e -in d u ce d cyto to xicity, cell viability, ce ll adhesion activity, lactate dehydrogenase ( L D H ) activity, and m orphological changes o f cells w e re p e rfo rm e d in these cu ltu re s. T h e to x ic ity o f c h ro m iu m txioxide (IC50, 44.0 m-M) was high according to the to x ic c rite ria . C e ll reg e n e ratio n o f benzoic acid d e riva tive s against IC50 value o f c h ro m iu m trio x id e in cell m orp h o log y was increased in co ncentration-dependent manner. T hese re su lts suggest th a t benzoic acid d e riv a tiv e s m ay be used as a cell reg e n e rative agent against ch ro m iu m -m ed ia te d cyto to xicity.
K e y w o r d s □ in h ib ito ry effect, nickel-m ediated cyto to xicity, ce ll viability, ce ll adhesion a c tiv ty
중금속중크롬(chromium)은대부분자연계에 원자가 상태
(valence states)는6가크롬 (hexavalent chromium(VI)과 3가크 롬(trivalent chromium(III)으로존재한다. 특히 치과분야에서사 용하고있는니켈-크롬합금(nickel-chromium alloy)에는크롬함 량이회사제품에 따라약간다르기는하지만, 평균 18% 크롬을 함유하고있는것으로 알려져 있다.^"2^이들제품으로부터 유리 되는크롬(VI)& 증명된득소중하나이며, 돌연번이원(mutagen) 또는빌:암원 (carcinogen)으로작용하지만,^-® 아직크롬(VI)에의 한세포득성의기전에대하쉬는 확실히밝혀지지 않고있다. 그 동안의 연구에 의하면, 크롬(VI)은산화적 스트레스(oxidative stress), DNA손상, 세포고사(apoptotic cell death) 및변형된유 전자발현 (altered gene expression) 등을유발하는것으로보고 되고있다. ®그 러 나 크룸(III)은인슐린(insulin)작용에필수적
*본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 063-850-6225 (팩스) 063-841-4893 (E-mail) [email protected]
이며, 정상단백질, 지방및 탄수화물대사에 될요한 미량 무기 물로알려져 있다.^^•피이와 같어크롬(III)보다크롬(VI)이인체 에미처는득성효과가크기 때문에, 최근크롬 (VI)의 득성억제 에관한연구가이루어지고있다. Wise 등®은크롬(VI)은폐의 상피세포암종을 일으키는발암원이며 , 1 0 |iM sodium chromate 는모든세포를사멸시킬 정도로세포득성이 강하다고보고하였 다. 3-Hydroxybezoid add(3-HBA)는각종식물로부터분리되고 있 으 나 , 중 금 속 이온과의착물관계는연구되지 않고있으며, 반면에 3,4,5-trihydroxybenzoic acid(3,4,5-THBA)와 quercetin 는중금속이온과금속착물을형성하는것으로연구되고있다. Tannin gel은 pH 3의크롬(VI)용액에서크롬(VI)을흡수할수있 으며, quercetin-5'-sulfonic add sodium salt는급성 크롬(CrOj) 득성치료에효과가있는것으로밝혀지고있다/® 이에본연구 는페놀화합물의방향족고리구조에 결합된수산기의 수가중금 속이온에 대한세포득성에 어떠한영향을미처는가를알아보기 위한 목적으로, 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin를 선정하여
NIH3T3 섬유모세포에 적용한후, 세포생존율, 세포부착 저지능
362 최병남 ■ 이재숙 ■ 최화정 ■ 백승화
및 LDH 활성을측정하고, 세포I 과률보고하는바의다.
형태학적으로관칠허며그결
실험 방법
시약 및기기
세포배양에 사용한 minimum essential medium(MEM)과 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 및 fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin, fungizone Gibco/
BRL(Grand Island, NY, USA)사에서 구입하였으며, 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) 과 2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2//-tetrazolium-5- caboxanilide(XTT) 정량에사용한시약과 3-hydroxybenzoic acid (3-HBA), 3,4,5-txihydroxybenzoic acid(3,4,5-THBA)Sl- quercetin (Fig. 1)는 Sigma Chemical Co.(ST. Louis, MO, USA>''H1서구 입하였다.
세포의 배양은 COg 배앙기 (Vision Scientific Co., Bucheon, Korea.)룰 사용하였으며, 세포수의 계산은 Turk형혈구계산기 (Marienfeld Co., Mergentheim, Germany)를이용하였다. MTT 및 XTT 정량에는분광광도계 ELISA Reader(Spectra Max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를사용하였다.
세포배양
3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetin의정상세포에대한세포득성
을측정하기 위하쉬, 원광대학교의과대학해부학교실에서분앙 받은 NIH3T3 섬유모세포(NIH3T3)는 MEM배지에 10% fetal bovine serum, peniciUin(25 unit/m/) 및 fungizone-i：첨가하여 사용하였다. 세포의 배양은온도 37T, 습도 95%, 탄산가스농 도 5%의배양기률사용하였다. 실험을우1하여일차배양한 flask 의세포를 0.25% trypsin-EDTA로처리하여 세포룰분리한후, Turk형혈구계산기를이용®}여세포수가5X 10^ cells/mZ가되도 록세포부유액을만들었다.
M T T 정i!분석법
Mosmann의방법^®*에의하여 , NIH3T3 섬유모세포롤각배양 용기에 5X 1(/ cells/m/ 세포수를넣고 24시간배양루, chromium trioxide의세포득성과 3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetin의세포 득성을 죽정하기 위하여, chromium trioxide과 3-HBA, 3,4,5- THBA와 quercetin!- 각각농도별 (1, 25, 50 및 100 pM)로첨가 하고 48시간 배양하여, chromium trioxide IC50 농도의 세포득 성에대한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의세포재생효과를 측정하기 위하여, 24시간배양한 세포에 ICgo 농도와 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin을각각농도별로첨가하식 배양한후,
분석 당일조제한 MTT 50 ng/m/가포함된 배양액을첨가하고
3시간배양 후 배앙액을 버리고, dimethylsulfoxide(DMSO)를 2 m//well씩넣어 5분긴' 실온에방치하며 MTT formazan을' 용해 하고, 흡광도는분광광도계 ELISA reader로 MTT의흡광도률 측정하<5^대조군과비교조사하였다,
HO
H 0
3-Hvdroxvbenzoic acid 3,4,5-Trihydroxvbenzoic acid
OH
Fig.
Quercelin
- M olecular structu re s o f 3-hydroxybenzoic acid, 3,4,5- trihydroxybenzoic acid and quercetin.
X T T 정I f분석법
Laminin-coated plate는 laminin 1 mg을 PBS 2 m/에 용해하 여냉장고에 보관하면서, 될요시에 laminin의농도( 2 0 률 결정하여, 찬 PBS 용액으로 희석하고, 이용액을 24 well plate 의각 well에 200 m/씩분주하여 하뭇밤동안건조시킨후, PBS 로 2회세척하고 3% BSA률각 well에 200 pi씩첨가해잘흔들 어준다옴, 제거하고 PBS로 2회세척하였다. 배양된 NIH3T3 섬유모세포 5Xl(y* cells/m/ 세포수를 laminin으로 coating한배 양용기에 넣고 24시간배양한후, MTT 정량분석법과같은방 법으로 3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetinft- 넣고다시 48시간배 앙한후, 배지는조심스럽게 제거하고 PBS로 2회세척하였다. 여기에 XTT와흔합하여 MEN의최종농도 1- 25|JVIS. 한후, 각 well에 200 m/씩주입하고 4-6시간동안 배양한후, 450 nm에 서분광광도게 ELISA reader로흡광도룰측정하였다.
젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, L D H ) 측정방법 검체중의 젖산탈수소효소는 젖산을탈수소시켜 피루빈산을 생성하는 데, 이때 보효소 NAD는 환원되어 NADH로 되고, NADH는 1-methoxy PMS의 존재하에 NTB(nitrotetrazolium
Concentration (pM)
Fig. 2 - T he cytotoxic effect of ch ro m iu m trio xid e by the M T T and X T T m ethods against N IH 3 T 3 fibroblasts. T h e values represent the mean ± standard deviations fo r trip lica te experim ents. S ignificantly d iffe re n t from the co n tro l value:
*p < 0 .0 5 , **p < 0 .0 1 , * * * p < 0 .0 0 1 (Students' t-te st).
CrO；j에서부터 통계적유의성이 관찰되었다. 대조군에비해 1 [iM CrOg는 약21%정도의 세포득성이 나타났으며, 1 0 0 mM CrOa 에서는흡광도률 대조군 100%에대하여 9.62% 까지 감소시켰 으며 , 50 nM CrO：j와1 0 0 CrO；；의 세포득성의차이는 약
31% 정도로큰번화를관찰할수가 있었다. XTT 정량분석법으
로흡광도롤측정한결과에서도 대조군에 버하식 흡광도는농도 의존적으로감소시켰으며 , 25 mM CrOy에서부터통계적으로유의 한감소가 나타났으며 , 1 0 0 nM &0：/^1서는 대조군에 버하여 40.1%까지감소시켰으나, MTT 분석법에서 측정된 것에비하면 약 42배정도로낮은활성이 검색되었다. CrOg의 NIH3T3 섬유 모세포에 대한 ICjo 농도는 MTT 정량&석법과 XTT 정량분석법 에서 각각 44.0 mM과 69.5 nM 능도로측정되었으며 , MTT 정량 분석법에 의하던 세포득성의 활성이높게관찰되었다(Fig. 2).
N IH 3T3 섬유모세포에 대한 3 -H B A , 3,4,5-TH BA 및 quercetin의세포득성
MTT 정량분석법에으1한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의
NIH3T3 섬유모세포에대한세포 생존율은농도의존적으로흡
광도가미약하게감소하였으며 , 100 (JVI 3-HBA와 100 |XM 3,4,5- THBA에서통계적으로유의성이 관찰되었다(p<0.05). 3-HBA의 최소억제농도(692.45 nM)는다른방향족화합물보다득성이 높게 나타났으며, 3-HBA의 4,5번위처에 수산기률갖는 3,4,5-THBA 보다 약 1,4배 정도로 강한 세포득성이 관찰되었으며, BA는 quercetin의세포생존율보다약2 . 1배정도로강한활성이 관찰 되었다. 벤조산유도체의 세포생존율에 대한연구결과에 의하 면, 세포득성의 활성은벤조산의 수산기 위처와수에따라 생존 율의 번화가었으나, quercetin보다는 득성이 높게 관찰되었다. MTT 정량분석법에 의한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의 blue)를환원시켜디포르마잔을 생성하며, 이디포르마잔의 적색
을비색정량하는원리를 이용하여 LDH 활성을측정하였다.
MTT 정링분석방법과갈미 NIH3T3 섬유모세포직- 배양■§■기에 5X10** cells/m/ 세포수룰 넣고 24시간 배양후,'3-HBA, 3,4,5- THBA 및 quercetin 자체의세포득성을측정하기우1하여 , 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin을각각농도벌 (1, 25, 50 및 100 ^M) 로첨가하고, chromium trioxide에대한 세포재생효과를죽정 하기 위하여, chromium trioxide IC50 농도와 3-HBA, 3,4,5- THBA 및 quercetinl- 농도별로 첨가하육 48시간배양한후, 기 질액 0.5 m/와정색시약 0.5 섞은용액에혈청과증류수 0.05 m/룰 각각첨가한 희석반응정지액(Asan Co, Seoul, Korea)과 시약 blank률잘흔합하식 60분이내에 570 파고에서흡광도룰측 정하고상호비교하였다.
ICso 결정
3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetin의 ICjo 결정은 배양 중인 NIH3T3 섬유모세포률각배양용기당5X]# cells/m/씩넣고 24 시간 배양 후, 1, 25, 50, 10(HJV[의 3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetinl- 첨가하식 48시간배양한후, MTT 정량및 XTT 정
량을하여, 이둘각각에 대한 50% 억제농도인 ICgo을회귀방정 식2®에의해구하였다.
통계처러
실험결과의 통계처리는 Students' t-test를시행하였고, one way ANOVA 분석의결과와비교하였으며 , p-value가 0.05 미만
일경우유의한것으로관정하였다.
세포의 광학현미경적관찰
세포의 광학현미경적 관찰을 위하여 NIH3T3 섬유모세포는
각각세포분주후, 3-HBA, 3,4,5-THBA와 quercetin를처리하식 ,
MTT와 XTT률 처리하기 전에 도립위상차 현미경(Inverted
Microscope, Olympus, Tokyo, Japan)으로관찰하였다.
실험 결과
Chromium trioxide의 N IH 3T3 섬유모세포에 대한세포득성 니켈-크롬합금의 재료인크롬중신상에비교적득성이 강하 게나타나는것으로 알려진 chromium trioxide(CrO；j)률선정하 여, CrOg률정상세포인 NIH3T3 섬유모세포에 처리한후세포
생존율을측정하기 위하쉬, MTT 정링분석법과세포의 부착저
지능을측정하기 위하여, XTT 정링분석법을이용하식 흡광도률
측정하였다. CrO# NIH3T3 섬유모세포에 처리한후, MTT 정 링*석법으로흡광도롤측정한결과, Fig. 2에서보는바와같이, 대조군에버■§}여 농도의존적으로흡광도가감소하였으며, 1 nM
벤조산 유노체의 Chromium Trioxide 득성에 대한 세포 재생효과 363
0 0
{laaccKD
B
%>
W©L ri o qJo wq or - i
- ♦ — 3-H BA 3 ,4 ,5 - T H B A A Quercetin
-3-HBA -3,4,5-THBA -O 니ercetin
0 ICso 1 25 50 100
Concentration (pM)
F ig . 5 - The cell regenerative effect o f 3 -H B A , 3,4,5-TH BA and quercetin by the M T T m ethod against chrom ium trio xid e - induced cyto to xicity on N IH 3 T 3 fibroblasts. T he values represent the mean ± standard deviations for triplicate experim ents. Significantly d ifferent from the IC50 value:
*p < 0 .0 5 , ** p < 0 .0 1 (Students' t-te st).
0 1 25 50 100
Concentration (|jM )
F ig . 4 - T he cyto to xic effect o f 3 -H B A , 3,4,5-T H B A and quercetin by the X T T m ethod on N IH 3 T 3 fibroblasts. T he values represent the mean ± standard deviations fo r trip lica te experim ents. S ignificantly different from the controi value:
*p < 0 .0 5 (Students' t-te st).
364 한두석 • 최병남 • 이재숙 • 최희경 • 백승화
C o n c e n tra tio n (|jM )
F ig . 3 - T he cyto to xic effect o f 3 -H B A , 3,4,5-T H B A and quercetin by the M T T m ethod on N IH 3 T 3 fibroblasts. T he values represent the mean ± standard deviations fo r triplicate experim ents. Significantly d ifferent from the control value:
*p < 0 .0 5 (Students' t-test).
세포득성은 3-HBA>3A5*THBA>quercetin의감소순서로 활 성이 측정되었다(Fig. 3)2«
3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin롤 NIH3T3 섬유모 세포주 에처리한후 48시간이 지나면, XTT 흡광도가농도의존적으로
미약하게 감소함을관찰할수있었으며, 3-HBA에서만
통계적인유의성이 나타났다. Fig. 4의세포부착저지능을 XTT 정량분석법으로측정한결과에 의하면, 3-HBA의 NIH3T3 섬유 모 세포주에 대한 세포 부착 저지능(IC5o=943.3mM)은 3,4,5- THBA(IC5o=1,116.1 nM)보다약2.2배정도로 강한 활성이 관 찰되었으며 , quercetin에대한세포부착저지능(IC5o=2,410.8 |jM) 은 3-HBA에대한세포부착 저지능보다약 2.6배정도로 약한
민감성이관찰되었으며 , 3,4,5-THBA£LT；f e 세포민감성이약 2.2 배정도로약하게관찰되었다. 벤조산유도체의 최소억제농도에
대한 NIH3T3 섬유모세포주의 세포부착저지능은세포생존율
에서와같은민감성이 3-HBA>3,4,5-THBA>quercetin 순서로감 소되었다. 이러한벤조산유도체의 분자구조와세포의민감성관 계는방향족산에수산기의수와위치에따라활성관계가다르게 관찰되었다. 앞으로방향족산과 flavonoid의분자구조와세포부착 저지능관계에대한연구의될요성이요구된다고생각된다(Fig. 4).^«
Chromium trioxide의세£ 독성에대한 3 -H B A , 3,4,5-THBA 및 quercetin의세포재생효과
NIH3T3 섬유모세포에 미치는 chromium trioxide의세포득성 에대한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의세포생존율을측 정한결과에의하면, chromium trioxide의 ICgo 농도와세포생 존율은 농도의존적으로증가함을관찰할수 있었다. NIH3T3
섬유모세포주에 대한흡광도룰측정한값에 의하면, 3-HBA의
IC5 0값 [2.26 ±0.02(57%)]은 3,4,5-THBA의 ICgo값 [2.26 ±0.01 (59%)], quercetin의 ICgo값 [2.33±0.02(59%)]과유사한값을얻
게되었다. 3-HBA에대한통계적인유의성은관찰되지 않았으
며, 3,4,5-THBA는 quercetin보다낮은농도에서 통계적인 유의 성이 관찰되었다(pcO.Ol). NIH3T3 섬유모세포에 미치는 chromium txioxide의 세포득성은 3-HBA의 ICjo값에 대한 100 nM 3-HBA [2.50± 0.03(63%)]에 비교해보면, chromium trioxide득성에 대한 3-HBA의세포 재생효과는 약6% 정도로 관찰되었으나, 3,4,5-THBA의 ICgo값에 대한 100 mM 3,4,5- THBA [3.60± 0.03(94%)]는약 35% 정도로가장높은세포 재 생효과가 나타났으며, quercetin의 ICgg값에 대한 1 0 0 |iM
o o o o o o o o 2 1 0 9 8 7 6 5 {loJJUOOp%>8
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{lojluoo p % } ^ouroqjowc서ro
i i- ia
벤조산 유도체의 Chromium Trioxide 득성에 대한 세포 재생효파 365
-3-HBA -3,4,5-THBA - 0 니ercetin
3-HBA 3,4,5-THBA Quercetin
0 1C |Q,o 1 25 50 100
C o nce ntration (pM )
F ig . 6 - The cell regenerative effect of 3 -H B A , 3,4,5-T H B A and quercetin against chrom ium trioxide-induced cyto to xicity by the X T T m ethod on N IH 3 T 3 fibroblasts. T he values represent the mean ± standard deviations fo r triplicate experim ents. Significantly different from the IC^q value:
**p < 0 .0 1 (Students' t-test).
quercetin [3.55± 0.03(90%)]는 약 31% 정 도 로 세 포 재 생 효 과 가 측 정 되 었 다 . 이 와 같 은 chromium trioxide득성에 대 한 벤 조 산 유 도 체 의 세 포 재 생 효 과 에 대 한 세 포 생 존 율 은 3,4,5-THBA>
quercetin>3-HBA순 서 로 감 가 하 였 음 을 알 수 가 있 었 다(Fig.
NIH3T3 섬 유 모 세 포 에 미 치 는 chromium trioxide의 세 포 재 생효 2H I 대 한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의 세 포 부 착 저 지 능 을 측 정 한 결 과 에 의 하 면 , chromium trioxide의 IC50농 도 에 비 교 하 여 , 세 포 부 착 저 지 능 은 세 포 생 존 율 처 럼 농 도 의 존 성 이 약 하 게 증 가 함 을 알 수 있 었 다 . NIH3T3 섬 유 모 세 포 주 에 대 한 흡 광 도 룰 측 정 한 값에 의 하 면 , 3-HBA의 ICgo값 [1.99=0.17(50%)]
은 3,4,5-THBA의 ICgo값 [2.13= 0.09(54%)]와 quercetin의 ICgo 값 [2.04 = 0.02(52%)]의 값 과 유 사 한 흡 광 도 률 얻 게 되 었 다 . 50 3,4,5-THBA와 50 |jM quercetin에 대 한 통 계 적 인 유의성 (p<0.05)이 관 찰 되 었 으 나 , 3-HBA는 통 계 적 인 유 의 성 이 관 찰 되 지 않 았 다 . NIH3T3 섬 유 모 세 포 에 미 처 는 chromium trioxide의 세 포 부 착 저 지 능 은 3-HBA의 ICgo값 에 대 한 KMHiM 3-HBA [2.15±0.20(54%)]에 버 교 해 보 면 , chromium trioxide 득 성 에 대 한 3-HBA의 세 포 재생효 과 는 약 4% 정도 로 관 찰 되 었 으 나 , 3,4,5- THBA의 IC jo값에 대 한 100 mM 3,4,5-THBA [3.32± 0.14(84%)]
는 약 30 정 도 로 세 포 재 생 효 과 가 나 타 났 으 며 , quercetin의 ICgo 값에 대 한 100 |oM quercetin [3.22± 0.09(82%)]는 약 30 정 도 로 3,4,5-THBA의 세 포 재 생 효 과 와 같 은 활 성 이 측 정 되 었 다 . 이 와 같 은 chromium trioxide득 성 에 대 한 벤 조 산 유 도 체 의 세 포 재생 효 과 에 대 한 세 포 부 착 저 지 능 은 세 포 생 존 율 처 럼 3,4,5-THBA>
quercetin>3-HBA 순 서 로 감 소 하 였 옴 을 알 수 가 있 었 다 (Fig. 6).2»
0 ICso 1 25 50 100
Concentration (니M)
F ig . 7 - L D H a ctivity o f 3 -H B A , 3,4 ,5-T H B A and q uercetin against chrom ium trio xid e -in d u ce d cyto to x ic ity in N IH 3 T 3 fib ro blasts. T he values rep resent the mean ± standard devia
tio n s for trip lica te e xp e rim e nts. Significantly d iffe re n t from the IC50 value: *p < 0 .0 5 , * * p < 0 .0 1 (Students' t-te s t).
Chrom ium trioxide의세포독성에대한 3 -H B A , 3,4,5-TH B A 및 quercetin익 L D H 활성
Chromium trioxide의 NIH3T3 섬 유 모 세 포 에 대 한 세 포 막 의 파 괴 정 도 에 따 라 양이 결 정 되 는 LDH 활 성 도 를 측 정 하 였 으 나 , MTT 정 량 분 석 법 과 XTT 정 량 분 석 법 에 서 와 같 이 , chromium trioxide의 ICjo [0.068± 0.005(231)] 농 도 률 NIH3T3 섬 유 모 세 포 에 처 리 하 고 24시 간 이 지 난 후 , 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin는 농 도 벌 로 처 리 한 후 , 48시 간 째 에 LDH 활 성 도 를 측 정 한 결 과 , 모 든 화 합 물 은 chromium trioxide IC50농 도 처 리 군 에 대 하 여 , 1 tiM CrOj는 LDH 흡 광 도 률 증 가 시 켰지 만 , 25 |oM C r0 3 에 서 부 터 는 농 도 의 존 적 으 로 감 소 시 켰 다 . 3-HBA는 ICgo 농 도 에 대 하 여 , 농 도 증 7 H 따 라 큰 처"기가 없 었 으 나 , 3,4,5-THBA 는 IQ o 농 도 에 대 하 여 , 50 nM 와 100 |oM 3,4,5-THBA 차 이 는 약 63% 정 도 로 관 찰 되 었 으 며 , 100 pM 3,4,5-THBA의 [0.044±
0.006(151%)1& 3,4,5-THBA의 IC50값 [0.068± 0.001(235%)보 다 약 84% 정 도 로 가 장 높 은 L D H활 성 이 관 찰 되 었 다 . 100 |oM Quercetin의 [0.067：= 0.001(173%)]값 은 quercetin의 ICgo [0.093 + 0.002(239%)]값 보 다 약 6 6% 정 도 높 은 LDH 활 성 이 관 찰 되 었 다 . Chromium trioxide IC50농 도 처 러 에 의 한 LDH 활 성 도 에 대 한 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin의 활 성 도 감 소 는 3,4,5- TH BA>quercetin> 3-HBA 순 서 로 관 찰 되 었 으 므 로 , chromium trioxide에 의 한 세 포 막 손 상 에 대 한 억 제 효 과 는 3,4,5-THBA가 가 장 높 은 감 소 현 상 이 일 어 났 으 며 , 3-HBA가 chromium trioxide 에 의 한 세 포 막 손 상 에 대 한 억 제 효 과 는 가 장 낮 은 감 소 현 상 이 관 찰 되 었 다(Fig. 7).
세포의 광학현미경적 관찰
대 조 군 의 NIH3T3 섬 유 모 세 포 는 배 앙 24시 간 째 가 되 면 , 대 부
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366 한두석 • 최병남 • 이재숙 • 최화정 • 백승화
In ve rte d photom icrograph of N IH fibroblast cells treated w ith M T T fo r an additional 3 hrs a fte r incubation in unm odified m edium (control) fo r 2 days x 100. M o s t cells had abundant cyptoplaem and cytoplasm ic process.
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P h o to 2 - In ve rte d photom icrograph of N IH 3T3 fibroblasts treated w ith M T T fo r an additional 3 hrs a fter incubation in the IC50 value o f chrom ium trio xid e containing m edium fo r 2
days XlOO. M o s t cells were form ed cell cluster and num ber of cells were decreased.
분의 정상세포들과같이배양용기의 바닥에다수의 방추형 세포 들이딘중(monolayer)을: 이무어 번툼없이부착된다(Photo 1). 크 롬(VI)을농도벌로 처리하면, 능도의존적으* 세포밀도가감소 하식, 세포의크기는 원형으로번형되며, 일부세포는배양액내에 떠다니는부유세포 (floating cellXV- 나타났다. 크룸의 ICgo 농도롤 처리하면, Photo 2와같이 세포밀도의 감소, 세포크기와모앙의 번화및배양액내에세포부스러기둘이나타났다. 크롬 ICgo 농도 와 3-HBA,, 3,4,5-THBA와 quercetin를농도벌로동시에 처리하 면, 농도의존적으로세포의 재생현상즉세포수의증가와세포의 방추형으로번화가일어났다. 세포의 재생현상은 3,4,5-THBA와 quercetin이 3-HBA 보다 빠르게 진행되었으나, 3,4,5- THBA와 quercetin와51처서는크게 관찰되지 않았다(Photo 3과 4).
P h o to 3 - Inverted photom icrograph o f N IH 3 T3 fibroblasts treated w ith M T T fo r an additional 3 hrs a fte r incubation in the IC5Q value o f chrom ium trio xid e and 100 jiM 3 -H B A containing m edium for 2 days xlO O . M ost cells were regenerative and num ber o f cells were increased.
P h o to 4 - Inverted photom icrograph o f N IH 3T3 fibroblasts treated w ith M T T fo r an additional 3 hrs a fte r incubation in the IC5Q value of chrom ium trio xid e and 100 fiM 3,4,5-TH BA containing m edium for 2 days x 100. M ost cells were regenerative and num ber of cells were increased.
고 찰
본연구에서 CrOy의 NIH3T3 섬유모세포에대한 ICgo 농도 는 MTT와 XTT 정량에서 각각 44.0 ^lM파 69.5 mM.?. 측정되었 으며, 이결i'R：- Biedermonn파 Landolp피의 LDH 농도보다높 아세포득성이 낮게 관찰되었다. CrOy의 NIH3T3 선유모세포 주에대한 세포득성은고득성으로 판정할수있었으며, 정2«
의보고와 일치하였다. 3-HBA, 3,4,5-THBA 및 quercetin 자체 의 NIH3T3 섬유모세포에 대한세포득성은 Fig. 3, 4에서보는 바와같이, 농도 의존적으로 MTT 흡광도와 XTT 흡광도롤감 소시키나, 대조군에버하여 100 nM 3-HBA가통게적으로유의
