NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 26, No. 3, 2008…287 Spray-freeze-drying, micro emulsion 등은 단백질
입자를 제조하는 대표적인 방법들이다. 그러나 이러 한 방법들에 의하여 합성된 단백질 입자는 크기가 수 백 나노미터에서부터 수십 마이크로미터까지 다양하 여 그 크기의 조절이 매우 어렵다. 이에 North Carolina State University의 Kelly와 Desimone은 lithography 와 template 기법을 이용하여 인슐린과 알부민 같은 단백질 입자를 특정 크기와 모양으로 만드는 방법을 제시하였다. 그들은 크기, 모양, 조성, 표면기능 등을 독립적으로 조절할 수 있는 “smart particle” 제조법 을 PRINT(particle replication in non-wetting templates)라고 명명하였는데, PRINT 방법으로 합 성 고 분 자 (synthetic polymers)와 하 이 드 로 젤 (hydrogels), 활성제약성분(active pharmaceutical ingredient) 등을 포함하는 일정한 모양의 균일한 나 노 입자의 제조가 가능하다.
[그림 1]은 PRINT 기법을 이용하여 단백질 입자 를 성형(nano-molding)하는 과정을 나타낸다. 우선 photolithography를 이용하여 master template를 만 든다[그림 1(A)]. 그 다음에 PFPE(perfluoro- polyether)로 만들어진 불화탄소(fluorocarbon) mold 를 master template에 올린 후 curing 과정을 거치면 2µm, 5µm, 200µm의 구멍(cavity)이 생긴다[그림 1(B)]. 25wt%의 단백질 수용액을 PFPE mold와 mold보다 큰 표면 에너지를 갖는 countersheet(여기 에서는 polyethylene sheet를 사용) 사이에 놓는다 [그림 1(C)]. 이러한 샌드위치 구조물을 50psi의 롤러 (roller)에 넣어주면 PFPE mold는 롤러를 통과하지 만, 표면에너지가 높은 film은 벗겨지고 단백질 용액 이 각각의 구멍에 채워진다. 채워진 mold에 있는 물
을 제거하기 위해 밤새 응고시킨 후 냉동 건조시키면 [그림 1(D)] 단백질 입자는 mold를 지나는 미량의 극성 비용제(클로로포름)에 의해 운반되어 직접적으 로 수확이 가능하다[그림 1(E)]. 단백질 입자를 함유 한 PFPE mold 의 패턴면을 아래로 하여 액상의 수 확 필름 위에서 롤링하고[그림 1(F)] 수확 필름을 건
Nano-molding 기법을 이용한 일정한 모양의 균일한 단백질입자의 제조
그림 1. PRINT 기법을 이용한 단백질 입자의 성형 과정.
(A)mater template, (B)mater template에서 분리된 PFPE mold, (C) PFPE mold와 countersheet의 샌 드위치 구조, (D) 냉동 건조된 PFPE mold, (E) 유 리 슬라이드 위에 있는 수확필름, (F) 수확필름 위 를 굴러가는 PFPE mold, (G) 수확필름 위로 유리 된 입자들로부터 분리되는 PFPE mold, (H) 수확 필름의 분리 후 자유입자의 생성 모습.
288…NICE, 제26권 제3호, 2008
Multi-membrane Hydrogels
조 또는 중합시키면 채워진 mold가 단백질 입자를 수 확필름에 남기고 벗겨진다[그림 1(G)]. 마지막으로 수확필름을 분리 시키면 개개의 단백질 입자를 얻을 수 있다[그림 1(F)]. 이와 같은 PRINT 방법을 통하여 제조된 5µm의 알부민 입자의 형광사진이 [그림 2]다.
이와 같이 nano-molding에 의한 단백질 제조는 어 떠한 단백질도 특정한 모양의 균일한 입자로 간편하 고 빠르게 제조가 가능함을 제시한다. 현재는 이러한 접근법이 치료목적의 약을 운반하는 platform과 롤투 롤(roll-to-roll)제조 공정에 확대되어있다. 또한 다른 단백질과 호르몬, 항체, 그리고 효소들의 물리적 특성 에 관한 연구가 현재 진행되고 있으며, 머지않아 광범 위한 분야에 응용가능할 것이라 예상된다[J. Am.
Chem. Soc., Vol. 130, p. 5438(2008)].
화장품 가공, 음식, 약물전달, 조직공학에 이르기까 지 수많은 응용분야를 가진 다당류(polysaccharide) 는 하이드로젤(hydrogel)을 바탕으로 한다. 그러나 분자간 상호작용이 존재하는 고분자전해질 (polyelectrolyte)로부터 hydrogel을 형성하는 것은 복잡하다. 용매의 교환을 이용한 고분자 사슬(chain) 의 재편성은 hydrogel을 만드는 방법 중에서도 간단 하지만, 복잡한 메커니즘에 대한 이해 부족으로 인하 여 좀 더 복잡한 구조의 hydrogel 형성이 어려웠다.
이에 Université de Lyon의 Ladet 등은 물리·화학 적인 조건으로 ‘양파(onion) 모양’의 복잡한 hydrogel 구조를 조절할 수 있는 다단계 방해 젤공정(multi- step interrupted gelation process)을 제시하였다. 이 러한 접근은 복잡한 모양을 갖는 젤공정을 매우 간단 하게 만들며, multi-membrane 구조를 가능하게 한 다. 또한 소개된 기존의 방법과는 대조적으로 이 방법 은 membrane 사이의 자유공간을 형성하게 하여 세 포 또는 약의 도입을 가능케 한다.
그림 2. PRINT 방법을 통하여 제조된 5µm의 알부민 입자의 형광사진.
(A) Multi-membrane onion-like (B) physical hydrogel First
inter-membrane space
Second inter-membrane
space
그림 1. (A)‘양파(onion) 모양’의 multi-membrane 구조의 개략도, (B) 키토산으로 만든 multi-membrane 생체물질.
[그림 1]은 외부의 가교제(cross-linker)없이 양쪽 친매성(amphiphile) 고분자(키토산)를 사용하여 얻 어낸 물리적인 hydrogel의 모습이다. 키토산은 양쪽 친매성을 갖는 천연 공중합체이며, 구성요소인 아세 틸기와 탈아세틸기 잔유물의 비율은 친수성 (hydrophilic)과 소수성(hydrophobic)의 균형을 유지 하는데 중요한 역할을 한다.
[그림 2]는 고분자 알코올 gel의 중화 과정과 여기 서 파생된 multi-membrane 구조 생성 방법을 보여 준다. 중화가 일어나지 않은 알코올 gel을 중화 bath 에 넣으면[그림 2(A)] 중화 단계가 진행되는 동안 이온 사이의 반발이 사라지게 되고 알코올 gel의 수축 (contraction)과 chain의 축합(condensation)이 진행 되어[그림 2(B)] hydrogel이 생성된다[그림 2(C)].
그러나 분리된 gel membrane을 만들기 위해서는 알 코올 gel과 중화가 이루어지는 gel 사이에 polymer의
농도가 낮은 계면이 형성되어야 한다. 계면 용액과 붕 괴된 polymer chain은 수축된 중화 gel 속에서 중화 단계의 수축을 방해하여[그림 2(D)] 계면 용액 속의 잔류 polymer chain의 완전한 축합이 이뤄지면 membrane 사이의 공간이 형성된다. 마지막으로 multi-membrane 시스템을 유지하기 위해서 과량의 NaOH를 증류수로 씻어낸다[그림 2(E)]. 이와 같은 일련의 중화·방해 단계는 몇 번이고 반복해서 일어 난다[그림 2(F)]. 앞에서도 언급했듯이, 이러한 결과 는 중화되는 gel과 알코올 gel사이의 물/알코올 용액 의 형성, 계면상에 위치한 chain의 풀어짐, 중화되는 gel 속의 응축과 수축이 있었기에 가능하다.
이 연구는 잠재적으로 생물의학의 응용에 유용할 것이며, 3차원의 multi-membrane 관형 또는 구형 구 조를 설계하는데 있어 밝은 전망을 제시한다 [Nature, Vol. 452, p. 76(2008)].
NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 26, No. 3, 2008…289
Neutralization
Membrane formation
Alcohol gel
NaOH Water
Water/alcohol mixture
Alcohol gel
Neutralized gel with shrinking
Fully neutralized hydrogel with higher density (shrunk)
Alcohol gel dissolution
front Inter-membrane
space Neutralization
front
Interrupted neutralization
Chain condensation
Interphase solution Out of neutralization bath
First membrane Second membrane Third membrane Fully neutralized
gel
Alcohol gel In neutralization bath
Non-neutralized alcohol gel
NaOH 1 M solution
Filter paper or water
etc
Onion-like multi-membrane
architecture
(A) (B) (C)
(B)
(F)
(D) (E)
그림 2. 고분자 전해질 알코올 gel의 중화 과정과 여기서 파생된 multi-membrane 구조 생성의 개략도.
