281 책임저자：박건영, 609-735, 부산시 금정구 장전동 산 30
부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2839, Fax: 051-514-3138 E-mail: [email protected]
접수일：2007년 11월 2일, 게재승인일：2007년 12월 6일
Correspondence to：Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, San 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, South Korea Tel: +82-51-510-2839, Fax: +82-51-514-3138
E-mail: [email protected]
AGS 인체 위암세포를 이용한 서리태 콩알 메주의
in Vitro
항암효과1부산대학교 식품영양학과, 2경남정보대 식품과학계열
배명숙1ㆍ박순선1ㆍ문숙희2ㆍ박건영1
Increased in Vitro Anticancer Effects of Black Soybean (Seoritae) Meju on AGS Human Gastric Cancer Cells
Myung-Suk Bae1, Soon-Sun Bak1, Suk-Hee Moon2 and Kun-Young Park1
1Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735,
2Subdivision of Food Science, Kyungnam College of Information and Technology, Busan 616-701, Korea
Mejus were prepared with different black soybeans (BS) of var. Seoritae and Seomoctae. To check the anticancer effects of BS Mejus (BSM), MTT assay was performed in AGS human gastric adenocarcinoma cells. We found that the Seoritae and Seoritae-BSM significantly inhibited the growth of the AGS cells. The Seoritae-BS was separated into kernel and coat, and then these were cooked and fermented with the Asp. oryzae. The methanol extract of these samples was effectively inhibited the growth of the AGS cells. Especially black colored coat of Seoritae showed the highest effect on the AGS cells.
This anticancer activity was diminished by cooking process. However, the effect was dramatically recovered by fermentation step. (Cancer Prev Res 12, 281-286, 2007)
Key Words: Black soybean, Seoritae, Meju, Anticancer
서 론
콩에는 암을 비롯한 성인병을 예방하고 치유할 수 있 는 비 영양 성분으로, protease inhibitor, 레시틴, 콜린, 사 포닌, 이소플라본, 피틴산, 펩타이드, 올리고당, 안토시 아닌, 페놀화합물, 카로티노이드, β-sitosterol 등이 함유 되어 있는데, 이러한 유용성분들이 항암, 항산화, 정장작 용 및 항노화, 항고혈압 등의 기능성을 나타내고 있음이 여러 연구에서 보고되고 있다.1∼4) 검정콩은 콩이 가지는 영양적 기능 외에도 종피에 함유된 검은 색소로 인해 식 미감을 증대시키고 다양한 약효를 발휘하여 예부터 한 방에서 烏頭(오두)라 불리는 약콩으로, 허약체질, 무기력 증, 불안감의 해소와 각기병 예방, 약물 중독과 식중독
등에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 동의보감에 의 하면 검정콩의 종피가 혈액을 자양하고 풍을 소통시키 며, 시력 증진 및 뇌를 맑게 하고 두통치료에 효과가 있 다고 하였다. 검정콩 종실의 성분을 살펴보면 단백질이 약 40%, 지방이 20%, 당 함량이 10% 수준으로, 일반 노 란콩과 성분 면에서 큰 차이가 없고, 단지 종피색이 다를 뿐이다. 검정콩 종피에는 anthocyanin이라는 페놀성 물질 이 존재하며, 이는 적색, 자색, 청색을 나타내는 수용성 플라보노이드 색소로 인체에 아무런 부작용이 없고 항 산화 효과 등의 생리활성이 높은 것으로 알려져 있다.5∼
10) 또한 이소플라본 및 천연 토코페롤이 함유되어 있어 노란콩에 비하여 높은 항산화 효과가 있다고 보고되어 있다.11∼13)
된장의 원료가 되는 메주는 식물성 단백질이 주원료
인 콩을 삶아 발효시킨 것으로, 장의 품질을 좌우하는 중요한 역할을 한다. 메주의 제법으로 전통메주법과 개 량메주법이 있으나 현재에는 제조의 편의성과 잡균의 번식을 예방할 수 있어 장의 맛이 균일한 개량메주의 생 산이 증가하고 있다. 개량메주는 증자된 콩에 단일 균주 인 Asp. oryzae를 직접 접종시켜 단시일 내에 발효를 가능 하게 한다. 전통 장류의 생리활성 효과에 관한 연구는 이미 입증되어 있으며, 노란콩 된장은 항산화성과 항돌 연변이성을 가지고 있으며,14) in vivo 및 in vitro 실험에서 항암효과가 있다고 알려져 있다.15) 또한 검정콩으로 제 조한 개량식 메주와 된장이 노란콩 이용 제품에 비하여 높은 암예방 및 항암 효과가 있다고 보고되어 있다.16) 따라서 본 연구에서는 서리태 검정콩을 이용하여 개 량식 콩알 메주를 제조하여 콩 종류에 따른 메주의 발효 특성 및 기능성 차이를 알아보고자 하였다. 또한 콩을 부위별(콩, 종피, 종실)로 구분하여 메주로 만들었으며, 제조 과정 중에 항암 기능성이 어떠한 차이가 있는지에 대하여 알아보고자 AGS 인체위암세포를 이용하여 암세 포 성장 저해 효과를 관찰하였다.
재료 및 방법
1. 재료 및 종균
서리태(검정콩 대립종, 25 g/100 grains), 서목태(검정콩 소립종, 10 g/100 grains)와 대두(황금콩. 대립종, 25 g/100 grains)는 괴산군자농협(충남 괴산)에서 구입하여 콩알메 주의 제조에 이용하였으며 메주 발효에 사용한 Asp.
oryzae는 (주)충무발효(울산 울주군)에서 제공받아 사용하 였다. 콩의 종피와 종실은 수작업으로 분리하여 실험에 이용하였다.
2. 증자콩과 메주 제조
종균을 glucose 0.5%를 첨가한 NB 배지(Difco, nutrient broth : beef extract 0.3%, peptone 0.5%)에 접종하여 37oC에 서 24시간 배양한 후, 균체 농도를 조절(흡광도 600 nm=
0.8)하여 종균액으로 사용하였다. 대두를 정선 및 수세하 여 1.5배의 물(15oC)에 12시간 침지하고 물을 제거한 후, 비이커에 담아 고압멸균기(1.0∼1.5 kg/cm3)에서 60분 동 안 증자하여 50oC로 냉각하여 증자콩을 제조하였다. 증 자콩에 미생물을 대두 무게의 0.2%를 접종하여 30oC incubator에서 36시간 발효시킨 후 55oC에서 열풍건조하 여 콩알메주를 제조하였다. 콩을 부위별로 구분(종피와 종실)하여 위와 동일한 방법으로 각각의 메주를 제조하 였다.16)
3. 발효 특성
1) pH 및 산도: pH는 pH meter (model 410A, Thermo Orion, USA)를 이용하여 측정하였으며, 산도는 시료 1 g 을 증류수 20 ml에 희석하여 pH 8.3이 될 때까지 소요되 는 0.1 N-NaOH의 양(ml)으로 나타내었다.
Acidity (%)＝
ml of 0.1 N NaOH×0.1×dilution rate×0.09*
Weight of sample (g) ×100
*0.09: conversion factor
2) 총균수: 된장 1 g을 취하여 멸균생리식염수를 이용
한 10배 희석법으로 희석하고 plate count agar에 도말한 후 30oC에서 48시간 배양한 다음 나타난 colony를 계수하 여 호기성균수(CFU/ml)로 나타내었다.
3) 아미노태 질소, 암모니아태 질소측정: 아미노태 질소
(NH2-N)는 시료 2 g을 취하여 formol법17)으로 측정하였으 며, 암모니아태 질소(NH3-N)는 증류수를 가하여 시료의 5배로 희석, 진탕추출 후 여과지로 여과한 여액을 AM505-K (아산제약)에 의한 Indophenol법18)으로 측정하 였다.
4. in vitro 항암실험
1) 추출물의 제조: 시료를 동결건조한 후 마쇄하여 시
료에 20배(v/v) 의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하여 메탄올추출물을 얻었다.
이들 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO) 에 희석하여 실 험에 사용하였다.
2) 암세포 배양: 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell)는 한국 세포주 은행(서울의대)으로부 터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. 암세포는 100 units/ml의 penicilin-streptomycin(GIBCO, USA)과 10%
의 Fetal bovine serum (FBS)이 함유된 RPMI 1640배지를 사 용하여 37oC, 5%CO2 incubator (Forma, model 311 S/N29035, USA)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일 에 2∼3회 refeeding하고 6∼7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원 심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 ml cell culture flask에 10 ml씩 일정 수 분할하여 주입하고 6∼7일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
3) MTT Assay: 배양된 암세포는 96 well plate에 well당 1×104 개/ml가 되게 180μl씩 분주하고 시료를 일정농도 로 제조하여 20μl 첨가하여 37oC, 5% CO2배양기에서 72시
Table 1. The changes of pH, acidity and total viable counts in meju prepared with different kinds of soybeans
Total viable Sample pH Acidity (%) count
(CFU×107/ml) Seoritae1)-meju 7.9±0.00 0.40±0.07 2.8±0.0 Seomoctae2)-meju 7.9±0.01 0.47±0.03 2.8±0.0 Hwangkeumkong3)-meju 7.7±0.01 0.56±0.03 1.8±0.1
1)Seoritae; Large black soybean (25 g/100 grains)
2)Seomoctae; Small black soybean (10 g/100 grains)
3)Hwangkeumkong; Soybean (25 g/100 grains)
Fig. 1. The content of amino and ammonia type nitrogen in meju prepared with different kinds of soybeans.
1)Seoritae; Large black soybean meju
2)Seomoctae; Small black soybean meju
3)Hwangkeumkong; Soybean meju
a∼bMeans with the different letters on the bars are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수에 5 mg/ml의 농 도로 제조한 MTT(3-(4,5-dimethy lthiazol-2-yl)-2,5-diphe- nyltetrazolium bromide)용액 20μl를 첨가하여 동 배양조건 에서 4시간 더 배양하였다. 상등액 제거 후 각 well 당 DMSO 150μl를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.19,20)
5. 통계분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA 를 구한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 통계분 석하였다.
결과 및 고찰
1. 콩 종류별 콩알메주의 발효 특성
서리태 및 서목태 검정콩과 황금콩(대두)을 이용하여 제조한 콩알메주의 발효 특성을 비교하였다. 서리태, 서 목태 콩알 메주의 pH는 7.9로 비슷하였고, 황금콩은 pH 7.7로 검정콩에 비하여 낮았으며, 산도는 서리태(0.40), 서목태(0.47), 황금콩(0.56)의 순으로 나타났다. 총균수를 측정한 결과 서리태, 서목태, 황금콩이 각각 2.8×107, 2.8×107, 1.8×107 CFU/ml 으로 비슷하였다(Table 1). 콩알 메주의 NH2-N, NH3-N 함량을 측정한 결과, 된장의 발효 정도를 측정하는 유리 아미노산 성분인 아미노태질소는 서리태가 707.0 mg%, 서목태가 717.5 mg%로 검정콩이 황금콩(640.5 mg%)에 비하여 비교적 높은 함량을 보였 다. 암모니아태 질소는 서리태가 210.3μg/dl, 서목태가 259.6μg/dl, 황금콩이 216.3μg/dl로 나타났으며 서리태의 경우 메주 내 들어있는 아미노산의 함량을 나타내는 아 미노태는 높은 반면 발효과정에서 생성되는 냄새성분을 나타내는 암모니아태가 상대적으로 낮은 것을 알 수 있 었다(Fig. 1). 서목태와 황금콩의 경우 아미노태 질소와
암모니아태 질소의 함량은 발효가 진행됨에 따라 같은 경향으로 증가한다는 손14)의 연구 결과와 일치하였다.
따라서 전체적인 발효와 관련된 이화학 실험 결과 서리 태 콩알메주가 가장 우수한 것으로 나타났다.
2. 검정콩 콩알메주의 in vitro 항암효과
1) 콩 종류에 따른 콩의 암세포 성장 저해 효과: 콩 종류
를 달리한 콩알메주의 암세포 성장 저해 효과를 알아보 기에 앞서 메주의 원재료가 되는 콩의 항암효과를 알아 보았다. 서리태, 서목태, 대두(황금콩)의 메탄올추출물로 AGS 인체 위암세포를 이용하여 항암효과를 실시한 결 과, 첨가농도 1.0 mg/ml에서 서리태의 암세포 성장 저해 율이 87%로 유의적인 차이를 보이며 그 효과가 가장 높 게 나타난 반면, 서목태와 황금콩에서는 각각 7%, 10%
Table 3. Growth inhibitory effect of methanol extracts from different parts of raw and cooked black soybeans (seoritae) on AGS human gastric adenocarcinoma cells in MTT assay
Sample OD540 (AGS)
0.5 mg/ml 1.0 mg/ml Control 0.52±0.00NS, 1 0.51±0.01a Black soybean 0.49±0.01 (6)2 0.47±0.03c (7) Black soybean coat 0.40±0.02 (23) 0.15±0.01d (70) Black soybean kernel 0.49±0.01 (5) 0.49±0.01bc (5) Cooked black soybean 0.50±0.01 (4) 0.50±0.01ab (2) Cooked black soybean
0.51±0.02 (1) 0.51±0.01a (0) coat
Cooked black soybean
0.50±0.01 (3) 0.50±0.01a (1) kernel
1Values are mean±S.D.
2The values in parentheses are the inhibition rates (%).
a∼dMeans with the different letters in the same column are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
NSNot significant at p＜0.05.
Table 2. Growth inhibitory effect of methanol extracts from meju with different kinds of soybeans on AGS human gastric adenocarcinoma cells in MTT assay
Soybean meju OD540
0.5 mg/ml 1.0 mg/ml
Control 0.51±0.02a1 0.51±0.02a
Hwangkeumkong meju 0.50±0.01a (1)2 0.42±0.04b (17) Seoritae meju 0.28±0.04b (45) 0.07±0.01c (86) Seomoctae meju 0.43±0.04a (4) 0.43±0.04b (16)
1Values are mean±S.D.
2The values in parentheses are the inhibition rates (%).
a∼cMeans with the different letters in the same column are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Fig. 2. Growth inhibitory effect of methanol extracts from different kinds of soybeans (1.0 mg/ml) on AGS human gastric adenocarcinoma cells in MTT assay.
a∼dMeans with the different letters on the bars are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
로 낮게 나타났다(Fig. 2). 검정콩에는 대두의 항암물질로 보고되고 있는 isoflavonoids가 다량 함유하고 있는 점을 비롯하여 노란콩에 비하여 총페놀 함량과 anthocyanin, daidzein 및 genistein의 함량이 높기 때문으로 사료된 다.13,21)
2) 콩 종류에 따른 콩알메주의 암세포 성장 저해 효과:
서리태, 서목태, 황금콩으로 각각 메주를 제조하여 AGS 인체 위암세포를 이용하여 실험한 결과, 서리태 메주가 1.0 mg/ml에서 86%로 높은 암세포 성장 저해효과를 나 타낸 반면 서목태와 황금콩에서는 각각 16%, 17%로 서 리태 콩알메주에 비해 매우 낮은 암세포 성장 저해 효과 를 관찰할 수 있었다(Table 2). 이 실험의 결과로 서리태 검정콩으로 제조한 메주가 다른 콩이나 메주에 비하여 그 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 실 험에서 검정콩 콩알메주의 높은 항암성은 대두에 비하 여 많이 함유되어 있는 isoflavone 함량과 관계가 있을 것 으로 사료된다. Isoflavone에 속하는 genistein은 β-gluco- sides, 즉 당과 결합한 genistin 형태로 콩 속에 들어 있으 나22) 된장과 같은 콩 발효식품에는 genistein의 함량이 상 대적으로 높게 함유되어 있다.23) 또한 genistein은 estradiol 과 구조적으로 매우 유사하고 estrogen receptor에 약하게 결합하는 estrogen antagonist이며, free radical 형성, DNA 손상 및 carcinogenesis를 억제하는 강력한 항산화성 및 항 암성 효과를 가진다.24,25)
3) 콩과 증자콩의 부위별(콩, 종피, 종실)의 항암효과: 서
리태를 이용한 콩알메주를 제조한 후 항암활성을 알아 본 결과 암세포 성장 저해효과가 매우 우수하다는 것을
관찰할 수 있었다. 콩에서 메주가 만들어 지는 과정에서 의 항암효과를 알아보기 위하여 서리태를 생콩, 증자콩, 메주로 나누고 또한 각각의 전체콩과 종피, 종실로 분리 하여 AGS 인체 위암세포를 이용한 in vitro 항암효과를 비 교해 본 결과는 Table 3 및 Fig. 3에 나타난 바와 같다.
1.0 mg/ml 농도에서 콩과 종피, 종실에서는 각각 7%, 70%, 5%로 성장 저해효과를 보였으나 증자한 경우에는 같은 농도에서 각각 2%, 0%, 1%의 아주 낮은 저해율을 보였다. 이상의 결과로 볼 때 특히 검정콩의 종피는 항암 효과가 있었으며, 증자한 콩이나 종피, 종실에서는 아주
Fig. 3. Growth inhibitory effect of methanol extracts of meju from fermented Seoritae black soybean and Hwangkeumkong soybean parts (1.0 mg/ml) on AGS human gastric adeno- carcinoma cells in MTT assay.
a∼dMeans with the different letters on the bars are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
□ Con: Control
■ S: Soybean (Hwangkeumkong)
■ SC: Soybean coat (Hwangkeumkong)
■ SK: Soybean kernel (Hwangkeumkong)
■ BS: Black soybean (Seoritae)
■ BSC: Black soybean coat (Seoritae)
■ BSK: Black soybean kernel (Seoritae)
낮은 활성이 관찰되었다. 이는 검정콩 종피에 함유된 anthocyanin, 페놀성분, isoflavonoids가 강한 항암 활성을 나타내었으나, 증자 시 anthocyanin의 불안정한 성질로 인해 그 활성이 감소된 것으로 보인다.
4) 콩의 부위별(콩, 종피, 종실) 메주의 항암효과: 메주로
발효된 서리태 검정콩과 황금콩의 부위별 항암성을 알 아보기 위해 전체콩, 종피, 종실을 구분하여 각각 수침, 증자한 후 균을 접종하여 2일간 발효하고 1일간 건조 시 킨 후 각각의 활성을 관찰하였다(Fig. 3). 황금콩(노란콩) 의 경우 1.0 mg/ml에서 전체콩, 종피, 종실은 각각 7, 11, 13%의 낮은 효과를 보였다. 그러나 서리태(검정콩)의 경 우, 전체콩, 종피, 종실은 각각 10%, 83%, 11%의 저해율 을 나타내어 특히 종피의 효과가 가장 높은 것을 알 수 있었으며, 이것은 동일한 농도 내에서 황금콩 종피(11%) 의 암세포 성장 저해 효과에 비하여 현저히 높았다(p
＜0.05). 검정콩 증자 종피에 비하여 이로 제조한 메주의 효과가 큰 것은 메주로 발효, 건조 되는 과정에서 접종한 Asp. oryzae의 활성과 콩이 발효되면서 만들어지는 기능성 물질로 인하여 그 효과가 다시 증진된 것으로 사료된다.
Anthocyanin은 저온에서는 색이 유지되지만 저장온도가 높아짐에 따라 색소의 분해는 높아진다.26,27) 검정콩 색소 의 열안정성에 대한 기존에 연구에 따르면 다른 안토시
아닌 계열의 색소와 비교할 때 유사하거나 더 안정하다 고 보고되어져 있으나8) 연구범위가 0∼50oC로, 증자 조 건(121oC/15분)에서는 anthocyanin이 안정하지 못할 것으 로 생각된다. 특히 서리태 종피 메주가 황금콩 종피 메주 에 비하여 월등히 높은 항암효과를 나타내었으며 이는 검정콩 종피에 함유된 Isoflavone이 강한 항암효과를 나타 내기 때문으로 사료된다. 콩 속에 존재하는 Isoflavonoids 는 총 9종류가 발견되었으며, daizin, glysitin, genistin이고 이 각각에 acetylation과 malonylation된 물질이 있다. Malonyl glucosides는 열에 불안정하여 80oC에서 주로 daizin, gly- sitin, genistin으로 전환되지만 다른 물질들은 온도에서 안정하다.28) 그러나 그 외에 anthocyanin 관련 발효산물도 이와 관련이 있는 것으로 추정되어 발효산물과 관련된 계속적인 연구가 필요하다고 하겠다.
결 론
서리태, 서목태, 황금콩을 이용하여 제조한 메주의 발 효특성을 살펴본 결과 서리태의 pH, 산도, 아미노태는 서목태와 비슷하였으나 암모니아태질소의 경우 서리태 가 낮았으므로 서리태 검정 콩알메주가 가장 우수한 것 으로 나타났다. AGS 인체 위암세포를 이용한 실험에서 서리태 검정콩이 서목태나 황금콩에 비하여 높은 항암 효과를 보였으며 이를 이용하여 메주를 제조하여 실험 하였을 때도 비슷한 경향을 보이며 서리태 검정콩 콩알 메주의 효과가 가장 높았다. 이 실험을 바탕으로 서리태 검정콩, 종피, 종실을 이용하여 각각 증자 전 생콩, 증자 상태와 메주 상태에서 암세포 성장 저해 효과를 비교한 결과 생검정콩 종피의 효과는 높았으나 증자상태에서는 항암활성이 매우 낮았다. 하지만 이를 발효하여 메주로 제조한 서리태 검정콩 종피 메주에서는 항암 효과가 다 시 회복되었으며 반면에 황금콩의 종피로 제조한 메주 의 암세포 성장 억제 효과는 낮았다. 따라서 본 연구에서 서리태 검정콩 콩알메주의 항암 기능성은 종피에서 비 롯된 것임을 알 수 있었다. 그러나 증자 후 감소된 검정콩 종피의 활성이 발효 후 항암 활성이 어떠한 기작으로 다시 회복되었는지에 대한 계속된 연구가 필요하다.
감사의 글
본 연구는 과학기술부·한국과학재단 지정 대구대학교 지역혁신센터(RIC) 농산물 저장·가공 및 산업화 연구센 터의 지원에 의한 것으로 이에 감사드립니다.
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