284 책임저자：박건영, 609-735, 부산시 금정구 장전동 산30
부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2839, Fax: 051-514-3138 E-mail: [email protected]
접수일：2008년 10월 29일, 게재승인일：2008년 11월 7일
Correspondence to：Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: +82-51-510-2839, Fax: +82-51-514-3138 E-mail: [email protected]
HT-29 인체 대장암세포에서 키토산의 항암 효과
1부산대학교 식품영양학과, 2(주)금호화성, 3동주대학 외식조리제과계열, 4경남정보대학 식품과학계열
반영은1ㆍ박순선1ㆍ하종길2ㆍ김소희3ㆍ문숙희4ㆍ박건영1
Anticancer Effect of Chitosan in HT-29 Human Colon Cancer Cells
Young-Eun Bahn1, Soon-Sun Bak1, Jong-Kil Ha2, So-Hee Kim3, Suk-Hee Moon4 and Kun-Young Park1
1Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, 2KeumHo Chemical, Seoul 134-711,
3Department of Culinary Art & Baking Technology, Dongju College, Busan 603-715, 4Subdivision of Food Science, Kyungnam College of Information and Technology, Busan 616-701, Korea
Anticancer effects of soluble and non-soluble chitosans were studied in HT-29 human colon cancer cells. Soluble chitosan S-10 (SC) inhibited 88% of the proliferation at 5 mg/ml. Non-soluble chitosan NS-8 (NSC) showed 83% anticancer effects at 1 mg/ml on the growth of the HT-29 cells. SC and NSC inhibited the growth of cells in a time-dependent manner. Chitosans induced apoptosis in the HT-29 cells and it was associated with the increase of Bax, p53, p21 and decrease of Bcl-2. The level of cIAP-1 mRNA expression decreased in NSC. These results suggest that S-10 (DA 90%, vis 5 cps) and NS-8 (DA 95%, vis 22 cps) chitosans especially showed high anticancer effects in the colon cancer cells.
(Cancer Prev Res 13, 284-291, 2008)
Key Words: Soluble/non-soluble chitosan, Anticancer, Apoptosis
서 론
최근 우리나라 사람들은 불규칙한 생활습관과 서구화 된 식습관으로 인하여 질병 및 사망 원인이 변화되고 있 다. 이 중, 만성퇴행성 질환 및 암을 앓고 있는 인구가 급속히 증가되어 가고 있으며, 특히 대장암으로 인한 사 망률의 급속한 증가가 사회 문제로 대두되고 있다. 암 발생의 원인으로 약 75∼80%가 환경적 요인에 의한 것 으로 알려져 있으며, 이 중 약 30∼40%가 식이섭취의 문 제에서 기인된다고 한다.1∼4) 암 치료에 있어서 항암제 요법은 매우 큰 비중을 차지하고 있지만 항암제 자체의 비특이성 및 독성으로 인한 정상세포의 손상은 해결해 야 될 시급한 과제로 남아있으며 현재 이에 대한 연구가
지속적으로 행해지고 있다.5∼7) 항암제의 부정적인 측면 및 암예방에 대한 사고가 높아지면서 기능성 식품 및 암 을 예방할 수 있는 식품에 대한 관심이 높아지고 있다.
키토산은 키틴을 탈아세틸화 하여 만든 동물성 식이 섬유의 일종으로 게, 새우 등의 갑각류와 곤충류의 껍질, 조개 등의 패류 등 천연적으로 자연에 풍부하게 존재하 는 성분이다. 이 키틴질은 천연 고분자 중에서 자연계에 서 셀룰로오즈 다음으로 많이 존재하며 N-acetyl-D- glucosamine이 β-1,4 결합하고 있는 구조를 가지고 있기 때문에 인체 내에서는 소화 효소가 없어서 흡수되기 힘 들다.8) 키토산과 그 유도체는 독성이 낮고, 공해 생성이 적으며, 생분해성을 가지는 것으로 보고되어 있으며, 이 외에도 제산작용, 궤양억제작용, 혈청 콜레스테롤과 중 성지질량을 감소시키며, 장내 유용세균의 발육 촉진에
Table 1. Characteristic of chitosan used in this experiment
Chitosan Character Abbreviation Note
Soluble DA1 50%, vis2 1 cps S-1 DA 50%, vis 3 cps S-2
DA 50%, vis 5 cps S-3 Acetate DA 50%, vis 10 cps S-4 Acetate DA 70%, vis 1 cps S-5
DA 70%, vis 3 cps S-6
DA 70%, vis 5 cps S-7 Acetate DA 70%, vis 10 cps S-8 Acetate DA 90%, vis 1 cps S-9
DA 90%, vis 3 cps S-10
DA 90%, vis 5 cps S-11 Acetate DA 90%, vis 10 cps S-12 Acetate Non-soluble DA 53%, vis 8 cps NS-1 Insoluble
DA 60%, vis 45 cps NS-2
DA 56%, vis 70 cps NS-3 Insoluble DA 58%, vis 100 cps NS-4 Insoluble DA 77%, vis 55 cps NS-5
DA 74%, vis 65 cps NS-6 DA 76%, vis 150 cps NS-7 DA 95%, vis 22 cps NS-8 DA 100%, vis 8 cps NS-9 DA 90%, vis 60 cps NS-10 DA 96%, vis 80 cps NS-11
1DA (%): degree of deacethylation.
2vis (cps): viscosity.
영향을 미친다.9,10) 키토산은 대식세포를 활성화시키는 등의 면역 강화 및 조절, 식물병원성진균에 대한 식물의 저항성 유도가 있는 것으로 보고되어 있다. 또한 여러 종류의 암세포나 종양에 대하여 항암 효과가 있는 것으 로 알려져 있다.11∼15) 그러나 수용성 및 불용성 키토산이 apoptosis의 인자들에 어떠한 작용을 하는지에 대한 연구 는 미흡한 실정이다.
또한 다양한 식품에 키토산을 첨가하였을 때, 저장성 이나 기능성이 증가하는 것으로 나타났다.16∼19) 그러나 키토산의 탈아세틸화도와 점도에 따라서 특성 및 기능 성이 달라지므로 본 연구에서는 항암효과가 높은 키토 산을 선별하여 이를 식품산업에 응용하기 위한 연구의 일환으로, 탈아세틸화도 및 점도에 따른 여러 가지 키토 산의 효과를 비교 실험하였다.
키토산의 항암 기능성을 확인하기 위해 탈아세틸화도 및 점도가 다양한 키토산(수용성 12가지, 불용성 11가지) 의 암세포 성장 저해 정도를 확인하고, 그 항암 기전에 대하여 연구하였다. 이를 위하여 여러 가지 키토산의 특 성을 알아보고, HT-29 인체 대장암 세포를 이용하여 암 세포 성장저해효과를 알아보고 apoptotic body를 확인하 였으며, apoptosis 관련 유전자들의 발현 양상을 관찰하였 다.
재료 및 방법 1. 키토산 시료
본 실험에 사용된 chitosan은 탈아세틸화도(Degree of deacethylation, DA (%))와 점도(Viscosity, cps)가 다른 수용 성 chitosan 12종류(S-1∼12)와 불용성 chitosan 11종류 (NS-1∼11)이고, chitosan의 특성은 Table 1에 나타내었다.
키토산 시료는 (주)금호화성(경북, 영덕)에서 영덕산 게 껍질을 건조시키고 칼슘을 제거하여 만든 키틴을 고 온, 강알칼리의 조건하에서 탈아세틸화(DA)하여 제조하 였다. 탈아세틸화도는 건강기능식품공전 중 키토산 분 말 품질기준에 준하여 colloid 적정법으로 측정하였고,20) 점도는 0.5% 키토산을 0.5% 초산에 용해시켜 20oC에서 2시간 용해시켜 brookfield 점도계(USA)를 이용하여 측정 하였다.21) 분자량(Molecular weight)은 Size-Exclusion Chro- matography/Muti-Angle Laser Light Scattering (Wyatt DAWN DSP, POTILAB, Wyatt Techonology, USA)을 이용하여 측 정하였다.22) 이렇게 제조한 키토산 중 수용성 키토산 (S-10)은 PBS를 용매로 불용성 키토산(NS-8)은 1% 초산을 용매로 녹여 10 mg/ml 농도의 stock을 만들어 plastic tube (SPL, 경기도)에 넣어 4oC에서 보관하면서 사용하였다.
2. 키토산의 in vitro 항암효과 및 기작 연구
1) 암세포 배양: HT-29 인체 대장암 세포는 100 units/ml 의 penicillin-streptomycin과 10%의 Fetal bovine serum (FBS) 가 함유된 RPMI 1640 (GIBCO, USA)을 사용하여 37oC, 5% CO2 incubator (Forma, model 311 S/N29035, USA)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 refeeding하고 6∼7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% Trypsin- 0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고 루 분산되도록 잘 혼합하여 75 ml cell culture flask에 10 ml씩 일정 수 분할하여 주입하고 계속 6∼7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
2) MTT assay: 배양된 암세포를 96 well plate에 well당 2×104 cells/ml가 되도록 180μl씩 분주하고 시료를 일정 농도로 제조하여 20μl 첨가하여 37oC, 5% CO2배양기에 서 72시간 배양하였다. 여기에 5 mg/ml의 농도로 제조한
3-(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 용액 20μl를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동 안 더 배양하였다. 이때 생성된 formazan결정을 DMSO에 녹여서 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였 다.23,24)
3) Hematocytometer를 이용한 세포 성장률의 측정:
세포배양용 6 well plate를 이용하여 1×105 cells/ml의 농도 로 HT-29 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 키토산김치 시료를 48시간동안 처리하였다. 준비된 세 포를 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 수세한 후, trypan blue로 염색하였다. 이를 hematocytometer에 옮긴 후 위상차 현미경(×200) 하에서 살아있는 세포의 수를 측정하였다.25)
4) DAPI 염색을 통한 핵의 관찰: 시료의 처리에 의한 암
세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변 화 관찰을 위하여 시료가 처리된 세포들을 PBS로 수세 하고 3.7% paraformaldhyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 광학현미경(Olympus BX50, Japan) 을 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다.26) 5) Reverse transcription-polymerase chain re- action (RT-PCR) 분석: Trizol을 이용하여 total RNA를 분 리하였다. Oligo dT primer를 사용하면 분리한 RNA 중 mRNA가 모두 cDNA로 만들어지기 때문에 분리된 RNA 를 정량한 후, oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase 를 이용하여 2μg의 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사 시켰다. 이 cDNA를 template로 사용하여 Bax, Bcl-2, p53, p21, cIAP-1, cIAP-2 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하 였다. 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phos- phate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma, USA)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.27) 6) SDS-polyacrylamide gel 전기영동 및 Western
blot analysis: 정상 및 시료가 처리된 배지에서 자란 세
포들을 lysis buffer로 용해한 후, 고속원심분리로 세포 내 잔사물을 분리시킨 다음 동량의 단백질을 SDS-polyacryl- amide gel 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함 유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 electro- blotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 4oC에서 1시간 이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을
실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PBS- T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시 한 후 ECL (Enhanced ChemiLuminoesence) 용액을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하 였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnol- ogy Inc. (USA) 및 Calbiochem (Germany)에서 구입하였으 며, 이차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulin 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Corp. (USA)에서 구입하였 다.28)
3. 통계분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성 을 검정하기 위하여 분산분석(ANOVA)을 행한 후 p
＜0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였 으며, 그 결과는 평균(Mean)±표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 Statistic Analysis System (v9.1 SAS Institute Inc., NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 처리하였다.
결과 및 고찰 1. 암세포성장 저해 효과
세포에 대한 키토산의 독성을 검토한 결과(결과제시 안함), 수용성 및 불용성 키토산은 LLC-PK1 (porcine renal epithelial cell) 정상세포에 대하여 수용성 키토산은 5 mg/
ml의 첨가농도까지는 99% 이상의 높은 생존율을 나타내 었다. 불용성 키토산은 1 mg/ml까지는 95% 이상의 높은 생존율을 나타내어 이 농도에서는 독성을 나타내지 않 았으나, 이 보다 높은 농도에서는 LLC-PK1 정상세포에 대한 독성이 나타났으므로 세포에 영향을 주지 않는 농 도 범위 내(수용성 키토산은 5 mg/ml 농도 이하, 불용성 키토산은 1 mg/ml 농도 이하)에서 암세포 성장 억제 효 과를 관찰하였다.
수용성 및 불용성 키토산의 암세포 성장 저해효과를 HT-29 인체 대장암세포를 이용하여 알아보았다. 수용성 키토산의 경우, 5 mg/ml의 높은 농도에서 S-10 (DA 90%, vis 5 cps)이 88%의 가장 높은 항암효과를 보였으며, 불용 성 키토산은 NS-8 (DA 95%, vis 22 cps)과 NS-9 (DA 100%, vis 8 cps)가 각각 83%로 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타내었다(Fig. 1). 수용성 키토산은 탈아세틸화도가 90% 이상인 S-10의 효과가 가장 높았으며, 불용성 키토 산은 탈아세틸화도가 90% 이상이고 점도가 8∼22 cps로
Fig. 1. Inhibitory effect of various kinds of (A) soluble chitosan (5 mg/ml) and (B) non-soluble chitosan (1 mg/ml), on the growth of HT-29 human colon cancer cells in MTT assay. a∼fMeans with the different letters in the same column are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple test.
Fig. 2. Time-dependent growth inhibition by soluble (S-101) and non-soluble chitosan (NS-82) treatment in HT-29 human colon carcinoma cells. Cells were plated at 1×105 cells/60 mm plate, incubated for 24 hrs and treated with (A) 1 mg/ml (B) 2 mg/ml of chitosan for 48 hrs. The cells were trypsinized, wash with PBS and the viable cells were scored by hemocytometer counts.
Each point represents the mean±SD of three independent experiments. 1S-10: DA (degree of deacethylation) 90%, vis (viscosity) 3 cps, 2NS-8: DA 95%, vis 22 cps.
낮은 것이 효과가 좋았다. 본 실험에서 선택된 키토산의 분자량(Molecular weight: Mw)을 측정한 결과 S-10은 4,000
∼6,000, NS-8은 400,000∼600,000으로 나타나 불용성 키 토산의 분자량이 수용성에 비하여 매우 큰 것으로 나타 났다. 키토산 올리고당(3,000＜Mw＜5,000)이 대장암 세 포주에서 암세포의 성장을 억제한다는 선행연구는 본 실험의 수용성 키토산(S-10: 4,000＜Mw＜6,000)의 결과 와 비슷한 경향을 보였다.29) 또한 NS-8 (DA 95%, vis 22 cps)의 결과는 탈아세틸화도가 96% 이상이고 점도가 1.53 cps인 불용성 키토산이 혈액 종양세포에 대해서 효 과가 있다는 선행연구와 관련성이 있는 것으로 보인
다.30)
MTT assay 결과를 바탕으로 효과가 가장 높았던 S-10 과 NS-8을 이용하여 HT-29 인체 대장암 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 trypan blue 시약을 이용 하여 시간과 농도에 따라 살아있는 세포수를 측정하였 다(Fig. 2). (A)와 (B)를 비교해 보면 알 수 있듯이 키토산 의 첨가 농도가 높을수록 암 세포 증식 억제 효과가 높 고, 불용성 키토산보다는 수용성의 암세포 증식률 및 생 존율이 높은 것으로 보아 불용성 키토산의 효과가 더 높 은 것을 알 수 있었다. 이는 앞서 행한 MTT 실험과 비슷 한 경향을 보인다(Fig. 1). 특히, NS-8은 1 mg/ml의 농도로
Fig. 3. Induction of apoptosis by soluble (S-101) and non-soluble (NS-82) chitosan treatment in HT-29 human colon carcinoma cells. Cells were incubated with soluble and non-soluble chitosan (1 mg/ml) for 48 hr and then stained with DAPI. After 10 min incubation at room temperature, the cells were washed with PBS and photographed with a fluorescence microscope using blue filter. Magnification, ×400. 1S-10: DA (degree of deacethylation) 90%, vis (viscosity) 3 cps, 2NS-8: DA 95%, vis 22 cps.
Fig. 4. Induction of Bax and inhibition of Bcl-2 by chitosan treatment in HT-29 human colon carcinoma cells. (A) RT-PCR: HT-29 cells were incubated with chitosan for 48 hr, Total RNA was isolated using an RNA Zol B reagent and RT-PCR was performed using indicated primers. The amplified PCR products were run in an 1% agarose gel and visualized by EtBr staining. GAPDH was used as a house-keeping control gene. (B) Western blot: Lysed and cellular proteins were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the anti-Bcl-2 and anti-Bax antibodies.
Proteins were visualized using ECL detection system. β-actin was used as a house-keeping control gene. CON: control, SC:
soluble chitosan (S-10), NSC: non-soluble chitosan (NS-8).
처리한 군에서는 24시간 후에 거의 모든 대장암 세포의 성장이 저해되었다. 또한, 높은 농도(2 mg/ml)에서는 S-10 과 NS-8 처리군이 12시간 만에 거의 모든 HT-29 세포의 성장을 저해하였으며, 따라서 S-10과 NS-8은 대장암 세 포의 증식을 억제할 뿐만 아니라 사멸효과가 있는 것으 로 나타났다.
2. Apoptosis 유도 효과
암세포의 성장억제 기전으로 중요하게 연구되고 있는 분야는 apoptosis에 의한 암세포의 세포사멸 기전이다.30) Apoptosis는 세포막과 소기관의 변화와 함께 빠른 세포 축소가 일어나 세포막에 크고 작은 돌기가 많이 생긴 후
불규칙하게 변형되면서 많은 apoptotic body가 생성된 다.31) 수용성 키토산과 불용성 키토산의 암세포 증식 억 제는 apoptosis 유발의 결과로 추측되므로 키토산에 의한 apoptosis 가능성을 조사하였다. DAPI는 DNA에 강력하 게 결합하는 형광염료이고 cell membrane에 손상을 주지 않고 통과하므로 살아있는 cell과 고정된 cell 모두에서 사 용될 수 있으며, 신속하게 cell로 들어가 DNA와 결합한 다.32) 이러한 이유로 DAPI staining을 통한 암세포 핵의 형태적 특징을 관찰하였다(Fig. 3). 정상 배지에서 자란 HT-29 대장암세포(control)는 모두 정상적인 핵의 형태를 띠고 있었으나, 키토산이 함유된 배지에서 자란 세포의 핵은 전형적인 apoptosis가 유발되었을 경우 관찰되는
Fig. 5. Effect of chitosan on the expression of cIAP-1 and cIAP-2 mRNAs in HT-29 human colon carcinoma cells. Fol- lowing treatment with chitosan for 48 hrs, total RNAs were isolated and RT-PCR was performed using cIAP-1 and cIAP-2 primers. The amplified PCR products were run in agarose gel and visualized by EtBr staining. CON: control, SC: soluble chitosan (S-10), NSC: non-soluble chitosan (NS-8).
Fig. 6. Induction of p53 and p21 by chitosan treatment in HT-29 human colon carcinoma cells. (A) RT-PCR: HT-29 cells were incubated with chitosan for 48 hr, Total RNA was isolated using an RNA Zol B reagent and RT-PCR was performed using indicated primers. The amplified PCR products were run in an 1% agarose gel and visualized by EtBr staining. GAPDH was used as a house-keeping control gene. (B) Western blot: Lysed and cellular proteins were separated by SDS-polyacrylamide gels and transferred onto nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the anti-p53 and anti-p21 antibodies. Proteins were visualized using ECL detection system. β-actin was used as a house-keeping control gene. CON: control, SC: soluble chitosan (S-10), NSC: non-soluble chitosan (NS-8).
apoptotic body의 출현을 관찰할 수 있었다. 특히 NS-8을 처리한 군에서 S-10을 처리한 군보다 apoptotic body의 출 현이 잘 관찰되었으며 앞서 행한 암세포 성장 저해 효과 실험의 결과와 비슷한 경향을 보였다. 따라서 키토산에 의한 암세포 성장 억제 중 한 가지 기작은 apoptosis 유발 에 의한 것으로 사료되며, 불용성 키토산(NS-8)이 수용성 키토산(S-10)에 비해서 높은 효과를 보였다.
3. Bcl-2와 Bax mRNA, protein 발현
Apoptosis 과정에는 세포외 인자들이 signal로서 전달되 어 관련유전자들의 발현과 조절에 관여하는 것도 알려 지고 있으며 많은 단백질이 apoptosis 기전에 관련되어 있 다. 특히 Bcl-2, Bax 등의 유전자에 의해 발현된 단백질은 서로 상호 작용하여 apoptosis를 유도하는 자극에 대한 세 포의 민감 정도를 조절 한다. Bcl-2는 anti-apoptotic 분자 로서 apoptosis의 유발을 억제하고, Bax는 pro-apoptosis 분 자로서 apoptosis 유발과 관련이 있다. 이들 유전자는 mitochondria로부터의 cytochrome c를 유리시켜 종양억제 유전자인 p53, caspase, DNA 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성을 조절한다.33,34) 키토산에 의한 apoptosis가 이 들 유전자의 발현 조절과 연관이 있는지를 조사하였다 (Fig. 4). mRNA 발현의 경우, Bax의 발현이 대조군에 비하 여 키토산을 처리한 군에서 증가되는 것을 볼 수 있는 반면, Bcl-2는 큰 차이를 보이지 않았다. 하지만 Western blot을 이용하여 단백질을 비교해 본 결과, 대조군에 비 하여 키토산을 첨가하였을 때 Bcl-2의 발현이 현저히 감 소하는 것을 알 수 있었으며, 특히 불용성 키토산이 수용 성에 비하여 낮은 발현 정도를 보였다. 따라서 키토산은 이들 유전자의 발현을 조절하여 apoptosis를 유도하여 암 세포의 증식을 억제한 것으로 나타났으며, 특히 수용성
키토산보다 불용성키토산이 효과가 높았다.
4. cIAP-1와 cIAP-2 mRNA 발현
IAP (inhibitor of apoptosis proteins) family는 apoptosis 유발 에 핵심적인 역할을 하는 caspase와 직접 결합하여 이들 의 활성을 억제한다.35) 따라서 키토산에 의한 인체 대장 암세포의 apoptosis 유발과 연관된 IAPs의 관련 여부를 조 사하였다(Fig. 5). IAP family 중 cIAP-2의 경우 대조군에 비하여 키토산에서 전사 수준의 유의적인 발현의 차이 를 관찰할 수 있었으나 수용성과 불용성간의 차이는 없 었다. cIAP-1의 경우, 대조군에 비하여 키토산에서 mRNA의 발현이 유의적으로 감소되었으며 특히 불용성 키토산의 발현 정도가 수용성에 비하여 현저히 감소하 였다. 따라서 키토산에 의한 cIAP-1의 발현 저하는 caspase의 활성화에 영향을 미쳐 apoptosis에 연관성이 있
는 것으로 생각되며, 이에 대한 지속적인 연구가 요구된 다.
5. p53와 p21 mRNA, protein 발현
키토산에 의한 암세포의 증식억제가 Cdk (cyclin depen- dent kinase) inhibitor의 발현과 상관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 현재까지 알려진 Cdk inhibitor 중 많은 연구가 이루어져있는 p21과 세포증식 조절에 중요한 조 절인자에 해당하는 종양억제인자인 p53의 발현에 미치 는 키토산의 영향을 Western blotting 및 RT-PCR법으로 조사하였다(Fig. 6). mRNA와 단백질 발현 모두에서 대조 군에 비하여 p53이 유의적으로 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, 특히 불용성 키토산(NS-8)이 수용성(S-10)에 비 하여 현저하게 증가하였다. p21의 경우, 수용성 키토산 의 mRNA 발현이 불용성에 비하여 높은데 반하여, 단백 질의 발현정도는 서로 비슷하였다. 이 실험의 결과로 키 토산 처리에 의한 대장암 세포의 증식 억제는 p53 및 p21의 유전자가 관여하는 것을 확인할 수 있었다. 최근 의 연구에서 p21은 세포주기 상 G1 기의 조절뿐만 아니 라 G2/M 기를 포함한 세포주기 전반에 걸친 조절자로 서, 세포증식과 분화, 노화 등에 관여하는 중요한 조절인 자로 인식되어져 오고 있다.36∼39)
결 론
키토산의 항암 기능성의 차이를 확인하기 위해 탈아 세틸화도 및 점도가 다양한 키토산(수용성 12가지, 불용 성 11가지)의 암세포 성장 저해 정도를 확인하고, 그 중 가장 효과가 높은 키토산의 항암 기전을 밝히고자 하였 다. 키토산의 암세포 성장 저해효과를 HT-29 인체 대장 암세포를 이용하여 알아본 결과, S-10 (수용성 키토산, DA 90%, vis 5 cps, Mw: 4,000∼6,000)과 NS-8 (DA 95%, vis 22 cps, Mw: 400,000∼600,000, 불용성 키토산)의 효과 가 높았다. 수용성 및 불용성 키토산 중 항암 기능성이 높은 것은 탈아세틸화도가 90% 이상인 것으로 특히 불 용성 키토산은 점도가 8∼22 cps로 낮은 것이 효과가 좋 았다. DAPI 염색을 통하여 키토산에 의한 암세포의 apoptotic body 출현을 관찰할 수 있었으며, anti-apoptotic 분자인 Bcl-2와 caspase와 결합하여 apoptosis를 저해하는 인자인 cIAP-1 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다. 특히 NS-8에 의해 Bcl-2와 cIAP-1의 발현이 현저히 감소하였 다. 또한 키토산 처리에 의해 종양억제 인자인 p53이 증 가되었으며, 특히 NS-8에 의해서 현저하게 증가하였다.
따라서 키토산은 apoptosis 관련인자인 Bcl-2와 Bax 및
cIAP-1의 발현과 cell cycle에 관여하는 p53, p21을 조절하 여 암세포의 생존 및 증식을 저해시킨 것으로 사료된다.
감사의 글
이 논문은 부산대학교 자유과제 학술연구비(2년)에 의 하여 연구되었으며 이에 감사드립니다.
참 고 문 헌
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