120 책임저자：박건영, 609-735, 부산시 금정구 장전동 30
부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2839, Fax: 051-514-3138 E-mail: [email protected]
접수일：2007년 5월 28일, 게재승인일：2007년 6월 11일
Correspondence to：Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30, Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: +82-51-510-2839, Fax: +82-51-514-3138 E-mail: [email protected]
Bacillus subtilis
로 제조한 검정콩 청국장의 항돌연변이 및in Vitro
항암활성 증진효과부산대학교 식품영양학과 임채민ㆍ박순선ㆍ박건영
Increased Antimutagenic and in Vitro Anticancer Effects of Black Soybean (Seoritae) Chungkukjang Fermented by Bacillus subtilis
Che-Min Im, Soon-Sun Bak and Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, Pusan National University, Busan 609-735, Korea
Black soybean (Seoritae) chungkukjang was fermented with different kind of starters (Bacillus subtilis KCCM 11315, Bacillus licheniformis CN-115 and Bacillus megaterium SMY-212). Antimutagenic and in vitro anticancer effects of the black soybean chungkukjangs were studied by Ames test using Salmonella enterica serovar Typhimurium TA100 and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay on AGS human gastric adenocarcinoma cells and HT-29 human colon adenocarcinoma cells, respectively. The NH2-N and NH3-N contents in the black soybean chungkukjang fermented with Bacillus subtilis (BS-C) were similar levels in the soybean chungkukjang fermented with Bacillus licheniformis (BL-C). Methanol extracts from the black soybean chungkukjangs showed higher antimutagenicities against aflatoxin B1 (AFB1) and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG). At the 2.5 mg/plate concentration, the BS-C exhibited 79% antimutagenicity against AFB1, while the black soybean chung- kukjang fermented with Bacillus megaterium (BM-C) revealed 33% antimutagenicity. The BS-C and BL-C also increased antimutagenic effect against MNNG than BM-C. The BS-C and BL-C showed higher inhibitory effects on the growth of AGS human gastric adenocarcinoma cells than the BM-C at the same concentration. And the BS-C exhibited the highest inhibitory effects (76%) on the growth of HT-29 human colon adenocarcinoma cells among the fermented chungkukjangs (p＜0.05). In this study, black soybean chungkukjang fermented with different kind of starters exerted differently on the antimutagenic and anticancer activities of the chungkukjangs. B. subtilis-fermented chungkukjang showed the highest chemo- preventive effect compared to the chungkukjangs with other starters. (Cancer Prev Res 12, 120-127, 2007) Key Words: Bacillus subtilis, Black soybean, Chungkukjang, Antimutagenicity, Anticancer
서 론
청국장은 우리나라의 대표적인 단기간 콩 발효식품으 로, 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄 사이에 각 가정에서 제조, 이용하여 왔으며, 청국장은 각 지방
또는 가정마다 제조방법이 일정하지 않아, 그 품질은 콩 의 종류와 볏집에 부착된 고초균의 종류 및 발효조건 등 에 따라 다르게 된다.1) 청국장은 원료콩 자체 성분보다 필수아미노산, 비타민 B1, B2, 나이아신, 판토텐산의 함량 이 높으며, 된장보다 콩단백질과 지방질 함량이 높을 뿐 만 아니라, 칼슘의 중요한 공급원이다.2,3) 청국장에는 콩
으로부터 유래된 각종 생리활성물질(isoflavones, phytic acid, saponin, trypsin inhibitor, tocopherol, 불포화지방산, 식 이섬유, 올리고당)과 항산화물질 및 혈전용해 효소를 다 량 함유하고 있어서 고혈압방지 효과, 혈중 콜레스테롤 저하능, 항돌연변이성, 항암성, 항산화성, 혈전용해능 등 이 있다. 또한 청국장은 발효 과정 중에 생성되는 효소의 작용으로 섬유소 및 세포 내의 당질, 단백질을 분해하여 소화율의 향상과 변비개선효과가 있으며, Bacillus sp.은 발 암물질이나 ammonia, indole 등을 흡착, 배설시키는 작용 을 한다고 알려져 있다.2,4∼8)
청국장 제조에 따른 선행연구로는 발효과정 중 질소 화합물과 일반성분의 변화, 균주에 따른 성분 변화,10,11) 지질 성분과12) 향기 성분의 변화,13) 물성의 변환,14) 점질 물 생산15)이 보고되어 있다. 청국장 제조에 마늘, 쑥, 고 추, 고추기름 등의 첨가와 균주를 달리한 청국장의 품질 및 기호성 증진에 관한 연구보고와 청국장의 제조방법 과 이용실태에 관한 조사보고가 있다.16∼21) 또한 청국장 의 발효를 증강시키고 기능성을 강화하기 위하여 다양 한 Bacillus 속 균주19,22,23)와 고초균24,25)을 증자대두에 첨가 시켜 제조한 청국장의 품질 특성에 관한 연구들이 있다.
청국장의 원료로 이용되는 여러 가지 콩 중에서 검정 콩은 민간에서 약콩이라 전해 내려오고 있다.26) 검정콩 에는 검정색의 안토시아닌이 있으며 특히 isoflavone인 genistein은 유해한 활성산소종을 제거하고,27∼29) 암세포 가 면역시스템에 의한 공격을 피해 살아남을 수 있게 도 와주는 heat shock protein (HSP), glucose-related protein (GRPs) 등의 단백질의 생성을 저해하여 유방암, 전립선 암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.30,31)
검정콩 청국장은 대두 청국장에 비해 isoflavone 함량과 돌연변이 억제 효과가 현저히 높다고 알려져 있으나,32) 검정콩은 대두에 비하여 종피가 두껍고 육질이 견고하 므로 팽윤도와 콩단백질의 분해율이 낮고, 검정콩의 종 피에는 항균성 물질이 존재하므로 발효율이 대두에 비 하여 낮으므로 이를 보완하고자 손 등33)은 검정콩을 주 재료로 이용하여 청국장 발효에 적합한 균종을 분리하 였다.
이에 본 연구에서는 균주의 종류를 달리하여 제조된 검정콩 청국장의 항돌연변이 효과 및 암세포 성장 저해 효과를 비교하여 검정콩 청국장의 암예방, 항암 기능성 에 사용 균주의 종류가 미치는 영향을 검토하고자 하였 다.
재료 및 방법
1. 원료콩 및 청국장의 제조
1) 원료 및 균주와 배양: 실험에 사용된 검정콩은 대립 (25 g/100립: 서리태)콩으로 속은 초록색이며, 충남 괴산 군자농협에서 구입하여 사용하였다. 공시균주는 Bacillus subtilis KCCM 11315 (B. subtilis)25)로 한국 미생물 보존센터 에서 분양받아 사용하였으며 메주에서 분리한 Bacillus licheniformis CN-115 (B. licheniformis),34)와 Bacillus megaterium SMY-212 (B. megaterium)33)는 순천대학교 식품영양학과에 서 제공받아 사용하였다. 균은 glucose 0.5%를 첨가한 NB 배지(Difco, nutrient broth: beef extract 0.3%, peptone 0.5%) 에 균을 각각 접종하여 37oC에서 24시간 배양한 후, 균체 농도를 조절(흡광도 600 nm=0.8)하여 종균액으로 사용 하였다.
2) 청국장의 제조 및 종균의 종류: 검정콩을 정선 및 수 세하여 1.5배의 물(15oC)에 12시간 침지한 후 Erlenmeyer flask에 담아 고압 멸균기(1.0∼1.5 kg/cm2)에서 60분 동안 증자하여 50oC로 냉각하였다. 증자한 검정콩을 침지, 증 자 후에 50oC로 냉각하여 균의 종류를 달리한 전배양한 종균액을 원료의 1% (v/w)를 접종하고 40oC incubator에서 72시간 발효시켰다.
3) 추출물의 제조: 발효가 끝난 청국장 시료를 동결건 조한 후 마쇄하여 시료에 20배(v/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 3회 반복한 후 여과하여 회전식 진공농축 기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이들 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO) 에 희석하여 실험에 사용하였다.
2. 발효특성
1) pH 및 산도: 청국장의 산도는 시료 1 g을 증류수 20 ml에 희석하여 pH 8.3이 될 때까지 소요되는 0.1 N-NaOH의 양(ml)으로 나타내었다.
Acidity (%)=ml of 0.1 N NaOH×0.1×dilution rate×0.09*
×100 Weight of sample (g)
*0.09: conversion factor
2) 아미노태 질소, 암모니아태 질소, γ-glutamyl- transpeptidase(γ-GTP)측정: 아미노태 질소(NH2-N)는 청국장 시료 2 g을 취하여 formol법35)으로 측정하였으며, 암모니아태 질소(NH3-N)는 증류수를 가하여 청국장을 5
배 희석, 진탕추출 후 여과지로 여과한 여액을 AM505-K (아산제약)에 의한 Indophenol법으로 측정36)하였으며, γ- glutamyltranspeptidase (γ-GTP) 역가는 시료 10 g을 취하 여 증류수로 5배 희석하여 진탕추출한 다음 10,000×g에 서 30분간 원심분리하여 상등액을 조효소액으로 하였 다. 이 조효소액을 5-aminolicylic acid법을 이용하는 AM158- K (아산제약)를 이용하여 측정하였다.37)
3) 총균수: 청국장 1 g을 취하여 멸균생리식염수를 이 용한 10배 희석법으로 희석하고 plate count agar에 도말 한 후 30oC에서 48시간 배양한 다음 나타난 colony를 계 수하여 호기성균수(CFU/g)로 나타내었다.
4) 관능검사: 반복된 랜덤화 완전 블록 계획(replicated randomized complete block design)에 따라서 훈련된 11명의 관능요원이 발효된 각 청국장을 청국장찌개(물 500 ml에 청국장 50 g, 두부 10 g, 소금 3 g, 무 10 g)를 만들어 1회 에 3가지 시료를 평가하게 하고 이를 2회 반복 실시하였 다. 평가 항목은 주관적인 평가로 색(color), 점질성(viscous material), 종합적인 평가(overall acceptability)로 하고, 1에 서 9까지 분류한 등급을 사용하여 평가하였으며, 1에 가 까울수록 극도록 싫은 것으로, 9에 가까울수록 극도로 좋은 것으로 나타내었다. 또 객관적인 평가로는 후각적 지각인 청국장 특유의 냄새(smell)와 미각적 지각인 단맛 (sweetness), 쓴맛(bitterness), 감칠맛(savory taste), 종합적인 맛(overall flavor), 그리고 질감을 평가하였으며, 그 정도는 1에 가까울수록 감지 불가능하고, 9에 가까울수록 극도 로 강하게 감지하는 것으로 나타내었다. 후각적 지각으 로 코로 감지되는 것으로 평가하였고, 미각적 지각은 여 러 차례 어금니로 씹은 후 입과 코로 감지되는 것으로 평가하였으며, 질감은 앞니를 사용하여 2∼3회 씹는데 드는 힘의 정도로 평가하였다. 이때 단맛이나 감칠맛은 먹은 뒤에 나타나는 구수한 뒷맛의 정도, 쓴맛은 청국장 발효에 의해 나타나는 불쾌한 정도로 정의하였다.38)
3. Ames 항돌연변이 유발 억제 실험
1) 실험균주 및 돌연변이 유발물질: Salmonella typhimurium LT-2 histidine 영양요구성인 Salmonella typhimurium TA100은 미국 캘리포니아 대학의 Ames B.N.박사로부터 제공받아 실험에 사용하였으며, histidine 영양요구성, deep rough (rfa) 돌연변이, uvr은 돌연변이, R factor 등의 유전형질을 확인하여 사용하였다. 돌연변이 유발원으로 aflatoxin B1
(AFB1)과 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG)을 이용하였는데, 간접돌연변이원인 AFB1은 Sigma사에서 구입하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여서 사용하였고 직접돌연변이원인 MNNG는 Aldrich Chemical Co. (USA)에
서 구입하여 증류수에 녹여서 사용하였다.
2) 항돌연변이효과 실험: 항돌연변이 실험은 preincu- bation mutagenicity test를 이용하였다. 미리 건열 멸균시 킨 glass cap tube에 S9 mix 0.5 ml (간접돌연변이인 경우), phosphate buffer, 하룻밤 배양된 균주(1∼2×109 cells/ ml) 0.1 ml, 희석된 시료(50μl)와 돌연변이 유발물질(50μl)을 ice bath에 담긴 cap tube에 넣고 가볍게 vortex한 후 37oC 에서 30분간 예비 배양하였다. 45oC의 top agar 2 ml씩을 각 tube에 붓고 3초간 vortex하여 minimal glucose agar plate 에 도말하고 37oC에서 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 숫자를 계수하였으며 실험에 사용된 시료와 돌연변이 유발물질의 농도는 예비실험(dose response 및 독성실험) 을 통하여 결정하였으며 돌연변이 억제효과의 정도 (inhibition rate)를 나타냈다.39,40)
4. In vitro 항암실험
1) 암세포 배양: 인체 위암세포(AGS human gastric adeno- carcinoma cell)와 HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon carcinoma cell)는 한국 세포주 은행(서울의대)으로부 터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. 암세포는 100 units/ml의 penicilin-streptomycin (GIBCO, USA)과 10%
의 fetal bovine serum (FBS)이 함유된 RPMI 1640배지를 사 용하여 37oC, 5% CO2 incubator (Forma, model 311 S/
N29035, USA)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2∼3회 refeeding하고 6∼7일 만에 PBS로 세척 한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리 하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫 으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 ml cell culture flask에 10 ml씩 일정 수 분할하여 주입하고 6∼7일 마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
2) 3-(4,5-dimethy lthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide(MTT) assay: 배양된 암세포는 96 well plate에 well당 1×104/ml가 되게 180μl씩 분주하고 시 료를 일정농도로 제조하여 20μl 첨가하여 37oC, 5% CO2
배양기에서 72시간 배양하였다. 여기에 인산생리식염수 에 5 mg/ml의 농도로 제조한 MTT용액 20μl를 첨가하여 동 배양조건에서 4시간 더 배양하였다. 상등액 제거 후 각 well 당 DMSO 150μl를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.41,42)
5. 통계분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 ANOVA 를 구한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 통계분 석하였다.
Table 1. The changes of pH, acidity and total viable counts in Seoritae Chungkukjangs that fermented with different kind of starters
Total viable
Sample pH Acidity (%) count (CFU/g)
BS2)-C1) 7.1 0.65±0.03 9.5×109
BL3)-C 6.5 0.83±0.03 9.0×109
BM4)-C 6.7 0.95±0.00 4.6×109
1)Chungkukjang, 2)BS: Bacillus subtilis KCCM 11315, 3)BL: Ba- cillus licheniformis CN-115, 4)BM: Bacillus megaterium SMY- 212.
Fig. 1. The content of amino and ammonia type nitrogens and the activity of γ-GTP in Seoritae Chungkukjangs fermented with different kind of starters.
a∼cMeans with the different letters on the bar are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
결과 및 고찰
1. B. subtilis에 의한 검정콩 청국장의 발효 특성 청국장에서부터 분리한 6가지 균주(Bacillus circulans, Brevibacillus brevis, B. licheniformis, B. coagulans, B. subtilis, B.
sterothermophillus)의 특성과 기능성을 조사한 결과, B. lic- heniformis를 이용하여 발효시킨 청국장의 organoleptic qua- lity와 MNNG와 AFB1에 대한 항돌연변이 효과가 가장 높 았다.34) 박 등25)은 starter 종류에 따라 제조된 청국장의 항돌연변이 활성효과 연구에서 B. subtilis와 B. licheniformis 를 접종하여 제조한 청국장이 무접종법 증자에 의해 제 조된 청국장이나, 볏짚을 이용하여 발효시킨 청국장에 비하여 항돌연변이 효과가 높았다고 밝혔다. 손 등33)은 검정콩 청국장 제조에 맞는 균주로 여러 가지 균원시료 로부터 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성과 GP-micro- plate 동정 시스템을 통하여 B. megaterium과 유사한 SMY- 212를 분리하였으며 이 균주는 효소활성(protease: 124.8 U/ml, α-amylase: 78.2 U/ml, glucoamylase: 13.9 U/ml)이 높 았으며, 점질물 형성과 혈전용해능도 우수하였다. 본 연 구에서는 선행 연구들의 결과를 토대로 검정콩 청국장 제조를 위한 균주로 B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium 을 선택하여 사용하였다.
pH, acidity, total viable counts: 검정콩에 균주를 달리하 여 제조한 청국장의 품질특성을 비교하였다. Table 1은 B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium를 이용하여 제조한 청국장의 pH와 산도, 총균수를 비교한 결과이다. 균주를 달리하여 원료무게의 1%를 접종하여 40oC incubator에서 72시간 발효시킨 청국장의 pH는 각각 7.1, 6.5, 6.7로 나 타났으며, B. subtilis를 이용하여 발효시킨 검정콩 청국장 은 산도가 0.65%로 B. licheniformis, B. megaterium를 이용하 여 발효시킨 검정콩 청국장(0.83%, 0.95%)에 비하여 낮
게 나타났다. 총균수는 109 CFU/g 수준으로 모든 시료가 비슷한 수준을 보였다. 증자 대두는 발효가 진행됨에 따 라 탈아미노화 현상이 일어나 이취성분의 주체인 암모 니아가 생성되며 아미노태질소와 pH가 증가하게 된다.
따라서 균주의 종류가 발효과정에 각기 다른 영향을 준 것으로 사료된다.
NH2-N, NH3-N, γ-GTP 측정: B. subtilis와 B. lichenifor- mis를 이용한 검정콩 청국장의 NH2-N, NH3-N, γ-GTP 함량은 각각 1,061 mg%, 150μg/dl, 82 mU/ml와 998 mg%,
Fig. 2. Sensory evaluation of Seoritae Chungkukjang Jjigae (pot stew) prepared from chungkukjang fermented with different kind of starters.
Fig. 3. Effect of methanol extracts from Seoritae Chungkuk- jangs fermented with different kind of starters on the muta- genicities induced by aflatoxin B1 (AFB1, 0.4μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100.
a∼dMeans with the different letters on the bar are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
133μg/dl, 78 mU/ml로, B. subtilis를 종균으로 검정콩 청국 장을 제조하였을 때 조금 더 높게 나타났다. 반면에 B.
megaterium을 이용한 검정콩 청국장은 아미노태 질소 함 량이 704 mg%, 암모니아태 질소 함량이 88μg/dl, γ -GTP 활성은 52 mU/ml으로 낮은 수치를 나타내었다 (Fig. 1). 아미노태 질소는 청국장의 구수한 맛을 좌우하 는 아미노산 성분으로 B. subtilis와 B. licheniformis를 종균으 로 이용한 검정콩 청국장에서 비교적 높은 함량을 나타 내었고 B. megaterium에서 가장 낮았다. 아미노태 질소 함 량은 암모니아태 질소와 비슷한 경향을 나타내었으나, 그 값은 80∼150μg/dl 정도의 낮은 수치로서 불쾌취의 원인이 되지 않는다고 사료된다. 청국장의 점질물 구성 성분은 fructose와 glutamic acid가 중합된 levan form fructan 과 polyglutamate (PGA)의 혼합물질15,16)이며 PGA는 γ- GTP에 의해 생성되는 것으로 γ-GTP역가는 B. subtilis와 B. licheniformis를 종균으로 이용한 검정콩 청국장에서 높 게 나타난 반면, B. megaterium를 이용한 것에서는 낮게 나 타났다. 따라서 종균을 달리하여 검정콩 청국장을 제조 한 결과, B. subtilis를 종균으로 이용하는 것이 pH, acidity, NH2-N, NH3-N, γ-GTP 활성 등을 비교할 때 가장 우수 하였으며 이전의 연구에서 B. subtilis를 이용한 경우 균체 증식과 효소활성이 가장 우수한 것으로 보고하였다.43) 관능검사: 균주를 달리하여 발효시킨 검정콩 청국장을 청국장찌개를 만들어 관능검사를 실시하였다(Fig. 2). 청 국장은 B. subtilis가 생산하는 효소에 의해서 그 특유의 맛과 냄새를 내는 동시에 원료대두의 당질과 단백질에 서 유래된 levan form fructan과 polyglutamate의 중합물질
인 끈적끈적한 점질물을 생성한다.44) 청국장의 색과 점 질성의 경우 균주에 상관없이 비슷한 경향을 나타내었 으며, 쓴맛의 경우 B. megaterium, B. licheniformis, B. subtilis의 순으로 감소하는 경향을 나타내었다. 단맛은 B. subtilis를 균주로 한 청국장찌개가 B. megaterium, B. licheniformis를 이 용하여 제조한 것에 비해 강하게 나타났다. 또한 전체적 인 향미에서는 B. subtilis를 균주로 한 청국장찌개가 B.
megaterium, B. licheniformis에 비해 약하게 나타났으며, 전체 적인 기호도에 있어서도 B. subtilis를 균주로 한 청국장이 다른 청국장에 비하여 높은 것으로 나타났다. 따라서 검 정콩 청국장 제조 시 B. subtilis를 사용하여 발효시키는 것이 관능적으로 우수한 제품을 제조할 수 있을 것으로 사료된다.
2. B. subtilis에 의한 검정콩 청국장의 항돌연변이 효과 균주를 달리하여 제조한 검정콩 청국장의 항돌연변이 효과를 알아보기 위하여 starter와 다르게 하여 청국장을 제조하고 항돌연변이 효과를 비교하였다. 간접돌연변이 원인 AFB1에 대해 B. subtilis, B. licheniformis와 B. megaterium 를 이용하여 제조한 검정콩 청국장 시료의 메탄올 추출 물은 낮은 농도(1.25 mg/ plate)에서 각각 23%, 21%, 13%
의 항돌연변이 효과를 나타내었으며, B. subtilis와 B.
licheniformis로 제조한 검정콩 청국장 간에는 큰 차이를 보 이지 않았다(Fig. 3). 높은 농도(2.5 mg/plate)에서는 79%, 47%, 33%의 효과를 보여서, B. subtilis를 사용하여 제조한 청국장의 항돌연변이 효과가 가장 높은 것으로 나타났
Fig. 4. Effect of methanol extracts from Seoritae Chungkuk- jangs fermented with different kind of starters on the muta- genicities induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG, 0.4μg/plate) in Salmonella typhimurium TA100.
a∼cMeans with the different letters on the bar are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
Fig. 5. Growth inhibitory effect of methanol extracts from Seoritae Chungkukjangs fermented with different kind of starters on AGS human gastric adenocarcinoma cells in MTT assay.
a∼dMeans with the different letters on the bar are significantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
다(p＜0.05). 한편, 직접 돌연변이원인 MNNG를 이용한 실험에서 B. subtilis, B. licheniformis와 B. megaterium을 이용하 여 제조한 검정콩 청국장 시료의 메탄올 추출물을 0.625 mg/plate 농도로 처리한 결과, 각각 35%, 32%, 14%의 돌 연변이 억제 효과가 나타났으며, 1.25 mg/plate농도로 시 료를 처리했을 경우, 각각 48%, 47%, 16%의 항돌연변이 효과를 나타내었고 2.5 mg/plate 농도에서는 54%, 51%, 19%의 항돌연변이 효과를 나타내어 3가지 농도 모두에 서 비슷한 경향을 나타내었다(Fig. 4). 이 경우 B. subtilis를 사용하여 제조한 청국장의 항돌연변이 효과가 가장 커 서 2.5 mg/plate 농도에서 54%의 효과를 나타내었으며, B. megaterium에 비해서는 유의적으로 차이가 있었으나(p
＜0.05), B. subtilis와 B. licheniformis간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 starter를 달리하여 대두 (노란콩) 청국장을 제조하여 항돌연변이 효과를 관찰한 연구에서 B. licheniformis를 사용하여 청국장을 제조하는 것이 바람직하다는 결과와는 다소 다른 양상으로25,34) 이 것은 원료로 사용한 대두(노란콩)와 검정콩의 차이에서 비롯된 것으로 사료된다.
3. B. subtilis에 의한 검정콩 청국장의 암세포 성장 저 해 효과
균주를 달리하여 제조한 검정콩 청국장의 암세포 성 장 저해 효과를 알아보기 위하여 B. subtilis, B. licheniformis 와 B. megaterium를 각각 사용하여 제조한 청국장의 AGS 인체 위암세포와 HT-29 인체 결장암세포의 성장 저해
효과를 비교하였다. AGS 위암세포를 이용하여 균주의 종류를 달리하여 제조한 검정콩 청국장의 암세포 성장 저해 효과를 비교한 결과는 Fig. 5와 같다. 시료의 메탄올 추출물을 1.5 mg/ml 첨가했을 때 각각의 B. subtilis, B.
licheniformis와 B. megaterium를 이용하여 제조한 검정콩 청 국장은 45%, 41%, 16%의 암세포 성장 저해율을 나타내 었다. 대조군에 비하여 균주의 종류를 달리하여 제조한 검 정콩 청국장의 암세포 성장 저해 효과는 유의적인 차이를 보였으나(p＜0.05), B. subtilis와 B. licheniformis 사이에는 유의 적인 차이를 보이지 않았다. 한편 3.0 mg/ml 첨가했을 때 는 모든 시료에서 50% 이상의 높은 암세포 성장 저해율 을 나타내었으며, B. subtilis, B. licheniformis와 B. megaterium 사용 검정콩 청국장은 각각 82%, 73%, 62%의 암세포 성 장 저해율을 나타내었으며, 유의적인 차이를 보였다(p
＜0.05). HT-29 결장암세포를 이용한 실험에 낮은 농도 (1.5 mg/ml)에서는 각각 41%, 36%, 14%의 암세포 성장 저 해율을 나타내었으며 대조군과 비교하여 유의적인 차이 가 있었으나(p＜ 0.05) B. subtilis, B. licheniformi의 시료 간에 는 유의적인 차이가 없었다. 그러나 시료의 메탄올 추출 물을 3.0 mg/ml 첨가했을 때는 모든 시료에서 50%이상의 높은 HT-29 결장암세포 성장 저해율을 나타내었다. B.
subtilis, B. licheniformis와 B. megaterium로 발효한 검정콩 청국 장은 각각 76%, 69%, 59%의 암세포 성장 저해율을 나타 내었으나 B. subtilis, B. licheniformis간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다(p＜0.05) (Fig. 6). 이러한 결과는 이 등37)과 권 등15)의 연구 결과와는 다른 양상으로 이것은 원료로 이용한 대두(노란콩)와 검정콩의 차이에서 비롯된 것으 로 사료된다. 그러므로 본 연구의 결과로 맛을 향상시키
Fig. 6. Growth inhibitory effect of methanol extracts from Seoritae Chungkukjangs fermented with different kind of starters on HT-29 human colon carcinoma cells in MTT assay.
a∼cMeans with the different letters on the bar are sig- nificantly different (p＜0.05) by Duncan's multiple range test.
며 또한 항돌연변이 및 암예방 효과를 증진시키는 검정 콩 청국장을 제조하기 위해서는 B. subtilis 균주를 이용하 여 발효하는 것이 바람직 할 것으로 사료된다.
결 론
B. subtilis와 B. licheniformis를 이용하여 72시간 발효시킨 검정콩 청국장은 각각 pH 7.1, pH 6.7과 0.65%, 0.95%의 산도를 나타냈으며 B. megaterium 를 이용한 검정콩 청국 장에 비하여 아미노태 질소함량과 γ-GTP 역치가 높았 다. 아미노태 질소 함량은 암모니아태 질소와 비슷한 경 향을 나타내었으나, 낮은 수치(80∼150μg/dl)로서 불쾌 취의 원인은 되지 않는다고 생각된다. 검정콩 청국장을 찌개를 만들어 관능검사를 실시한 결과, B. subtilis를 이용 하여 발효시킨 검정콩 청국장은 쓴맛과 전체적인 향미 가 가장 약한 반면 단맛과 전체적인 기호도는 가장 높은 것으로 나타났다. Ames test를 이용한 AFB1에 대한 항돌 연변이 효과를 관찰한 결과, 높은 농도(2.5 mg/ml)에서 B.
subtilis를 이용하여 제조한 검정콩 청국장이 B. licheniformis 나 B. megaterium를 이용하여 발효시킨 것에 비해 더 큰 돌연변이 억제효과가 나타났으며(p＜0.05), MNNG에 대 한 항돌연변이 효과에서도 비슷한 경향을 나타내었다.
AGS 인체 위암세포를 이용하여 실험한 결과, 높은 농도 (3.0 mg/ml)에서 B. subtilis를 이용하여 제조한 검정콩 청 국장은 82%의 암세포 성장 저해율을 나타내어 B. lichen- iformis (73%)나 B. megaterium (62%)을 사용하여 발효시킨
것에 비해 높은 암세포 성장 저해 효과를 나타냈으며(p
＜0.05) HT-29 인체 결장암세포를 이용하여 실험한 결과 에서도 이와 비슷한 경향이 나타났다. 따라서 검정콩 청 국장은 사용 starter 종류에 따라 맛과 기능성에 차이가 있을 수 있는데, 제품성과 관능적인 면을 고려하는 동시 에 암예방 및 항암효과 등의 건강 기능성을 증진시키는 검정콩 청국장을 제조하기 위해서는 B. subtilis를 사용하 는 것이 좋다고 하겠다.
감사의 글
본 연구는 과학기술부·한국과학재단 지정 대구대학교 지역혁신센터(RIC) 농산물 저장·가공 및 산업화 연구센 터의 지원에 의한 것으로 이에 감사드립니다.
참 고 문 헌
1) 장창문. 청국장의 품질 특성, 농촌생활과학 17, 52-57, 1996.
2) 장지현. 우리나라의 장류문화. 농촌생활과학 17, 31- 35, 1996.
3) Choe JS, Kim JS, Yoo SM, Park HJ, Kim TY, Chnag CM, Shin SY. Survey on preparation method and consumer response of chungkukjang. Korea Soybean Digest 13, 29-43, 1996.
4) 김정상. 콩의 생리활성에 관한 최근 연구동향. 한국콩 연구회지 13, 17-24, 1996.
5) 성미경. 대두의 항암효과에 관한 고찰. 한국콩연구회지 13, 19-31, 1996.
6) 윤기도, 권동진, 홍석산, 김수일, 정건섭. 대두 및 대두 발효식품의 항돌연변이성. 산업미생물학회지 24, 525- 528, 1996.
7) 정건섭, 최신양. 대두발효식품의 암세포주에 대한 세포 독성 조사. 산업미생물학회지 25, 477-483, 1997 8) 길지은, 김기남, 박인식. 새로운 혈전 용해 효소의 생성
및 특성: 청국장에서 분리한 Bacillus sp. KP-6408로부터 효소생성의 최적조건. 한국식품영양과학회지 27, 51- 56, 1998.
9) 이현자, 서정숙. 균주를 달리한 청국장의 제조에 관한 연구(제Ⅰ보): 청국장메주 발효과정중의 성분과 효소 력. 한국영양학회지 14, 97-104, 1981.
10) 서정숙, 이상건, 유명기. 균주를 달리한 청국장 제조에 관한 연구. 제 2보 청국장의 저장중의 성분 및 효소력의 변화. 한국식품과학회지 14, 309-314, 1982.
11) 서정숙, 유명기, 허윤행. 균주를 달리한 청국장 제조에 관한 연구. 제 3보 청국장의 유리아미노산 함량과 질소 성분. 한국식품과학회지 15, 385-391, 1983.
12) 이숙희, 김선기, 최홍식. 한국장류식품의 지질성분에 관 한 연구. 한국식품과학회지 15, 123-131, 1983.
13) 주현규. 시판 청국장의 일반성분과 쑥 또는 고추기름을 첨가한 청국장의 향기성분. 한국콩연구회지 13, 44-56, 1996.
14) 이부용, 김동만, 김길환. 청국장의 물성 변환에 대한 연 구. 한국식품과학회지 23, 478-484, 1991.
15) 이부용, 김동만, 김길환. 청국장 점질물의 이화학적 특 성. 한국식품과학회지 23, 599-604, 1991.
16) 주현규, 윤세억. 청국장의 불쾌취 억제와 맛의 증진에 관한 연구. 대산농촌 5, 161-179, 1997.
17) 이강무, 이시경, 주현규. CaCO3가 Bacillus subtilis에 의한 청국장 메주발효에 미치는 영향. 한국농화학회지 37, 421-426, 1994.
18) 한혜숙. 쑥분말을 첨가한 청국장의 숙성과정중 화학성 분 변화. 건국대 석사학위논문. 1995.
19) 최웅규, 손동화, 지원대, 임무혁, 최종동, 정영건. Bacillus subtillis DC-2를 이용한 청국장 발효과정 중 맛성분 및 기호도의 변화. 한국식품영양과학회지 27, 840-845, 1998.
20) 주현규, 유재희, 윤세억. 쑥(Artemisia asiatica N.)추출물이 청국장 Flavor에 미치는 영향, 식품과학기술지 1, 41-52, 1996.
21) 최정숙, 김진숙, 유선미, 박홍주, 김태영, 장창문, 신선 영. 청국장의 제조방법과 이용실태에 관한 조사연구.
한국콩연구회지 13, 29-43, 1996.
22) Lee SK, Heo S, Bae DH, Choi KH. Medium optimization for fibrinolytic enzyme production by Bacillus subtilis KCK-7 isolated from Korean traditional chungkookjang. Korea J Appl Microbiol 26, 226-231, 1998.
23) Seok YR, Kim YH, Kim S, Woo HS, Kim TW, Lee SH, Choi C. Change of protein and amino acid composition during chungkukjang fermentation using Bacillus lichenifomis CN- 115. J Korean Agric Chem Biotech 37, 65-71, 1994.
24) 김경자, 유명기, 김상순. 볏짚을 이용한 청국장 제조에 관한 연구. 한국식품과학회지 14, 301-308, 1982.
25) 박건영, 권은영, 정근옥. 청국장의 암예방 증진 연구, 1.
대두 및 starter 종류에 따라 제조된 청국장의 항돌연변 이 활성 효과. 대한암예방학회지 6, 36-43, 2001.
26) Shon MY, Seo KI, Lee SW, Choi SH, Sung NJ. Biological activities of chungkukjang prepared with black bean and changes in phytoestrogen content during fermentation. Korean J Food Sci Tech 32, 936-941, 2000.
27) Cho SH, Ji YA. Changes in flavor of chungkookjang during fermentation. Korean J Food Sci Tech 21, 229-234, 1989.
28) Record IR, Dreosit IE, Mclnerney JK. The antioxidant activity of genistein in vitro. J Nutr Biochem 6, 481-485, 1995.
29) Pratt DE, Birac PM. Sources of antioxidant activity of
soybeans and soy products. J Food Sci 44, 1270-1275, 1979.
30) Wei H, Wei L, Frenkel K, Bowen R, Barnes S. Inhibition of tumor promotor-induced hydrogen peroxide formation in vitro and in vivo by genestein. Nut Cancer 20, 1-5, 1993.
31) Wei H, Cao Q, Rahn R. Inhibition of UV light- and Fenton reaction-induced oxidative DNA damage by the soybean isoflavone genistein. Carcinogenesis 17, 73-78, 1996.
32) Im CM, Kwon SH, Bae MS, Jung KO, Moon SH, Park KY.
Characteristics and increased antimutagenic effect of black soybean (Var. Seoritae) chungkukjang. Cancer Prev Res 11, 218-224, 2006.
33) Shon MY, Kwon SH, Sung CK, Lee SW, Park SK. Isolation and microbiogical characterics of Bacillus megaterium SMY-212 for preparation of black bean chungkugjang. Korea J Life Sci 11, 304-310, 2001.
34) Lee MY, Park SY, Jung KO, Park KY, Kim SD. Quality and functional characteristics of chungkukjang prepared with various Bacillus sp. lsolated from traditional chungkukjang. J Food Sci 70, 191-196, 2005.
35) AOAC. Official methods of analysis. 15th ed. Washington DC, Association of Official Analytical Chemists, pp. 60, 1990.
36) Weatherburn MW. Penol-hypochorite reaction for determi- nation of ammonia. J Anal Chem 39, 971-974, 1967.
37) Yoo SM, Chang CM. Study of processing adaptability of soybeean cultivars for Korean traditional chungkukjang preparation. J Korean Soc Agric Chem Biotechnol 42, 91-98, 1999.
38) 김광옥, 이영춘. 식품의 관능검사. 서울. 학연사, pp 192, 1998.
39) Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 113, 173-215, 1983.
40) Ames BN, McCann J, Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella mammalian- microsome mutagenicity test. Mutat Res 31, 347-364, 1975.
41) Park JG, Kramer BS, Steinber CJ, Collins JM, Minna JD, Gazdar AF. Chemosensitivity testing of human colorectal carcinoma cell lines using a tetrazolium-based colorimetric assay. Cancer Res 47, 5875-5879, 1987.
42) Skehan P, Storeng R, Monks SA, McMahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch H, Kenney S, Boyd MR. New colori- metric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancer Inst 82, 1107-1112, 1990.
43) 손미례. 검정콩으로 제조한 청국장의 이화학적 성상 및 생물활성. 경상대학교 박사학위논문 1999.
44) 윤숙자. 한국의 저장 발효음식. 서울. 신광출판사. pp 240, 1997.
