한우에서의 Myostatin 유전변이와 도체형질간 연관성 분석

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한우에서의 Myostatin 유전변이와 도체형질간 연관성 분석

이준섭¹· 김현주¹· 김형철¹· 양보석¹· 이승환²· 이성진^3*

농촌진흥청 국립축산과학원 한우연구소¹, 충남대학교 동물자원생명과학², 강원대학교 동물생명과학대학³

Association Analysis of Carcass Traits and Genetic Variation of Myostatin Gene in Hanwoo

Jun-Seop Lee¹, Hyoun-Ju Kim¹, Hyeong-Cheol Kim¹, Bo-Suk Yang¹, Seung-Hwan Lee² and Sung-Jin Lee^3*

1Hanwoo Research Institute, National Institute of Animal Science, RDA, Pyeongchang 25340, Korea

2Division of Animal and Dairy Science, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea

3College of Animal Life Scirnces, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

ABSTRACT¹⁾

Thus far, there have been many studies focusing on meat quality improvement for Hanwoo (Korean cattle).

It is considered that studies on meat quality have been actively conducted because beef consumption has changed from quantity to quality since early 1990's. Moreover, many studies on meat quality using maker assisted selection (MAS) have been conducted. However, there is a need to study quantity of meat in order to enhance the economic effect by genetic diversity and quantity of meat for Hanwoo. Therefore, in order to use a myostatin gene affecting meat quantity among quantitative genes for MAS, this study analyzed the association between genetic variation of myostatin gene in individuals of Hanwoo and carcass traits. Analysis between genotypes and individual phenotypic characteristics was performed by ANOVA using ASREML.

Association analysis between these 10 SNPs and phenotypic characteristics (carcass weight, eye muscle area, backfat thickness, marbling score, yield index), and there were significant differences in 5 SNPs. As a result, there were five significant differences. Although all the SNPs did not show significant differences in each trait in this study, some SNPs showed significant differences in each trait. The diversity of myostatin gene was found in Hanwoo.

(Key words: Myostatin, SNP, Hanwoo)

Ⅰ. 서론

한우의 종모우 선발과정은 우량씨수소와 우량 암소에서 태어난 수송아지를 6개월간의 체중 및 일당 증체량을 측정 하여 우수한 수송아지를 후보종모우로써 선발한다. 이런 당대검정을 통한 후보종모우 선발은 28개월 정도의 기간이 소요된다. 선발된 후보종모우의 정액을 다시 여러 암소와

교배하여 후대 검정을 위한 수송아지를 생산하게 된다. 이 후 후대 검정을 위해 생산한 수송아지를 거세 비육하여 육 질 및 육량을 측정하고, 종모우 선발에 이용한다. 후대검정 의 경우 는 후대 검정우의 비육에서 도축하기까지의 과정 으로 38개월 이상의 시간과 비육비용이 소비된다. 이렇게 종모우 선발과정은 일반적으로 60개월이라는 긴 시간이 소 요 되며, 사육 및 선발과정을 통하여 많은 비용을 소비하게

* Corresponding author: Sung-Jin Lee, College of Animal Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea.

Tel: +82-33-250-8636, E-mail: [email protected]

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.ko), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. The moral rights of the named author(s) have been asserted.

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된다. 이러한 기존의 선발과정의 단점을 보안하기 위해서 는 조기에 종모우의 선발이 가능하도록 하는 방법이 필요 하다.

이 해결방법에 앞서 분자육종 기술은 1986 년부터 DNA 유전정보를 자동으로 읽어내는 시퀀서개발을 시작으로 지금까지 계속 발전해 왔다. 기존의 방식은 Sanger 방식을 기반으로 한 시퀀싱 이었고, 이후 새로운 기법의 시퀀싱 기술이 급속도로 보급되었으며, Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 이러한 시퀀서가 개발되었고 이를 차세대 또는 제2 세대 시퀀서(NGS: Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer)라고 한다. NGS 의 개발로 시퀀싱을 보다 빠르고 저렴하게 이용할 수 있게 됨으로써, 분자육종이 개량에 용이하게 이용할 수 있게 되었다. 이를 통해 양적인 형질을 가지는 유전자좌를 알 수 있는 양적유전자위(QTL, quantitative trait loci)를 구할 수 있게 되었고, 마커도움선발(MAS, marker assisted selection)을 통하여 한우 개량에 도움이 되는 마커를 선발 할 수 있게 되었다. MAS 를 이용한 육종개량 방법은 기존의 육종개량방법과 다르게 genotype 과 phenotype 을 결합하여 육종가를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 낮은 유전형질을 효과적으로 개량 할 수 있으며, 선택적으로 유전형질을 개량에 활용할 수 있다.

또한 조기에 선발을 할 수 있어 육종개량의 세대 간격이 짧아지고 개량 속도도 증가된다. 뿐만 아니라. 개량의 선발이 빨라지면서, 그에 필요한 비용이 감소하는 효과를 볼 수 있다(Lee et al., 2013).

현재까지 한우의 육종 개량의 목표는 역용종으로 이용되었던 한우를 육용종으로써의 가치를 높이기 위해 90 년대 초반부터 연구되어 왔으며, 소비자 또한 맛과 부드러움에 기호성을 가지고 있어 지방의 함량을 높은 쪽으로 육종개량이 이루어져 왔다. 이러한 육질에 치우친 개량으로 현재 한우는 2001 년에서 2014 년까지 육질 1 등급이상의 출현율이 40% 증가하여 63%를 차지하고 있으나 육량등급의 A, B 등급 출현율은 78% 정도로 2001 년에 비해 15% 정도 감소하였다. 이는 한우 개량이 육질위주의 개량으로 유전적 다양성에 영향을 미칠 것으로 보이고, 육량 감소의 문제 해결을 위해 육량에 영향을 주는 개량이 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서 활용한 Myostatin 은 성장에 영향을 주는 8 개의 유전자(growth differentiation factor 8, GDF-8) 중 하나로써 널리 알려져 있다. 특히 이 유전자는 골격근 발달에 영향을 미친다(McPherron et al., 1997). 이것은 1804 년에 최초로 George Culley 에 의해서 double muscling 증후군으로 알려졌다가 1995 년에 최초로 소의 chromosome 2 에 위치한 SNP 에서 유전적 변이가 있음을

발견하였다(Charlier et al., 1995). 이후 Belgian blue 종에서 myostatin 유전자가 변이되어 근육량이 증가하는 것을 발견하였고 계속되는 연구에서 myostatin 의 추가적인 유전적 변이를 발견하였다. 또한 뼈의 질량의 경우 일반 품종 보다 10%정도 낮은 수치를 보이고 있으며 이는 골격근의 비대한 성장으로 골격이 얇아진 것으로 사료된다. 이미 유럽에서 이 특성을 이용한 육량 개량의 연구가 오래전부터 진행되었다. 그리고 지방함량의 경우 다른 품종에 비해 낮지만, 불포화지방산 조성을 보면, 11%정도로 다른 품종에 비해 6% 정도 높은 비율을 보이고 있다(Grobet et al., 1998; Karim et al., 2000).

본 연구는 앞서 설명한 것과 같이 한우 종모우 선발에 시간과 비용이 많이 든다는 단점의 개선과 NGS 의 개발로 분자육종이 가축개량에 쉽게 이용될 수 있으며, 그동안 육질에 치우친 한우개량으로 인한 한우의 유전적 다양성 보장과 육량증가를 목적으로 한 개량에 활용하고자 실시하였다. 이를 위해 유럽종에서 더블 머슬의 특징을 가지고 있는 Belgian blue 종의 유적적 특성을 가지고 있는 myostatin 유전자가 한우 개량에 이용될 수 있는지, 한우에서 얼마나 이 유전자가 다양성을 보이고, 표현형질과의 연관성을 알아보았다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료

본 연구에 이용된 공시재료는 한우 거세우 1,050 두의 혈액 샘플을 분석에 이용하였다. 한우의 정맥에서 혈액을 5-8ml 정도 채취하여 혈액의 응고를 막기 위해 sodium heparin 성분이 함유되어 있는 BD Vacutainer^®(BD, USA) 에 보관 후 -20℃에 냉동보관하여 DNA 추출에 이용하였 다.

표현형 형질에 대한 연관분석을 위하여 개체의 혈통자 료(생년일, 아비 어미 명호, 도축일)와 도체형질 자료(등심 단면적, 근내지방도, 등지방 두께, 육량지수)는 한국종축개 량협회의 홈페이지(http://www.aiak.or.kr) 에서 수집하였 다.

2. genomic DNA 추출

gDNA 추출은 혈액에서 DNA 를 융해시켜 DNA 가 silica 에 흡착하는 성질을 이용하는 Toypbo kit(Osaka, Japan)를 사용하여 DNA 를 추출하였고, 1.0% agarose

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Table 1. SNP sequence

SNP Sequence

rs137528458 AAGTGGAAGGAAAACCCAAATGTTG[C/T]TTCTTTAAATTTAGCTCTAAGATAC rs109597350 TTCTGGTCATGCCTTCTCTGTTGAG[A/G]TGCCTGTCTCCCTTTCCTTGAGTAT rs110596072 AAAGGATAAAAGAATATTCTTAATA[A/C]ACTTAATGTATTAGTAAGAGCAATA rs110739496 CTTTAGGATAGGAAGTAACTTAATA[C/G]TAGTCAATTGAAACTGAAATACAAT rs109067353 CCTTACCCCAGTGGTAGCCCTGTAC[C/T]CAATAAAAGTAGGTGTCCCATTTCA rs109681951 CTTTTGTTGTAAATTATATCAATAA[A/C]TGGAAATAAAAGGTATGGTCACATT rs110689541 ATTCCCTTTATTCTTTCACTAAAAA[A/G]TGTTTCCATTCAGATATTTAAACTA rs109476789 TGAGCTAAAAAGAGAGAATATATGC[A/T]ATGGTTGGCATTTAACCATCAAAAC rs109647071 TAGGAGATCAAATTCCATTTATGTT[C/G]AAATATATCACAACACATGCAGGTG rs109079350 AGGAGAAACTTATTACTTTCCTGAA[C/T]GTTTTTTGCTTGATAAACCTGATAA

gel(1.2g Agarose L+TAE buffer 120ml+EtBr 3ul)을 만들어 겔도큐멘테이션 시스템 장치(BioRad, USA)를 이용하여 전기영동을 실시하여 DNA 의 추출 여부를 확인하였다.

핵산농도측정기(BioTek, USA)를 이용하여 DNA 의 농도를 50ng/ul 로 희석하였고, 30ul 를 96well plate 에 옮겼다.

이후 DNA 의 보존을 위해 -20℃에 냉동보관 후 실험 시 해동시켜 이용하였다.

3. Myostatin SNP 선발

본 연구는 15 개의 SNP 을 Gene bank 를 통하여 선발하여 실험에 이용하였다. Table 1 의 sequence 정보를 이용하여 Applied biosystems(USA)에 의뢰하여 primer sequence 를 제작하였다. 이 중 한우에서 유전적 다양성을 보인 10 개의 SNP 을 분석에 이용하였다.

4. RT–PCR(Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR의 cycle 의 첫 번째 단계는 primer activation단계로 50.0℃에서 10 분간 활성화하고, 다음으로 pre- denaturation 단계로 95℃에서 5 분간 반응하여 주었다.

그리고 DNA 변성과 합성을 위한 denaturation 과 annealing & extension 단계를 각각 95℃에서 10 초, 60℃에서 30 초 반응하고 이 과정을 총 40 번 반복하여 주었다. 이 과정에서 DNA 의 붙은 형광물질이 발하고 증폭하게 되어 증폭과정을 확인 할 수 있다. 마지막 변성 과정과 융해 과정을 위해 denaturation 단계 95℃ 10 초, melt curve 단계 65℃ 5 초, 95℃에서 5 초간을 끝으로 반응시켜 주었다.

5. 통계분석

본 연구에서는 한우에서 도체의 각 표현형질과 유전자

형과의 연관성 분석을 위하여 ASReml package(Gilmour et al., 2006)를 이용하여 ANOVA 분석을 실시하였다.

p-value 값이 0.05 이하인 것을 통계적으로 유의한 것으로 인정하여 유전자형이 개체 표현형질에 영향을 미치는 것 으로 연관성이 있는 것으로 인정하였다. 분석 모형은 다음 과 같다.

상기모형에서,

 = 관측치

 = 전체 평균

 = 출생 년월

 = 도축일-출생일(day)

 = (AA AB BB)

=임의효과

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. SNP 별 RT-PCR 결과

Table 2 에서 나타나는 것과 같이 rs110596072 의 FAM 형이나 rs110739496 의 HETERO 형, rs109067353 의 VIC 형 은 낮은 수의 개체가 희소성을 갖는 유전자 형을 가지고 있다. 또한 대립 유전자형(Allele type)의 결과에서는 rs110739496 과 rs1009067353 SNP 의 한쪽 대립 유전자형 이 10% 정도로 희소성을 가지고 있다. 이 유전자형의 경우 한우의 유전적 다양성을 유지하고 효과적인 개량효과를 볼 수 있는 것으로 사료되어 희소성의 가치가 높다고 할 수 있다.

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Table 2. Myostatin SNP Genotype frequencies of Hanwoo

SNP Genotype 　 Allele 　

FAM HETERO VIC 　 ₁ ₂

rs137528458 0.218 0.242 0.540 　 0.339 0.661

rs109597350 0.736 0.025 0.239 　 0.749 0.251

rs110596072 0.012 0.735 0.253 　 0.380 0.620

rs110739496 0.880 0.007 0.113 　 0.884 0.116

rs109067353 0.753 0.228 0.019 　 0.867 0.133

rs109681951 0.247 0.249 0.504 　 0.372 0.628

rs110689541 0.246 0.249 0.505 　 0.371 0.629

rs109476789 0.286 0.216 0.498 　 0.394 0.606

rs109647071 0.681 0.242 0.077 　 0.802 0.198

rs109079350 0.246 0.248 0.506 　 0.370 0.630

re137528458 FAM: CC, VIC:　TT; rs109597350 FAM: AA, VIC: GG; rs110596072 FAM: AA, VIC: CC; rs110739496 FAM: GG, VIC: CC;

rs109067353 FAM: GG, VIC: AA; rs109681951 FAM:　TT, VIC: GG; rs110689541 FAM: TT, VIC: CC; rs109476789 FAM: AA, VIC: TT;

rs109647071 FAM: CC, VIC: GG; rs109079350 FAM: CC, VIC:　TT.

2. 표현형질간 연관성 분석

-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8

MI BF MS CW EMA 1

MI

BF

MS

CW

EMA -0.94

-0.01

-0.35

0.15

-0.94

0.1

0.27

0.05

-0.01

0.1

0.24

0.4

-0.35

0.27

0.24

0.56

0.15

0.05

0.4

0.56

1, MI: meat index. 2, BF: backfat thickness. 3, MS: marbling score. 4, EMA: eye muscle area. 5 CW: carcass weight.

Fig. 1. Correlation between traits.

도체중, 등심단면적, 등지방두께 및 근내지방도, 육량지 수의 각 형질간 연관성을 분석하였다(Fig. 1). 도체중의 경 우 등심단면적과는 0.565, 등지방두께와는 0.266, 근내지방 도와는 0.244, 육량지수와는 -0.353연관성을 보였고, 등심단 면적과 등지방두께와의 관계에서는 0.054, 근내지방도와는 0.400, 육량지수와는 0.151 연관성을 보였다. 그리고 등지 방두께와 근내지방도와의 연관성은 0.095로 나타났으며 육 량지수와는 -0.940의 결과를 보였다. 마지막으로 근내지방 도와 육량지수와의 관계는 -0.008 정도 결과를 보였다. 이 수치의 값은 0에 가까울수록 낮은 연관성을 보이고 -1에

가까울수록 반비례적 연관성을 보이다. 본 연구 결과에는 등지방두께와 육량지수간의 값이 -0.94로 연관성이 가장 크게 나타났다. 그리고 그 값이 음(–)의 값을 취하고 있으 므로 둘의 관계는 반비례적 관계라 할 수 있겠다. 3. 표현 형질별 정규분포 분석 및 단순회귀분석

각 형질의 분포를 분석하고 각 표현형질을 회귀분석하였 다. Fig. 2는 도체중(CW)에 대한 densityplot과 QQplot로 평균값은 419kg에 최대값 555kg, 최소값 269kg으로 비교 적 완만한 곡선을 나타내는 분포도를 보인다. QQplot역시 뚜렷한 선형의 그래프를 보여 상호관련성이 있는 것으로 판단된다. 등심 단면적(EMA)의 경우 평균 88㎠, 최대값 132㎠, 최소값 53㎠로 평균 가까이 많이 분포되어있는 형 태로 밀집되있다. 다음의 등지방 두께(BF)의 경우 평균값 13mm로 최고값이 39mm로 좋은 형질을 가진 개체가 적은 형태의 분포도를 보이고 있어 QQplot의 상위에서 선형의 위치보다 높은 곳에 나타났다. 육량지수(MI) 경우 평균값 64.75이고, 최고와 최저는 각각 73.77과 47.31으로 나타났 다. 이 육량지수(MI)와 등지방 두께(BF)의 특이점은 두개 의 형질이 서로 반대로 그려진 듯한 모습을 하고 있다. 이 것은 앞서 말한 바와 같이 형질간 연관성 분석에서 본 것 과 같이 서로 반비례적 연관성이 높게 나타났기 때문이라 고 사료된다. 마지막으로 근내지방도(MS)의 경우 1~9등급 으로 나뉜 특징 때문에 그래프가 선형을 이루지 않고 9구 역으로 나누어 QQplot이 만들어 졌다. 근내지방도(MS)의

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Fig. 2. Densityplot and QQplot of carcass traits.

분포표에서는 가장 높은 등급을 보인 개체가 제일 적은 양 의 개체를 보이며 이 개체는 좋은 등급으로서 높은 가치가 있다고 보여진다.

4.

Myostatin

SNP과 표현형질간 연관성 분석

ANOVA 분석 방법으로 실시하여 p-value 값이 0.05 보 다 작거나 같을 경우 통계적으로 유의한 것으로 인정하여 SNP 이 개체의 표현형질에 영향을 미친다고 판단하였다.

총 10 개의 SNP 중 p-value 값이 0.05 이하인 것으로 확인 되어 유의적 차이가 인정되는 것은 rs109087353 이 CW 와 의 연관성 분석에서 0.048 로 분석되었고, BF 에서 0.029 의 값으로 나와 이 SNP 에서는 두 형질에서 유의적 차이를 보였다. 또한 rs109681951 의 경우에는 EMA 에서 p-value

값이 0.037 로 유의적 차이를 확인 할 수 있었다.

5 개의 유의적 차이를 보인 결과에서 SNP 별 유전자형 이 그 표현형질에 미치는 영향을 그래프로 나타내었다. rs109681951 의 경우 C allele 를 가지고 있는 것이 EMA 에 효과적인 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 각 유전자 형의 평균은 CC 형은 90.12 ㎠`, AC 형은 90.11 ㎠, AA 형은 89.69 ㎠로 미치는 값이 0.5 ㎠정도의 차이로 크지는 않으 나, 유전자형에 따라 영향이 있음을 확인할 수 있었다.

rs109067353 의 경우 CW 와 BF 에서 p-value 값에서 유의 적 차이를 보였다. CW 같은 경우 CC 형에서 420kg, CT 형 이 424kg, TT 형이 424.2kg 의 평균을 보여 T 형 유전자형 에서 4kg 정도 높게 영향을 미치는 것으로 확인 되었다. 그 러나 BF 의 경우 TT 형이 13.25mm 로 AA 형보다 0.74mm 정도 높은 평균을 보여 주고 있다. 다음으로 rs109647071

Table 3. Association analysis of 10 SNPs and estimated effects for CW, EMA, BF, MS in a commercial Hanwoo population (n=1050)

SNP allele

frequency

CW EMA BF MS

effect p-value effect p-value effect p-value effect p-value

rs137528458 0.52 -16.48 0.88 2.057 0.21 -0.86 0.28 -4.39E-02 0.53

rs109597350 0.86 1.280 0.15 -0.34 0.49 -7.14E-02 0.84 2.74E-03 0.85

rs110596072 0.15 -6.88 0.08 -0.68 0.64 -4.73E-02 0.96 9.42E-02 0.51

rs110739496 0.93 2.19 0.66 0.38 0.74 0.70 0.16 -0.18 0.59

rs109067353 0.78 -0.67 0.04 1.95 0.79 0.48 0.02 -0.51 0.78

rs109681951 0.52 -12.32 0.79 -6.41 0.03 -2.15 0.46 -1.35 0.15

rs110689541 0.51 50.49 0.09 8.90 0.40 4.76 0.23 0.01 0.07

rs109476789 0.55 -13.96 0.20 -4.03 0.11 -0.96 0.89 0.11 0.55

rs109647071 0.74 -8.24 0.25 -2.03 0.24 -1.76 0.04 0.68 0.03

rs109079350 0.48 -0.46 0.84 -0.70 0.23 0.24 0.41 6.53E-02 0.56

CW, carcass weight; EMA, eye muscle area; BF, backfat thickness; MS, marbling score.

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Fig 3. SNPs represents a significant difference.

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의 경우 BF 와 MS 의 경우에서 유의적 차이를 보여 유전자 형 별 평균을 분석한 결과 BF 에서 CC 형이 13.23mm 의 평균을 보이고 CG 형에서 13.46mm 로 가장 높은 평균을 보이고 있으며, GG 형의 경우 12.45mm 로 가장 적게 나타 났다. MS 의 평균 역시 GG 형에서 평균적으로 좋은 등급 의 점수를 갖는 것으로 나타났다. rs109647071 의 경우 HETERO 형태에서 특이하게도 높은 평균을 나타내는 경향 이 있었다.

본 연구 결과 myostatin유전자는 충분히 육량 개량에 활용 될 수 있을 것으로 보여지나, 육량에 영향을 주는 많 은 유전자들을 확인하고 추가하여 연구할 필요성이 보여 진다.

Ⅳ. 요약

마커도움선발(MAS)을 이용한 연구 육질에 대한 연구가 많이 진행되었다. 하지만, 한우에 있어서 유전적 다양성과 육량에 의한 경제 효과를 높이기 위해 육량에 대한 연구의 필요성을 느꼈다. 따라서 본 연구는 양적유전자위 중 육량 에 효과적인 myostatin 유전자를 마커도움선발에 이용하고 자, 한우 개체에서의 myostatin 유전적 변이와 도체형질간 의 연관성을 분석하였다.

실험개체는 한우DNA 1152 두를 이용하였고, myostatin 유전변이를 가지고 있는 SNP(single nucleotide polymorphism) 14 개를 이용하여 real time PCR 분석을 실시하였다. 이중 4 개의 SNP 은 한우에서 다양성을 보이 지 않아 통계에서 제외하였다. 통계방법은 ASREML 프로 그램을 이용하여 ANOVA 분석방법으로 유전자형과 개체 의 표현형질간의 분석을 실시하였다. 이 10 개의 SNP 과 표현형질(도체중, 등심단면적, 등지방두께, 근내지방도, 육 량지수)과의 연관성 분석을 실시한 결과 5 개의 부분에서 유의적 차이를 볼 수 있었다. 본 연구에서 모든 SNP 이 각 각의 형질에 유의적 차이를 볼 수는 없었으나, 각 형질에서 유의적 차이를 보인 SNP 을 확인할 수 있었고, 한우에 있어 서 myostatin 유전자에 관한 다양성을 확인할 수 있었다.

사사

본 논문은 2016 년도 농촌진흥청(국립축산과학원) 인턴 십 과정 지원사업 및 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 계 통교배에 의한 종축 선발체계구축, 세부과제번호 :

PJ00640501)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Ⅴ. REFERENCES

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(Received 06 October 2016, Revised 06 December 2016, Accepted 07 December 2016)