한우 배최장근 조직 내 Insulin-like Growth Factor-1(IGF-1) 유전자의 발현과 근내지방도와의 연관성 분석

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한우 배최장근 조직 내 Insulin-like Growth Factor-1 ( IGF-1 ) 유전자의 발현과 근내지방도와의 연관성 분석

윤효정^1,2․성지연¹․오재돈¹․유소연²․황승용²․공홍식^1*

한경대학교 유전정보연구소¹, 지노첵²

Association of Insulin-like Growth Factor-1 ( IGF-1 ) Gene Expression with Marbling Score in M. Longissimus Tissue of Korean Cattle (Hanwoo)

Hyojeong Yoon^1,2, Jiyeon Seong¹, Jae Don Oh¹, Soyoen Yoo², Seungyong Hwang² and Hong Sik Kong^1*

1Genomic Informatics Center, Hankyong National University, ²Genocheck

ABSTRACT¹⁾

Recently, with the increase of meat production, high quality and safety of meat have been strongly emphasized by Korean consumers. Marbling in beef has been regarded as an important criterion deciding meat quality in Korea. The purpose of this study was to identify the transcriptional level ofinsulin-like growth factor-1 (IGF-1) in longissimus muscle samples of 46 Hanwoo. The level of IGF-1 transcripts was measured by real-time polymerase chain reaction (PCR) and molecular connection of IGF-1 was analyzed using the Pathway Studio program (Ver 9.0). Increase of marbling score (MS) induced increase ofIGF-1 transcripts level in the muscle and there is a significant correlation (p<0.05) between IGF-1 mRNA expression and MS. The pathway study showed that IGF-1 genes are regulated in insulin, fatty acid synthase, leptin, and corticotrophin releasing hormone. These results suggest thatIGF-1 might be used as a useful marker for the improvement of economic traits in Hanwoo.

(Key words: Insulin-like growth factor-1, Gene expression, Economic trait, Marbling score, Korean cattle)

Ι. 서론

소비자들의 육질에 대한 선호도가 높아짐에 따라 육질 이 우수한 고기의 생산량을 높이는 것이 농가의 소득에 매우 중요한 요소로 작용되고 있다. 현재 쇠고기의 등급 은 육량 등급과 육질등급을 이용하여 평가되고 있으며, 이는 도체중, 등지방두께, 배최장근 단면적 및 근내지방 도의 판정기준에 따라 결정 되어 진다(Shin 등, 2009). 특 히 근내지방도는 쇠고기의 관능적 특성의 기준이 되는

다즙성, 연도 및 풍미 등을 증가시키기 때문에 우수한 등급 을 받기 위해서는 근내지방 함량을 높이는 것이 매우 중요 하다(Lee 등, 2008; Shin 등, 2009).

따라서 우수한 등급의 쇠고기 생산을 증가시키기 위해 가축의 주요 경제형질 개량을 위한 연구가 활발히 진행 중 에 있다. 가축의 개량은 우수한 능력을 지닌 개체의 선발을 통한 우수한 능력을 가진 후대의 생산이 가장 중요한 요소 이다. 여기에 우수한 능력의 개체를 조기에 선발할 수 있다 면, 개량 속도를 증가시킬 수 있게 된다. 따라서 분자유전

* Corresponding Author: Hong Sik Kong, Genomic Informatics Center, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea. Tel:

+82-31-670-5334, E-mail: kebinkhs@empal.com

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학적 접근을 통한 조기선발 기술 개발을 위한 연구가 활발 히 진행 중에 있다.

최근 대용량 Single nucleotide Polymorphism(SNP) Chip을 이용한 유전체 선발 관련 연구 결과가 상당히 많 이 보고되어 있다(Cesar 등, 2014; Kamiński 등, 2006). 하 지만 각각의 SNP, 그리고 그 SNP를 포함한 유전자들의 기 능과 역할들을 설명하기에는 매우 부족한 실정이다. 따라 서 경제형질과 관련된 유전자들의 기능을 구명하는 연구 는 유전체 선발 기술의 강화를 위해 매우 중요한 역할을 할 것으로 판단된다. 최근 근내지방도 관련 유전자들의 기 능연구를 통해 유리지방산을 근육 및 지방세포로 이동시 키는 Adipose fatty acid binding protein 4(FABP4) 유전자와 Adipose fatty acid binding protein 5(FABP5) 유전자 및 포화 지방산을 불포화 지방산으로 전환시켜주는 Stearoyl-CoA desaturase(SCD) 유전자의 발현이 근내지방 함량과 밀접하 게 연관되어 있다고 보고되었고,Melanocortin receptor type 4(MC4R) 유전자, Fatty acid synthase(FASN) 유전자와 Serpine mRNA binding protein-1(SERBP-1)은 근내지방도 연 관 유전자로 보고되어졌다(Kim 등, 2009; Kim 등, 2010;

Heo 등, 2011; Jeong 등, 2012; Seong 등, 2012).

Insulin-like growth factor-1(IGF-1) 유전자는 발달 단계에 서 성장 및 세포 대사 조절에 관여하는 호르몬으로, 주로 간에서 분비되고 태아와 성인 조직에서 합성되며 소에서 는 성장, 발달, 대사 및 젖의 분비 등 매우 중요한 생리적 인 기능에 관여하고 있다(Daughaday와 Rotwein, 1989;

Hossner 등, 1997; Breier, 1999; Lucy 등, 2008; Michael 등, 2011). 소에서 IGF-1 함량은 생체중, 도체중, 우유 생산량 및 지방침착에 영향을 미치는 것으로 보고되어 졌다(Davis 등, 1995; 2000). 또한 근육관련 전사인자들의 발현을 증가 시켜 근단백질의 합성을 도와 골격근의 발달, 성장, 근 부 피의 유지 및 증대에 필수적인 요소로 널리 알려져 있으며 (Butler 등, 2003), 대부분의 연구가 성장형질을 대상으로 진행되어지고 있다. IGF-1 유전자는 소의 5번 염색체에 위

치하고 있으며, 소의 5번 염색체상의 성장관련 Quantitative trait locus(QTL) 지역 내에 IGF-1 유전자가 위치하고 있는 데, 이 지역은 근내지방도 관련 QTL도 함께 보고되어 있 다(Kim 등, 2009). 따라서 IGF-1 유전자의 연구는 가축의 성장형질은 물론 근내지방 관련 형질의 개량을 위한 기술 개발을 위해 매우 중요한 역할을 할 것으로 판단되어 진다. 따라서 본 연구는 근내지방도 등급에 차이를 보이는 한 우 거세우 배최장근 조직에서 IGF-1 유전자의 차등발현 양 상을 분석하고, 근내지방도와의 연관성을 분석하여 한우의 육질관련 형질 개량을 위한 분자육종기술 개발을 위한 기 초 연구 자료를 제공하고자 수행하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 공시재료

한우의 IGF-1 유전자의 발현양상과 근내지방도의 연관 성 분석을 위해 32 개월령에 도축된 도체성적을 보유한 한 우 거세우 46두의 배최장근 조직을 근내지방도 등급별로 축산물 품질 평가원에서 제공받아 공시재료로 이용하였다 (Table 1). 모든 배최장근 조직은 도축 후 30분 이내에 액 체질소로 즉시 동결시켜 -70℃에 보관하면서 실험에 이용 하였다.

2. RNA 추출 및 quality

채취한 한우 배최장근 조직으로부터 RNA 분리는 Trizol(TaKaRa Icn., Japan)을 이용하여 추출하였다. 조직 을 액체질소와 함께 막자사발에 넣어 계속 동결상태로 유 지하며 곱게 분쇄한 후 1 ml Trizol 시약과 잘 혼합하여 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 얻은 상등액에 chloroform 0.2 ml을 첨가한 후 14,000 rpm으로 15분간 원

Table 1. Overall means±standard deviations (SDs) of traits analyzed in this study.

Economic traits Mean±SD

Carcass weight (kg) 423.43±27.77

Longissimus muscle dorsi area (cm) 96.68±7.42

Backfat thickness (cm) 12.07±4.91

Marbling score (1–9) 5.28±2.40

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심분리한다. 상등액에 isopropanol을 첨가하여 준 후 상온 에서 10분 간 방치하고 14,000 rpm에서 10분 간 원심분리 하여 RNA pellet을 얻었다. 수집 된 pellet에 70% 에탄올 을 첨가하여 10,000 rpm으로 5분간 세척한 후 건조시킨 뒤 RNase-free water 70 ㎕로 용해하여 Total RNA를 획득하 였다. 추출 된 RNA 샘플은 NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Inc., USA)을 이용하여 260 nm 와 280 nm 흡광도를 측정하였고, Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technology, USA)을 이용하여 rRNA ratio (28s/18s)와 RIN(RNA Integrity Number)를 확인하였다.

3. cDNA 합성

cDNA 합성은 한우 배최장근 조직 시료에서 추출한 총 RNA를 이용하였다. 합성엔 High Capacity RNA to cDNA Kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하였다. 2 x RT 10 ㎕와 20 x RT Enzyme mix 1 ㎕로 샘플 수에 맞게 reaction mixture를 만들었다. 2 ㎍의 total RNA와 D.W로 volume 9 ㎕를 맞춰서 reaction mixture에 분주하여 20 ㎕ 로 cDNA 합성에 이용하였다. 각각의 샘플을 37℃ 1시간, 95℃에서 5분 간 반응시켰다. 최종 합성 된 cDNA는 1/2로 희석하여 실험에 이용되기 전까지 –20℃에서 보관하였다.

4. Real-time PCR을 이용한 유전자 발현양상 분석

쇠고기 등급에 따른 IGF-1 유전자의 발현양상을 분석하 기 위하여 Real-time PCR 기법을 기존의 표준곡선 방식대 로 이용하였다. 추출한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합 성하고 합성 된 cDNA 2 ㎍을 주형으로 UDG(Uracil DNA Glycosylase system)를 포함하는 roche fast universal master mix(roche, Swiss)와 Bos taurus TaqMan Gene Expression Assays를 이용하여 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems, USA)를 통하여 분석하였다.

IGF-1 유전자 발현 분석에 이용된 assay는 Genebank (BC126802)에 등록된 cattle종의 IGF-1 assay(Bt03252282 _m1, Applied biosystems, USA)를 이용하였다. PCR은 1 샘플에 3번 반복실험으로 반응은 50℃에서 2분, 94℃ 10분 반응하고 이 후 94℃ 15초, 60℃ 60초 2 step을 40회 반복하여 진행하였다. Genebank(BC102589)에 등록된 Glyceraldehyde -3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 유전자(Bt03210909_g1, Applied Biosystems, USA)를 housekeeping 유전자로 이 용하였고, GAPDH 유전자의 Cycle threshold(CT) 값은

15~16 범위로 각 개체 별 유사한 값을 나타내는 것을 확인 후 사용하였다.IGF-1 유전자 CT 값은 단순 CT 값 비교 분 석방법을 이용하여 GAPDH 유전자의 CT 값으로 상대 정 량하여 표현하여 사용하였다.

5. Pathway studio 분석

유전자의 상관관계 network 분석을 위해 Pathway studio(version 9.0) 프로그램을(Ariadne Genomics Inc., USA) 이용하여 IGF-1 유전자의 pathway, 유전자 간 network, protein interaction 및 gene regulation 분석을 실 시하였다.

6. 통계분석

IGF-1 유전자의 발현양상과 경제형질 간의 연관성 분석 을 위하여 아래의 분석 식을 이용하여 SAS 9.1(SAS., USA) 프로그램을 통해 분석을 실시하였다.

Traitij = u + Expressioni + eij

위 식에서,

Traitij = 대상형질에 대한 관측치, u = 대상형질의 전체평균, Expressioni = 유전자 발현량, eij = 임의 오차

Ⅲ. 결론 및 고찰

소의 5번 염색체에 위치하고 있는 IGF-1 유전자는 근내 지방도와 성장 형질관련QTL 지역 내에 존재하고 있으며, 발달 단계에서 성장 및 세포 대사 조절에 관여하는 호르몬 으로 소에서는 성장 형질에 영향을 미치는 후보 유전자로 알려져 있으나 , 육질과의 연관성, 근내지방도에 대한 연관 성 분석 연구는 미흡한 실정이다(Johnston 등, 2001; Kim 등, 2009; Michael 등 2011).

먼저, IGF-1 유전자와 육질관련 형질간의 연관성 구명 연구를 수행하기 위해 pathway studio 프로그램을 이용한 network 분석을 수행하였다.

그 결과, IGF-1 유전자는 Insulin(INS) 유전자에 의해 조 절되며, 이는 FASN, Leptin(LEP) 및 Corticotropin releasing

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hormone(CRH) 유전자에 의해 조절되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 1). FASN 유전자는 지방과 간 조직에서 지방산을 합 성하는 복합효소로 한우에서 불포화지방산인 올레인산의 함량에 영향을 미치고, 근내지방도와 유의적인 상관관계를 가지는 유전자로 보고되었다(Jeon 등, 2011; Oh 등, 2012).

그리고 CRH 유전자의 10936G>C 지역도 근내지방도와 유 의적인 상관관계를 가지는 후보유전자로 알려져 있다 (Wibowo 등, 2007). 또한 LEP 유전자와 CRH 유전자에 의 해서 Proopiomelanocortin(POMC) 유전자가 조절되며, 이는

MC4R 유전자를 조절하고, MC4R 유전자는 LEP 유전자를 조절하는 것을 알 수 있었다(Fig. 1). POMC 유전자와 MC4R 유전자 역시 근내지방도와 연관된 후보유전자로 밝 혀져 있다(Heather와 Fiona, 2011; Seong 등, 2012). 따라서 본 연구의 pathway 분석 결과로 IGF-1 유전자는 근내지방 도와 유의적인 상관관계를 가지는 유전자로 밝혀진 후보 유전자들의 network 경로의 중심에서 작용되는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 1. Pathway studio analysis of mainly expressed gene, IGF-1 in cattle.

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IGF-1 유전자의 발현과 근내지방도의 연관성 구명을 위 해 근내지방도 등급에 차이를 보이는 한우 거세우 46두를 대상으로 IGF-1 유전자 발현 양상을 확인하여 control인 GAPDH 유전자를 기준으로 control 대비 IGF-1 유전자의 발현량을 Fig. 2에 그래프로 나타내었다. 그 결과 근내지방 도 등급 1번, 5번과 9번 그룹의 발현량이 각각 0.59±0.04, 0.68±0.01과 0.98±0.07로 점차 증가하는 것으로 나타났으 며, 근내지방도 등급이 1번부터 9번까지로 오를수록 IGF-1 유전자의 발현도 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).

Fig. 2. Gene expression level of IGF-1using Real-time PCR in Korean cattle according to marbling score 1 to 9. The values represent the mean±S.D.; C: Control(GAPDH)

다음으로 46두의 한우 거세우를 대상으로 개체별 IGF-1 유전자 발현량 분석결과를 바탕으로 유전자 발현량과 경 제형질간의 연관성 분석을 실시하였다. 그 결과 IGF-1 유 전자의 발현량은 근내지방도 등급과 유의적인 연관성이 검출되었다(p<0.05)(Table 2). 근내지방도 등급이 오를수록 IGF-1 유전자의 발현량이 점차적으로 증가하는 것을 알 수 있었으며, 2번 등급과 비교하여 9번 등급에서의 IGF-1 유

전자 발현량이 약 1.7배정도 증가하는 것을 확인 할 수 있 었다. 그러나 도체중, 등심단면적 및 등지방 두께에서는 유 의적인 연관성이 나타나지 않았다. 결론적으로 IGF-1 유전 자는 근내지방도에 따라 그 발현이 영향을 받으며, 등급이 오를수록 발현량이 증가하는 것을 알 수 있었다.

Chung 등(2005)은 한우 IGF-1 유전자의 exon 1번에 위 치한 SNP가 한우의 3개월령 체중과 통계적 유의차를 가지 고 있다고 보고하였다. 그리고 IGF-I 유전자 내 SNP는 앵 거스에서는 성장형질에 영향을 미친다고 보고되어 있으며, 프리지아종 젖소에서는 성장과 우유 생산량에 영향을 미 치는 것으로 보고되어져 있다(Ge 등, 2001; Michael 등, 2011). 본 연구 결과에서는 IGF-1 유전자의 발현량과 육량 형질과의 통계적인 유의성을 보이지는 않았으며, 이는 본 연구의 공시재료 수집에 있어 근내지방도를 우선으로 등 급별 배최장근 조직을 수집하여 발현량을 분석한 결과이 기 때문이라고 사료된다.

IGF-1 유전자는 근육세포의 분화를 자극하며 Glucose와 지방질의 합성을 증가하게 하는 것 등의 기능을 조절한다 고 알려져 있다(Etherton, 2004). 이 중 단백질과 지질합성 의 기질로써 중요한 에너지원인 glucose는 소에 있어서 근 내지방 조직 합성에 필요로 하는 에너지의 50% 이상을 공 급하는 것으로 보고되어 있다(Rhoads 등, 2004). 또한 본 연구를 통해 IGF-1 유전자는 근내지방도와 연관이 있는 후 보유전자들의 network 경로의 중심에서 작용되는 것을 확 인할 수 있었다. 그리고 근내지방도 등급이 오를수록 IGF-1 유전자의 발현량도 증가하는 것을 확인할 수 있었 고, 경제형질과의 연관성 분석 결과 IGF-1 유전자의 발현 량과 근내지방도와 연관성이 나타나는 것으로 밝혀졌다.

본 연구결과에 따르면 IGF-1 유전자의 발현량의 차이는 근내지방도와 연관된 주요 형질에 영향을 미칠 것으로 판 단된다. 또한 IGF-1 유전자의 발현양상은 한우의 우량종자 선발과 개량을 위한 유전자 마커 개발의 기초 자료 및 근 내지방도 개량을 위한 분자육종 기술 개발 연구에 유용하

Table 2. IGF-1 expression analysis in m. longissimus.

Traits Df Sum Sq Mean Sq F value Pr (>F)

CW (kg) LMA (cm²)

BF (cm) MS

1 1 1 1

957.43 463.31 27.75 31.19

0.30 3.09 1.16 6.02

0.58 0.08 0.28 0.01^* Df, Degree of freedom; Sum Sq, Sum of Squares; Mean Sq, Mean Square (Sum of Squares / Df); CW, carcass weight; LMA, longissimus muscle dorsi area; BF, backfat thickness; MS, Marbling score. *, p<0.05

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게 활용될 것으로 기대되어진다.

Ⅳ. 요약

본 연구는 Insulin-like growth factor-1(IGF-1) 유전자의 발현 양상과 육질 등급에 중요한 영향을 미치는 근내지방과의 연관성을 분석하기 위하여 수행하였다. 근내지방도 등급 1 번부터 9번까지의 한우 배최장근 조직을 대상으로 IGF-1 유전자의 발현양상을 분석한 결과 근내지방도 등급이 1번 부터 9번까지로 오를수록 IGF-1 유전자의 발현도 점차 증 가하는 것을 확인할 수 있었고, IGF-1 유전자의 발현량은 근내지방도와의 관련성에서 통계적 유의성을 보였다 (p<0.05). 결론적으로 IGF-1 유전자는 근내지방도에 따라 그 발현이 영향을 받으며, 등급이 오를수록 발현량이 증가 하는 것을 알 수 있었다. 따라서 IGF-1 유전자의 발현양상 은 한우의 우량종자 조기선발을 위한 발현 마커 개발의 기 초 자료로 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

사사

본 논문은 농촌진흥청차세대바이오그린21사업(과제번호:

PJ008196)의 지원에 의해 이루어진 것임

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(Received 14 April 2014, Revised 17 June 2014, Accepted 18 June 2014)