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(1)Original Article 한수지 51(1), 42-46, 2018. Korean J Fish Aquat Sci 51(1),42-46,2018. 우리나라에서 분리된 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus, VHSV)의 증식에 대한 Fetal Bovine Serum (FBS) 농도의 영향 김진희1·박정수1·권세련1,2·김신후3·김형준3* 선문대학교 수산생명의학과, 2유전체 기반 바이오IT 융합연구소, 3국립수산물품질관리원. 1. Effects of Fetal Bovine Serum Concentration on the Propagation of Korean Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus in an Epithelioma Papulosum Cyprini Cell Line Jin Hui Kim1, Jeong Su Park1, Se Ryun Kwon1,2, Shin Hu Kim3 and Hyoung Jun Kim3* Department of Aquatic Life Medical Sciences, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Genome-based BioIT Convergence Institute, Asan 31460, Korea 3 National Fishery Products Quality Management Services, Busan 49111, Korea 1 2. Fetal bovine serum (FBS) is essential for cell culture and is used in the determination of infectivity titer and propagation of viruses. To clarify the effects of FBS on the propagation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV), which is a causative agent of mass mortalities of olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea, VHSV was inoculated into an EPC (epithelioma papulosum cyprinid) cell line supplemented with MEMs (minimal essential medium) with FBS concentrations of 0%, 2%, 5%, and 10% (MEM0, MEM2, MEM5, and MEM10), respectively, and infectivity titers were compared. Cytopathic effects were observed in all experimental groups at 2 days post virus inoculation (dpi) and all cells were detached from cell culture flasks at 7 dpi. Infectivity titers increased to 3 dpi, persisted to 7 dpi, and decreased when cells were detached. The titer of VHSV in EPC cells in MEM0 was the lowest while those in the other experimental groups showed similar levels. In conclusion, 2% (v/v) of FBS was sufficient to propagate VHSV in EPC cells and the withdrawal of VHSV from cell culture flasks should be performed before cell detachment. Key word: Viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV, EPC cell line, FBS, Replication. 바이러스성출혈성패혈증(viral haemorrhagic septicaemia, VHS)은 Family Rhabdoviridae, Genus Novirhabdovirus에 속 하는 RNA 바이러스인 바이러스성출혈성패혈증바이러스(viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)에 의한 질병이다 (OIE, 2017). VHSV의 유전자는 nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), matrix protein (M), glycoprotein (G), nonstructural protein (NV) 및 RNA-dependent RNA polymerase (L)를 암호화하는 유전자로 구성되어 있다(Basurco et al., 1995; Trdo et al., 2006). VHSV는 N gene, G gene 또는 NV gene의 유전 자 염기서열 분석을 토대로 4개(I-IV)의 유전자형으로 나뉘어. 져 있으며, genotype I은 Ia-Ie를, genotype IV는 IVa와 IVb의 subgroup을 각각 포함하고 있다(Einer-Jensen et al., 2004). 아 시아 지역에 존재하는 VHSV는 대부분 유전자형 genotype IVa 계열이며, 국내에는 IVa 외의 다른 유전형은 존재하지 않는다고 보고되고 있다(Ahn et al., 2013). 현재 VHS를 진단하는 국제 표준 진단법(OIE, 2017)에서는 동 바이러스의 확정 진단을 위해서 세포배양을 먼저 시행한 후 추가적인 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays), IFAT (indirect fluorescent antibody test) 등의 혈청학적 진단 과 real-time reverse-transcription (RT) PCR, conventional RTPCR법 및 염기서열분석 등의 분자생물학적 진단을 요구하고 있다(OIE, 2017). 따라서, 진단에 사용되는 세포배양법은 감염. https://doi.org/10.5657/KFAS.2018.0042. Korean J Fish Aquat Sci 51(1) 42-46, February 2018. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial Licens (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.. Received 12 January 2018; Revised 20 January 2018; Accepted 6 February 2018. 서. 론. Copyright © 2018 The Korean Society of Fisheries and Aquatic Science. *Corresponding author: Tel: +82. 51. 400. 5653 Fax: +82. 51. 400. 5655 E-mail address: [email protected]. 42. pISSN:0374-8111, eISSN:2287-8815.

(2) 43. 세포배양 배지 내 FBS 농도에 따른 VHSV 증식. 력이 있는 VHSV의 복제를 일으키는 방법으로 바이러스의 존 재 유무를 알 수 있으므로, VHS 진단에 있어 가장 중요하다고 할 수 있다. 세포배양에 있어 일반적으로 사용되는 fetal bovine serum (FBS)는 주화세포의 배양을 위해 배지에 첨가되는 성분으 로서 풍부한 성장 인자와 낮은 gamma-globulin 함량을 가지 고 있기 때문에 세포의 성장에 필수적인 것으로 알려져 있다 (Gstraunthaler, 2003). VHSV를 증식시키기 위한 세포배양 수 행 시 배지에 첨가되는 FBS의 양은 대부분의 경우 10% (v/v) 농도이나(Olesen and Vestergård Jørgensen, 1992; Lorenzen et al., 1999; Kim 2015; Kim et al., 2015; OIE, 2017), Mareno et al. (2014)에서 보고한 것과 같이 2%가 사용되는 경우도 있 다. 또한 바이러스 배양 후 수거하는 기간에 대해서도 연구자 마다 차이를 보이고 있다. 일부 논문에서는 VHSV의 TCID50 (50% tissue culture infectious dose)을 확인하는 실험에서 7일 동안 관찰한 반면(Cano et al., 2016), Kim (2015)과 Kim et al. (2016)의 보고에서는 14일째까지 바이러스를 증식시켜 수거를 하기도 하였다. 주화세포를 이용한 바이러스의 증식 및 배양은 바이러스의 특성 분석, 감염가 측정 및 바이러스 백신연구 등의 실험을 위한 기초적인 실험이지만, FBS (fetal bovine serum)의 가격이 비싸고 수급이 불안정하다는 점은 바이러스에 대한 연 구를 방해하는 요소가 될 수 있으며, 나아가 세포배양을 기초로 개발된 바이러스 백신의 가격이 상승될 수 밖에 없는 불안 요소 를 가지고 있다. VHSV에 대한 어류 세포 감수성은 bluegill fin (BF-2), fathead minnow (FHM), rainbow trout gonad (RTG-2) 그리고 epithelioma papulosum cyprinid (EPC) cell line의 순서로 높 다고 보고되었다(Lorenzen et al., 1999). 그 중 EPC 세포는 잉. MEM0. MEM2. 어에서 만들어진 최초의 어류 유래 주화세포로서 다양한 어류 바이러스에 감수성을 가지고 있으며, 특히 우리나라 넙치에 감 염되는 VHSV IVa 유전자형의 배양에 가장 민감한 세포라고 알 려져 있다(Skall et al., 2005; OIE, 2017). 본 연구에서는 VHSV 증식에 있어 FBS가 미치는 영향을 알 아보기 위해 다양한 농도의 FBS가 첨가된 배지에서 배양된 EPC 세포에 유전자형 IVa의 VHSV를 접종하여 바이러스의 감 염가에 어떤 변화가 있는지 날짜 별로 조사해 보았다.. 재료 및 방법 주화세포와 바이러스 Epithelioma papulosum cyprinid (EPC) 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)과 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)를 첨가된 minimum essential medium (MEM, Gibco) 배지로 배양하였다. 바이러스는 부경대학교 김기홍 교 수 연구실에서 분양 받은 VHSV KJ2008을 사용하였다(Kim and Kim, 2011). 바이러스는 EPC 세포에서 접종하여 증식시킨 후 실험 전까지 -80℃ 초저온냉동고에서 보관하였다.. FBS 농도별 첨가 배지 준비 FBS 농도별 바이러스 증식 실험을 위해 1% antibiotic-antimycotic agent (Gibco)가 첨가된 MEM 배지에 FBS를 최종 농도 0, 2, 5 및 10%가 되도록 각각 첨가한 후 각각의 배지를 MEM0, MEM2, MEM5 및 MEM10으로 표기하였다.. FBS 농도별 바이러스 증식 실험 배양된 EPC 세포를 수거한 후 계수하여 mL당 5×105 세포 로 조정 후 MEM10 배지에 재부유한 후 5 mL씩 25 cm2 tissue. MEM5. MEM10. 1 dpi. 7 dpi. Fig. 1. Epithelioma papillosm cyprinid (EPC) cells following infection with viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) at 15ºC. Cells were cultured with minimum essential medium (MEM) supplemented with 0, 2, 5 and 10% (v/v) FBS (MEM0, MEM2, MEM5 and MEM10). Bar=100 µm. FBS, fetal bovine serum; dpi, days post virus inoculation..

(3) 44. 김진희ㆍ박정수ㆍ권세련ㆍ김신후ㆍ김형준. B. C. D. 9 Infectivity titer (log TCID 50/mL). A. 8 7 6 MEM0. 5. MEM2. 4. MEM5. 3. MEM10. 2 1. 0. 1. 3. 5. 7. 10. Days post virus inoculation. Fig. 2. Normal EPC cells with culture medium supplemented with 0% (v/v) FBS (A), 2% FBS (B), 5% FBS (C) and 10% FBS (D). Bar=100 µm. EPC, Epithelioma papillosm cyprinid; FBS, fatal bovine serum.. Infectivity titer (log TCID 50/mL). culture flask 8개에 계대배양하였다. 20℃의 배양기에서 overnight하여 세포를 플라스크에 부착시킨 다음, 배양 상층액을 모 두 제거하고 MEM0으로 2회 가볍게 수세한 후 flask 2개씩을 MEM0, MEM2, MEM5, MEM10 배지로 각각 교환하였다. 각 각의9배지로 교환된 EPC 세포에 VHSV KJ2008을 multiplicity 이 0.01이 되도록 접종하여 15℃에서 배양하였다. of infection 8 바이러스 접종 후 0, 1, 3, 5, 7 및 10일째에 세포배양 상층액을 7 수거하여 실험 전까지 -80℃에서 보관하였다. 대조구에는 바 6 이러스를 접종하지 않고 세포의 배양 MEM0 상태를 날짜 별로 관찰 5 하였다. MEM2 4. MEM5. 3. MEM10. 감염가 측정. 96-well plates에 MEM2를 사용하여 접종된 EPC 세포에 날 2 짜 별로 수거한 세포배양 상층액을 10-1-10-10까지 10단계 희석 1 0 μL씩 접종하였다 1 3 5 7 15℃에서 10 한 후 50 을 결정하기 위해 . TCID 50 Days(CPE) post virus 를inoculation 관찰하였다. 감염가 측정 10일 동안 cytopathic effect 실험은 3반복으로 수행되었다.. 결. 과. FBS 농도별 첨가 배지에서의 세포 관찰상 바이러스를 접종한 MEM0의 EPC 세포에서는 1일째 CPE가 나타나기 시작하여 7 일째 모든 세포가 플라스크 바닥에서 박리 되었다. MEM2, MEM5 및 MEM10의 EPC 세포에서는 접종 2일째 CPE가 나타나기 시작하여 7일째 모든 세포가 플라스크 바닥에서 박리된 것을 확인하였다(Fig. 1). 대조구인 MEM0, MEM2, MEM5, MEM10의 EPC 세포는 관찰을 종료한 10 일까지 세포가 잘 성장하고 있었다. 그러나 실험 시 동일한 량 의 세포를 접종했음에도 불구하고 MEM0와 MEM2에서 보다. Fig. 3. Production of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in EPC cells which were cultured with minimum essential medium (MEM) supplemented with 0, 2, 5 and 10% (v/v) FBS (MEM0, MEM2, MEM5 and MEM10). FBS, feral bovine serum; TCID50, 50% tissue culture infectious dose.. MEM5와 MEM10의 EPC 세포가 확실히 더 많이 증식했음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).. 바이러스 감염가 비교 VHSV를 접종한 후 0, 1, 3, 5, 7 및 10 일째 세포배양 상층액 을 수거하여 바이러스의 감염가를 측정한 결과 모든 실험구에 서 3일째에 급격히 증가하여 MEM0를 제외한 실험구에서 108 TCID50/mL 이상의 감염가를 보였으며, 7일째까지 감염가를 유 지하였다. 10일째에는 감염가가 106.63-107.22 TCID50/mL까지 다소 하락하는 것이 관찰되었다 (Fig. 3). 실험구 중에서 MEM0 의 EPC 세포에 VHSV를 접종한 실험구는 1, 3, 5, 7일째에 다른 실험구에 비해 가장 낮은 감염가를 보였으며, 5일째의 MEM0 의 감염가는 MEM5의 감염가에 비해 10배 이상 낮았다.. 고. 찰. 바이러스는 숙주에 기생하여 증식하기 때문에, 어류의 바이러 스 질병을 연구하기 위해서 원인이 되는 바이러스를 분리 및 증 식시킬 수 있는 주화세포가 필수이다. VHSV가 성장할 수 있는 어류 주화 세포는 블루길 Lepomis macrochirus 기원인 bluegill fry (BF-2) 세포, 연어과 어류 기원인 rainbow trout gonad (RTG-2) 세포 및 chinook salmon embryo (CHSE-214) 세포 가 있으며, 잉어과 어류 기원인 fathead minnow (FHM) 세포와 epithelioma papulosum cyprinid (EPC) 세포가 있다(Olesen and Vestergård Jørgensen, 1992; Lorenzen et al., 1999; OIE, 2017). 위 세포 중에서 국내에 발생하는 유전자형인 VHSV IVa 의 배양에는 EPC 세포가 가장 적합하다고 알려져 있다(OIE, 2017). 따라서 본 연구에서 EPC 세포를 사용하여 바이러스의.

(4) 세포배양 배지 내 FBS 농도에 따른 VHSV 증식. 증식실험을 실시하였다. 주화세포는 영양 상태, 계대 주기 및 횟수에 따라 바이러스의 증식에 영향을 미칠 수 있다. 세포를 계대하고 증식시킬 때는 보 편적으로 10%의 FBS가 첨가된 배지를 사용하지만, 바이러스 를 증식시키는 경우에는 연구자에 따라 2% FBS가 첨가된 배지 를 사용하는 경우도 있다(Moreno et al., 2014). FBS는 세포의 영양 상태에 영향을 미치기 때문에, 바이러스의 감염가에도 차 이를 나타낼 수 있으므로 이를 표준화할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 FBS의 농도가 바이러스 증식에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 MEM0, MEM2, MEM5 및 MEM10 배지에 배양된 EPC 세포에 VHSV를 접종하여 바이 러스 감염가의 변화를 관찰하였다. 또한, VHSV 접종 후 바이러 스를 수거하는 시기에 있어서도 연구자마다 다소 차이를 나타 내고 있어 이에 대해서도 표준화할 필요가 있기에 본 연구에서 는 VHSV를 세포에 접종 후 7-10일 동안 관찰하도록 하는 OIE (2017)의 권고에 따라 10일 동안 지속 관찰하였다. VHSV 감염가의 변화를 관찰했던 총 10일의 기간 중에서 바 이러스를 접종한 직후인 0일째를 제외하면 FBS가 첨가되지 않 은 MEM0 실험구에서는 가장 낮은 바이러스 감염가를 나타냈 으나, FBS가 포함된 MEM2, MEM5 및 MEM10 실험구 간의 비교 관찰에서는 유의적인 차이 없이 높은 감염가를 나타냈다. 이러한 결과로 보아 일반적으로 사용하는 10%가 아닌 2% FBS 농도만으로도 충분히 VHSV를 증식시킬 수 있으므로 바이러 스의 증식을 많이 필요로 하는 다양한 실험에서 고가의 FBS 사 용에 대한 부담을 경감시킬 수 있는 결과라고 사료된다. 바이러스의 감염가는 7일째까지 높게 유지되다가 10일째에 감염가가 다소 하락하는 것으로 관찰되었다. 이러한 감염가의 변화에 대한 이유는 바이러스를 접종한 EPC 세포가 CPE에 의 해 탈락한 시기가 7일째였다는 것과 바이러스의 감염가가 감소 되기 시작하는 날짜가 7일째로 일치된다는 것으로 보아, 이는 살아 있는 세포가 더 이상 없는 관계로 바이러스 증식이 일어 나지 못한 결과로 추정된다. VHSV의 수거 시기에 있어 7일째 FBS가 포함된 모든 실험구에서 감염가가 모두 동일하게 나타 났으나, 10일째 다소 낮아지는 경향을 나타내 바이러스 접종 후 7일 이내로 세포배양 상층액으로부터 바이러스를 수거하는 것 이 바람직하다고 판단된다. 결론적으로 이번 연구를 통하여 FBS가 세포의 배양 상태뿐 만 아니라 VHSV의 증식에 영향을 미치는 것을 알 수 있었으 며, 특히 증식을 위한 실험에 높은 농도의 FBS를 사용할 필요 가 없다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 날짜 별 감염가 측정 실 험을 통해 바이러스를 수거하기 위한 적절한 시기가 세포가 완 전히 떨어져 나가기 전이라는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험에 서는 VHSV에 대해서만 연구를 진행하였으나 차후 다른 어류 바이러스에 대해서도 FBS에 대한 영향을 확인해 볼 필요가 있 을 것으로 생각된다.. 사. 45. 사. 이 연구는 국립수산물품질관리원의 지원에 의해 수행되었습 니다.. References Ahn SJ, Cho MY, Jee BY and Park MA. 2013. Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolate from Asia. J Fish Pathol 26, 149-161. http://dx.doi. org/10.7847/jfp.2013.26.3.149. Basurco B and Benmansour A. 1995. Distant strains of the fish rhabdovirus VHSV maintain a sixth functional cistron which codes for a nonstructural protein of unknown function. Virol J 212, 741-745. https://dx.doi.org/10.1006/viro.1995.1534. Cano I, Collet B, Pereira C, Paley R, Aerle RV, Stone D and Taylor NGH. 2016. In vivo virulence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss correlates inversely with in vitro Mx gene expression. Vet Microbiol 187, 31-40. https://dx.doi.org/10.1016/j. vetmic.2016.02.012. Einer-Jensen K, Ahrens P, Forsberg R and Lorenzen N. 2004. Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus. J Gen Virol 85, 1167-1179. https://dx.doi. org/10.1099/vir.0.79820-0. Gstraunthaler G. 2003. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. ALTEX 20, 275-281. Kim HJ. 2015. Validation of the sensitivities of one-step and twostep reverse-transcription PCR methods for detection of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) IVa isolates from cultured olive flounder in Korea. Aquaculture 448, 359-364. https://dx.doi.org/10.1016/j.aquaculture.2015.06.034. Kim HJ, Park JS, Choi MC and Kwon SR. 2016. Comparison of the efficacy of Poly(I:C) immunization with live vaccine and formalin-killed vaccine against viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Fish Shellfish Immunol 48, 206-211. https://dx.doi. org/10.1016/j.fsi.2015.11.035. Kim MS, Kim KH. 2011. Inhibition of viral hemorrhagic septicemia virus replication using a short hairpin RNA targeting the G gene. Arch Virol 156, 457–464. https://dx.doi. org/10.1007/s00705-010-0882-y. Kim MS, Park JS and Kim KH. 2015. Generation of G genedeleted viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and evaluation of its vaccine potential in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Fish Shellfish Immunol 45, 666-671. https://dx.doi.org/10.1016/j.fsi.2015.05.031. Lorenzen E, Carstensen B and Olesen NJ. 1999. Inter-laboratory comparison of cell lines for susceptibility to three viruses: VHSV, IHNV and IPNV. Dis Aquat Org 37, 81-88. https:// dx.doi.org/10.3354/dao037081. Moreno P, Olveira JG, Labella A, Cutrin JM, Baro J, Borrego JJ.

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