Redifferentiation Effects of Troglitazone in Human Thyroid Cancer Cell Lines

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서 론

대부분의 분화 갑상선암 환자는 적절한 외과수술과 수술 후 방사선 동위 원소 치료나 TSH 억제 요법으로 치료가 가 능하다.(1) 그러나 일부에서는 병의 진행 과정에서 탈분화 (dedifferentiation)를 통해 분화된 기능을 소실한다. 이렇게 분화 기능을 소실한 갑상선암의 경우는 보통 생물학적 종 양의 특성이 공격적으로 변하여 빠른 성장이나 주위 조직 으로의 침윤이 증가하는 경향을 보인다. 또한 이런 종양은 분화된 갑상선 기능에 의존하는 기존의 효과적인 술 후 요 법인 방사선 동위 원소 치료나 TSH 억제 요법에 저항성이 높아진다. 따라서 이들 종양에서 약물 치료를 통해 분화된 기능을 회복시킬 수 있다면, 그 치료는 종양의 성장을 둔화 시킬 뿐 아니라 다시 한 번 기존의 치료를 효과적으로 만들 어줄 수 있을 것이다.(1,2) 실제 이런 목적으로 여러 가지 약제(redifferentiating agents)들이 소개되었다. 갑상선암에서 는 retinoids (all-trans retinoic acid (RA), 9-cis RA, 13-cis RA) 와 aromatic fatty acids (phenylacetate, phenylbutyrate)가 대표 적이다.(3,4) 이들 약제는 갑상선 암 세포주에서 세포성장을 억제하고, 분화된 기능을 회복시켰지만, 임상적 유용성이란 측면에서는 실망스러운 결과를 보여주었다.(5) 따라서 보다 효과적인 새로운 분화 요법의 개발이 필요한 것이다.

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) 는 ligand에 의해 활성화되는 transcription factor로, 암세포의 성장과 분화에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고된다. 여 러 보고를 통해, 강력한 PPARγ의 촉진제인 troglitazone이 인체 여러 암세포의 성장을 억제하는 것은 잘 알려져 있으 나,(6-8) 저자들이 살펴본 바에 의하면, troglitazone의 분화 유도 효과에 관한 연구는 아주 적고,(9,10) 특히 갑상선암 세포에서는 전무하였다.

저자들은 본 연구를 통하여 troglitazone이 갑상선암 세포

갑상선암 세포주에서 Troglitazone의 분화 유도 효과

충북대학교 의과대학 외과학교실, ¹청주성모병원 외과, ²Department of Surgery, University of California, San Francisco 박종찬․류동희¹․박진우․Orlo H. Clark²

Redifferentiation Effects of Troglitazone in Human Thyroid Cancer Cell Lines

Jong-Chan Park, M.D., Dong-Hee Ryu, M.D.¹, Jin-Woo Park, M.D. and Orlo H. Clark, M.D.²

Purpose: Troglitazone is a potent agonist for the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ), which is a ligand-activated transcription factor that regulates cell differentiation and growth. Antiproliferative effects of troglitazone have been reported in several human cancers including thyroid cancer. In the present study, we evaluated the redifferentiation effects of troglitazone in human cancers regarding the modulation of CD97 and sodium-iodide symporter (NIS) gene expression.

Methods: We used 3 human thyroid cancer cell lines: TPC-1 (papillary), FTC-133 (follicular), and XTC-1 (Hürthle). Surface expression of CD97, a novel dedifferentiation marker, was measured by flow cytometry. mRNA expression of NIS gene was measured by real time quantitative PCR using TaqMan probe.

Results: Troglitazone down-regulated the surface expression of CD97 in FTC-133 cells and up-regulated (NIS) mRNA in TPC-1, FTC-133 and XTC-1 cells.

Conclusion: Our investigations documented that troglitazone, a PPARγ agonist, induced redifferentiation in thyroid cancer cell lines. In patients who have poorly differentiated thyroid cancer unresponsive to traditional treatments, PPARγ ago- nists may therefore reintroduce the effectiveness of tra- ditional treatments. (J Korean Surg Soc 2004;67:93-99) Key Words: Peroxisome proliferator-activated receptors

(PPAR), Redifferentiation, CD97, Sodium-iodide symporter

중심 단어: Peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR), 재분화, CD97, Sodium-iodide symporter

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Department of Surgery, College of Medicine Chungbuk National University, Cheongju, Korea, ¹Department of Sur- gery, St. Mary's Hospital, Cheongju, Korea and ²Department of Surgery, University of California, San Francisco, USA

책임저자 : 박진우, 충북 청주시 흥덕구 개신동 62번지 ꂕ 361-711, 충북대학교 병원 외과

Tel: 043-269-6033, Fax: 043-266-6037 E-mail: [email protected]

접수일：2004년 3월 3일, 게재승인일：2004년 5월 27일

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상선암 세포주를 이용하여 troglitazone 치료 전후의 CD97 (탈분화의 표식자)의 세포 표면 발현과 sodium-iodide symporter (NIS) 유전자의 mRNA 발현을 관찰하였다.

방 법

1) 재료

세포 배양액은 Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM): F12 media, l-glutamine, penicillin-streptomycin, fetal calf serum (FCS), fungizone 등을 이용하여 만들었다(Irvine Scientific, Santa Ana, CA). FITC-conjugated anti-CD97 mouse monoclonal antibody는 Serotec Inc. (Raleigh, NC)으로부터, troglitazone은 BIOMOL Research Laboratories, Inc. (Plymouth Meeting, PA)으로부터 구매하여 사용하였다. Troglitazone은 100% ethanol에 녹인 뒤, 세포 배양액으로 농도를 조절하였 다. 최종 세포 배양액에서의 ethanol 농도는 0.1% (vol/vol) 미만이 되게 하였다.

2) 세포주 및 배양 조건

갑상선 유두암 세포주(TPC-1)는 Dr. Nabuo Satoh (Japan) 로부터, 갑상선 소포암 세포주(FTC-133)와 Hürthle 세포주 (XTC-1)는 Dr. Peter Goretzki (Germany)로부터 기증 받아 사 용하였다.(11,12)

세포주는 DMEM-12에 10% FCS, penicillin (50μg/ml), streptomycin (10,000 U/ml), fungizone (250 ng/ml), 갑상선 자 극호르몬(TSH, 10 mU/ml), glutamine (12.5 mg/L), insulin (0.01 mg/ml)을 첨가한 배양액을 사용하여 표준가습배양기 에서 37^oC, 5% CO2, 95% O2 환경하에서 배양하였다. 모든 실험에는 혈청을 포함시키지 않은 상기의 DMEM-12 배양 액에 4가지 호르몬을 추가한 H5-배양액을 사용하였다;

transferrin (5μg/ml), SRIF (10 ng/ml), glycyl-l-histidyl acetate (2 ng/ml), hydrocortisone (0.36 ng/ml). 배양액은 실험 시작 24시간 전에 H5-배양액으로 바꾸어 주었다.

3) 세포 표면의 CD97 염색 및 유세포 분석

FITC-conjugated anti-CD97 mouse monoclonal antibody (BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA) 를 이용하여 직접 세포 표면의 CD97에 대한 면역 형광 염 색을 시행하였다. 대조군과 troglitazone 치료군으로 나누어, 각각 FTC-133 세포 1×10⁶/ml개를 얻어, 차가운 PBS로 두 번 씻어내었다. 원침하여 상층액을 버리고 10μl의 FITC- conjugated anti-CD97 antibody를 첨가하여 30분 동안 반응시 켰다. 0.1% sodium azide를 첨가한 PBS로 두 번 씻은 뒤, 윈 침하여 상층액을 제거하고 PBS 1 ml로 재부유하고 propidium iodide 10μl를 추가하여 유세포 분석을 시행하였다. 유 세포분석은 시료가 준비되는 대로 바로 시행하였다. Becton

Dickinson사의 FACScan을 이용하였고, 데이터 분석은 CELLQuest software를 이용하였다. 분석 대상의 선정은 gating을 이용하였는데, 세포의 크기와 granularity를 기준으 로 살아 있는 세포를 일차적으로 선정한 뒤, 이들 중 propidium iodide 염색이 되는 죽은 세포를 제외시켰다. 유세 포 분석은 최소 10,000 events (cells) 이상을 시행하였다.

4) 실시간 정량적 PCR (Real-time quantitative PCR) 갑상선 소포 세포에 의한 요오드 유입에는 sodium-iodine symporter (NIS)와 Pendrin (PDS)이 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 이들 NIS와 PDS의 유전자 발현을 real-time quantitative PCR을 통해 정량화하였다. GUS 유전 자를 내부 대조(endogenous control)로 사용하였다. 6-well plates를 이용하여 갑상선암 세포주를 10 mU/ml의 TSH를 첨가한 H5-배양액에서 여러 농도의 troglitazone에 72시간 동안 노출시켰다. 노출 후 PBS로 3회 세척 후에, 전체 RNA 추출, cDNA 합성, real-time quantitative PCR은 기존의 보고 된 방법을 따랐다.(13) 모든 primers와 probes는 Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA)에서 구매하였으며, probes는 TAMRA (Rhodamin) moieties를 포함하는 것으로 설계하였 다. 사용한 primers와probes는 다음과 같다. NIS Forward primer: 5'-CCATCCTGGATGACAACTTGG-3', NIS Reverse primer: 5'-AAAAACAGACGATCCTCATTGGT-3', NIS Probe:

5'-AGAACTCCCCACTGGAAACAAGAAGCCC-3'. PDS For- ward primer: 5'-CATCAAGACATATCTCAGTTGGACCT-3', PDS Reverse primer: 5'-ACAGTTCCATTGCTGCTGGAT-3', PDS Probe: 5'-TCTGAGCATGGCCCCCGACG-3'. GUS For- ward primer: 5’-CTCATTTGGAATTTTGCCGATT-3’, GUS Reverse primer: 5’-CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA-3’, GUS Probe: 5’-TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG-3’. 96-well plates 사용하였고, ABI Prism 7,700 Sequence Detector (Perkin- Elmer Corp./PE Applied Biosystems)를 이용하였다. 각 조건 을 triplicate하여 실험을 시행하였다. PCR 산물의 분석 조건 은 95ôC에서 12분 동안 둔 뒤, 45회 동안 95ôC 15초 후 60ôC 1분의 과정을 되풀이하게 하였다. 최종적으로 정량화는 comparative CT method를 이용하였으며, 상대적 전사(relative transcription) 또는 대조군에 대한 상대적 차이를 n- 배수로 표시하였다.

5) 통계적 방법

유세포 분석에 의한 CD97의 발현은 Kolmogorov-Smirnov test for flow cytometric data를 이용하였고, real-time quantitative PCR을 통해 정량화한 mRNA 발현의 다중 비교는 ANOVA test를 사용하였다. 통계적 유의성 검정은 P＜0.05 를 기준으로 하였다.

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결 과

1) Troglitazone 치료 후의 CD97 발현 변화

Troglitazone 치료에 의한 CD97 발현의 변화를 관찰하기 위해, FITC가 결합된 항-CD97 항체로 면역 형광 염색을 시 행한 후, 유세포 검사로 세포 표면에서의 CD97 발현을 확 인하였다. 유세포 분석 시, 죽은 세포에 의한 결과 왜곡을 방지하기 위해, 세포 크기와 과립(cell size/granularity, R1) 뿐 아니라 PI 염색(R2)을 통해 분석할 세포를 선별하였다.

대조군 배양에서 갑상선암 세포주 TPC-1, FTC-133, XTC-1 모두에서 CD97의 과발현을 관찰할 수 있었다. FTC-133 세 포주를 4일 동안 각각 2.5, 5, 10 microM의 troglitazone으로

치료한 결과, CD97의 세포 표면 발현이 치료 농도에 비례 하여 감소하는 것을 관찰하였다(P＜0.05)(Fig. 1). 다른 세포 주에서는 그 변화가 미미하였다.

2) Troglitazone 치료 후의 NIS, PDS 유전자 발현 변화 Troglitazone 치료가 갑상선암 세포에서 요오드의 이동에 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위해, 능동적 요오드 이 동에 관여하는 것으로 알려진 NIS와 PDS 유전자의 mRNA 발현 변화를 real-time quantitative PCR의 방법으로 알아보았 다. Troglitazone 치료 후의 NIS와 PDS 유전자의 mRNA 발 현(Exp NIS or Exp PDS)을 대조군의 mRNA 발현에 대한 상대적 비율(the n- fold difference)로 표시하였다(Table 1).

Troglitazone 치료는 TPC-1과 FTC-133 세포주에서 유의하게

Fig. 1. Change in expression of CD97 after 4 days of treatment with troglitazone (TGZ) in FTC-133 cells. Expression of CD97 on the cell surface was downregulated by troglitazone in a dose-dependent manner.

0 0

0

1000 100

100

1000

SSC-H Counts

Counts

FSC-H FL3-H

FL1-H

TGZ 10 uM Isotype

TGZ 5 uM TGZ 2.5 uM

Control Live

R2

Dead

0 0

0

800 600

400 200

R1

10¹

10¹ 10²

10² 10³ 10⁴

800 80

80

600 60

60

400 40

40

200 20

20

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NIS 유전자의 mRNA 발현을 증가시켰으나(P＜0.05), XTC- 1 세포주에서는 큰 차이가 없었다. PDS 유전자의 mRNA 발 현은 troglitazone 치료에 의해 유의한 변화를 보이지 않았 다. Troglitazone을 녹이는 데 사용된 농도의 ethanol은 NIS 또는 PDS 유전자의 mRNA 발현에 유의한 변화를 초래하지 않았다(Date not shown).

고 찰

기존의 보고들을 통해, PPARγ 촉진제인 troglitazone이 유 방암, 방광암, 전립선암 등 인체 여러 암 세포주에서 암세포 의 증식을 억제한다는 것이 잘 알려져 있다.(6-8) 갑상선 세 포주를 이용한 실험에서도, troglitazone은 세포소멸과 세포 주기의 변화를 유도하여 갑상선 암 세포주의 증식을 억제 하였다.(14-16) 그러나 troglitazone의 인슐린 감수성 증가 이 외의 효과로 처음 보고된 것이 지방 세포의 분화 유도 효과 이였음에도 불구하고, 실제로 인체 암에서 troglitazone의 분 화 유도 효과는 그 보고가 드문 편이다.(9,10) 저자들의 문 헌 조사에 의하면 갑상선 암에서 troglitazone의 분화 유도 효과는 아직 보고된 바 없다. 본 연구를 통해 저자들은 갑상 선암 세포주에서 PPARγ 촉진제인 troglitazone이 탈분화의 표식자인 CD97 발현을 감소시키고, 분화의 표식이 되는 NIS 유전자 발현을 증가시키는 것을 관찰하여, 이를 troglitazone에 의한 분화 유도의 증거로 보고하는 바이다.

갑상선암의 발생과 진행에 관하여 여러 가지 설명이 있 지만, 여러 단계의 유전자 변형을 거쳐 암이 발생하고, 여기 에 다른 유전자 변형이 축적되면서 최종적으로는 인체의 가장 무서운 질병 중 하나인 미분화 갑상선암으로 진행하 는 것으로 생각한다. 최근 이러한 다단계의 갑상선 종양 발

생 모델의 한 단계로 생각되는 새로운 유전자 변형이 관찰 되었는데, 이 것이 PPARγ 유전자 변형이다. PPAR은 핵형 호르몬 수용체(nuclear hormone receptor superfamily)에 속하 는 전사 인자의 하나로 -α, -δ, -γ의 세 가지 isoform이 존 재하는데, 이 중 특히 PPARγ는 세포 증식의 억제와 분화 유도의 기능을 하는 것으로 추정된다. PPARγ는 ligand에 의존하는 전사 인자로 retinoid 수용체의 하나인 RXRα와 결합하여 heterodimer를 형성한 뒤, 유전자의 특정 반응부위 (PPRE)에 결합하여 전사 과정을 활성화하게 된다. 그동안 많은 PPARγ 촉진제(agonist)가 소개되었는데, 새로 개발된 thiazolidinedione (TZD) 계열의 당뇨 치료제인 troglitazone, pioglitazone, rosiglitazone 등도 강력한 PPARγ 촉진 기능을 가지고 있다. 최근의 연구를 통해, 이들 TZD 계열의 약제들 이 여러 인체 암에서 암세포의 증식을 억제한다는 것이 알 려졌다.(6-8)

갑상선암의 발생과 진행에 있어서도, 최근 Kroll 등(17)이 PPARγ 유전자 변형이 갑상선 소포암 발생에 관여할 수 있 다는 증거를 제시하였다. Kroll 등의 보고에 의하면, 염색체 전위(chromosomal translocation)에 의해 PAX8-PPARγ1이라 는 이상 단백질이 형성되는데, 이것이 정상 PPARγ의 기능 을 억제한다는 것이다. 초기의 발표와 달리, PAX8- PPARγ 염색체 전위는 갑상선 소포암에서만 관찰되지 않고, 일부 양성 소포성 종양에서도 관찰된다.(18) 뿐만 아니라, Aldred 등(19)은 기능적인 PPARγ 발현의 저하가 갑상선 유두암이 나 휘틀 세포암의 발생에도 관여한다고 주장하였다. 일반 적으로 PPARγ 염색체 전위를 보이는 갑상선 소포암은 염 색체 전위가 없는 암에 비해 보다 공격적인 생물학적 특성 을 보인다.(20)

이러한 여러 정황으로 미루어 보아, 모든 환자에서 일어 Table 1. Sodium/iodide and pendrin gene expression in thyroid cancer cell lines in response to troglitazone using quantitative real time

RT-PCR

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SD SD

Treatment CT CT CT δδCT EXP δδCT Exp

Cell line δδCT Range δδCT Range

(μM) GUS NIS PDS NIS NIS PDS PDS

NIS PDS

FTC-133 0.0 35.8 45.0 30.4 0.0 0.4 1.0 0.8∼1.4 0.0 0.5 1.0 0.8∼1.5

2.5 36.1 43.6 31.0 -1.7 1.4 4.1 1.0∼5.8 0.3 0.2 0.8 0.7∼0.8

5.0 36.9 38.5 31.5 -7.7 1.6 273.3 60.1∼441.6* -0.1 0.7 1.1 0.6∼1.4

TPC-1 0.0 34.4 37.2 27.2 0.0 0.5 1.0 0.7∼1.5 0.0 0.1 1.0 0.9∼1.1

2.5 36.5 36.1 29.8 -3.2 1.7 13.2 2.6∼22.1 0.6 0.9 0.7 0.3∼1.1

5.0 36.5 35.3 29.3 -4.1 0.6 18.5 14.6∼28.5* 0.0 0.4 1.1 0.8∼1.4

XTC-1 0.0 35.5 35.1 29.8 0.0 0.6 1.1 0.7∼1.6 0.0 0.2 1.0 0.9∼1.1

2.5 35.0 34.5 29.0 0.0 0.3 1.0 0.8∼1.3 -0.2 0.3 1.1 0.9∼1.3

5.0 34.9 34.2 29.4 -0.2 0.1 1.2 1.1∼1.3 0.3 0.4 0.8 0.6∼1.0

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ The CT values of the GUS, NIS and PDS genes are averages of 3 triplicate runs. The difference in gene expression δδCT is relative to untreated cells with its associated SD δδCT. Gene expression (Exp NIS or Exp PDS) and range of expression are calculated as 2-(δδCT).

GUS = beta-glucuronidase; NIS = sodium/iodide; PDS = pendrin. *P＜0.05.

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전자 변형이 중요한 역할을 할 것이라는 점은 의심의 여지 가 없다. 따라서 갑상선암의 치료라는 측면에서 볼 때, PPARγ는 새로운 치료의 목표로서 좋은 후보가 될 수 있다.

실제로 Ohta 등(14)은 시험관 내 실험과 동물 실험을 통하 여, PPARγ 촉진제인 troglitazone이 일련의 갑상선 유두암 세포주의 증식과 종양의 성장을 억제할 수 있음을 보고하 였다. 또한 Martelli 등(15)은 PPARγ를 발현하지 않는 갑상 선암 세포에 PPARγ 유전자를 새로이 도입함으로써, 세포 성장을 억제하였고, PPARγ 촉진제의 효과를 높일 수 있었 다. 저자들도 여러 조직학적 유형에서 유래한 갑상선 세포 주를 이용하여, troglitazone의 증식 억제 작용을 확인하고, 그 기전이 세포 소멸의 유도와 세포주기의 정지에 있음을 보고하였다.(16)

대부분의 분화 갑상선암의 예후는 매우 우수하나, 이들 중 일부가 탈분화를 통해 분화가 나쁜 또는 미분화 상태의 갑상선암으로 진행하게 된다. 이 경우 급속한 병의 진행이 나, 기존 치료에 대한 저항 등의 문제로 환자의 예후가 매우 불량해지고, 현실적으로 효과적인 치료할 수 없다는 점을 고려한다면, 암세포를 죽이는 치료뿐 아니라, 암세포의 분 화된 특성을 회복시켜주는 치료(분화 유도 요법) 또한 많은 도움을 줄 수 있을 것이다. 저자들의 조사에 의하면, 갑상선 암에서 분화 유도제로서의 PPARγ 촉진제의 효과는 보고 된 바 없다.

저자들은 먼저 갑상선암 세포의 세포 표면 항원 중 탈분 화의 표식자로 알려진 CD97의 발현이 troglitazone 치료에 의해 어떤 변화를 보이는지를 살펴보았다. CD97은 백혈구 가 활성화될 때 발현되는 항원으로, 그 유전자는 19번 염색 체(19p13.12-13.2)에 존재한다. CD97은 독특한 구조를 지니 고 있어 세포 부착과 이에 따른 신호전달에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다.(21) CD97은 대개 혈액 세포(myelo- monocytic cells)에서 구성적으로 강하게 발현되지만, 다른 세포 유형에서도 발현될 수 있다.(22) Aust 등(23)은 갑상선 종양에서의 CD97 발현을 보고하면서, 이것이 갑상선 종양 의 탈분화의 민감한 표식자가 될 수 있다고 주장하였다.

Hoang-Vu 등(24)은 유지 배양 조건에서 본 실험에 사용된 FTC-133 세포주의 CD97 발현을 보고하였다. 세포주를 이 용하여 CD97 발현의 변화를 관찰한 기존의 실험을 통해, EGF (epidermal growth factor) 투여는 CD97 발현을 증가시 키며, phorbol 12-myristate 13-acetate나 retinoic acid 투여는 CD97 발현을 감소시키는 것을 알 수 있었다. TSH, forskolin, insulin 등의 치료는 CD97 발현에 영향을 미치지 않았 다.(23,24) 저자들은 FTC-133 세포주에서 CD97이 구성적으 로 발현됨을 관찰하였고, troglitazone 치료 농도에 비례하여 CD97 발현이 감소함을 관찰하였다. CD97이 갑상선암의 탈 분화 표식자라는 점을 상기한다면, troglitazone 치료에 의한 CD97 발현의 감소는 troglitazone 이 갑상선 암 세포주의 재

분화를 유도한 간접적인 증거가 될 수 있겠다. 갑상선 암 세포의 CD97 발현의 의미는 앞으로도 많은 연구가 필요하 겠다.

갑상선 암에서 분화 유도 요법의 목표는 먼저 암의 생물 학적 특성을 변화시켜 성장을 억제한다는 측면과, 분화된 갑상선 기능에 의존하는 기존의 효과적 치료법, 즉 방사선 요오드 치료와 TSH 억제 치료를 다시 한번 효과적인 치료 가 되도록 하는 데 있다. 이런 측면에서 troglitazone 치료에 의한 갑상선암 세포의 요오드 흡수 능력의 변화를 측정하 는 것은 매우 의미 있는 일이다. 궁극적으로는 갑상선암 세 포의 요오드 흡수 능력 자체를 직접 측정하는 것이 바람직 하나, 여러 가지 측정의 기술상의 문제로 본 연구에서는 요 오드 흡수 과정에 관여하는 두 가지 중요한 유전자의 발현 변화를 측정하였다. NIS 유전자는 갑상선 소포 세포에서 요 오드를 능동적으로 세포 내로 들여오는 데 중요한 역할을 하며, PDS 유전자는 이렇게 흡수된 요오드를 소포 내로 배 출하는 기능을 수행한다.(25) 본 연구에서 저자들은 TSH를 배양액에 추가하여 사용하였는데, 이것은 Riedel 등(26)이 TSH가 NIS 유전자의 전사 후 조절(post-transcriptional regulation)에 매우 중요하다고 보고한 데 기인하였다. Troglitazone 치료는 갑상선 세포주 TPC-1과 FTC-133에서 NIS mRNA 발 현을 유의하게 증가시켰으나, XTC-1 세포주에서는 그 효과 가 뚜렷하지 않았다. Troglitazone 치료는 PDS mRNA 발현 에는 유의한 변화를 가져오지 않았다. 향후 NIS 유전자 발 현 증가의 기전에 대한 연구가 더 필요하겠으나, 저자들은 본 연구를 통해 troglitazone 치료가 NIS 유전자 발현 증가를 통해 갑상선암 세포의 방사성 요오드 흡착을 증가시킬 수 있는 가능성을 제시하였다.

최근 인체 여러 암을 대상으로 PPARγ 촉진제를 이용한 임상 연구가 진행 중이며, 몇 종류의 인체 암에서는 임상 시험의 결과가 보고되었다. Troglitazone은 지방 육종(lipo- sarcoma) 환자에서 조직학적 분화를 유도하였고,(27) 전립 선암 환자에서 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen)의 감소를 유도하였다.(28) 그러나 결장 직장암환자에서는 큰 도움이 되지 않았다.(29) 갑상선암 환자를 대상으로 한 임 상 시험은 아직 초기 단계로, 암세포의 사멸뿐 아니라 분화 유도 기능 역시 중요한 치료 효과의 지표로 검정되어야 하 겠다.

결 론

강력한 PPARγ 촉진제의 하나인 troglitazone은 시험관내 실험의 결과, 갑상선 소포암 세포주에서 탈분화 표식자인 CD97의 발현을 감소시키고, 갑상선 유두암 세포주와 갑상 선 소포암 세포주에서 요오드 흡수에 중요한 역할을 하는 NIS 유전자의 mRNA 발현을 증가시켰다. PPARγ 촉진제는 갑상선암 세포의 증식 억제뿐 아니라, 분화 유도의 효과도

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에서 적용이 기대된다.

REFERENCES

1) Mazzaferri EL. An overview of the management of papillary and follicular thyroid carcinoma. Thyroid 1999;9:421-7.

2) Pujol P, Daures JP, Nsakala N, Baldet L, Bringer J, Jaffiol C. Degree of thyrotropin suppression as a prognostic deter- minant in differentiated thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab 1996;81:4318-23.

3) Kebebew E, Wong MG, Siperstein AE, Duh Q-Y, Clark OH.

Phenylacetate inhibits growth and vascular endothelial growth factor secretion in human thyroid carcinoma cells and modu- lates their differentiated function. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:2840-7.

4) Van Herle AJ, Agatep ML, Padua DN 3d, Totanes TL, Canla- pan DV, Van Herle HM, et al. Effects of 13 cis-retinoic acid on growth and differentiation of human follicular carcinoma cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab 1990;71:755-63.

5) Schmutzler C, Köhrle J. Retinoic acid redifferentiation therapy for thyroid cancer. Thyroid 2000;10:393-406.

6) Elstner E, Muller C, Koshizuka K, Williamson EA, Park D, Asou H, et al. Ligands for peroxisome proliferator-activated receptor gamma and retinoic acid receptor inhibit growth and induce apoptosis of human breast cancer cells in vitro and in BNX mice. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:8806-11.

7) Guan YF, Zhang YH, Breyer RM, Davis L, Breyer MD. Ex- pression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) in human transitional bladder cancer and its role in inducing cell death. Neoplasia 1999;1:330-9.

8) Kubota T, Koshizuka K, Williamson EA, Asou H, Said JW, Holden S, et al. Ligand for peroxisome proliferator-activated receptor gamma (troglitazone) has potent antitumor effect against human prostate cancer both in vitro and in vivo.

Cancer Res 1998;58:3344-52.

9) Hirase N, Yanase T, Mu Y, Muta K, Umemura T, Takayanagi R, et al. Thiazolidinedione induces apoptosis and monocytic differentiation in the promyelocytic leukemia cell line HL60.

Oncology 1999;57(Suppl 2):17-26.

10) Kawa S, Nikaido T, Unno H, Usuda N, Nakayama K, Kiyo- sawa K. Growth inhibition and differentiation of pancreatic cancer cell lines by PPAR gamma ligand troglitazone. Pan- creas 2002;24:1-7.

11) Goretzki PE, Frilling A, Simon D, Roeher HD. Growth regulation of normal thyroids and thyroid tumors in man. Recent Results Cancer Res 1990;118:48-63.

12) Zielke A, Tezelman S, Jossart GH, Wong M, Siperstein AE, Duh Q-Y, et al. Establishment of a highly differentiated thyroid cancer cell line of Hürthle cell origin. Thyroid 1998;

8:475-83.

13) Zarnegar R, Brunaud L, Kanauchi H, Wong M, Fung M, Ginzinger D, et al. Increasing the effectiveness of radioactive iodine therapy in the treatment of thyroid cancer using Tric- ohstatin A, a histone deacetylase inhibitor. Surgery 2002;

132:984-90.

14) Ohta K, Endo T, Haraguchi K, Hershman JM, Onaya T.

Ligands for peroxisome proliferator-activated receptor gamma inhibit growth and induce apoptosis of human papillary thyroid carcinoma cells. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:

2170-7.

15) Martelli ML, Iuliano R, Le Pera I, Sama' I, Monaco C, Cam- marota S, et al. Inhibitory effects of peroxisome poliferator- activated receptor gamma on thyroid carcinoma cell growth.

J Clin Endocrinol Metab 2002;87:4728-35.

16) Park JW, Eigelberger M, Wong MG, Lobo M, Duh QY, Clark OH. Troglitazone inhibits proliferation and induces redifferentiation in thyroid cancer cell lines [abstract FP II-01]. In:

Programs and abstracts of the 8th Congress of the Asian Asso- ciation of Endocrine Surgeons. Seoul, Korea: 2002, p. 103.

17) Kroll TG, Sarraf P, Pecciarini L, Chen CJ, Mueller E, Spie- gelman BM, et al. PAX8-PPARgamma1 fusion in oncogene human thyroid carcinoma. Science 2000;289:1357-60.

18) Cheung L, Messina M, Gill A, Clarkson A, Learoyd D, Del- bridge L, et al. Detection of the PAX8-PPAR gamma fusion oncogene in both follicular thyroid carcinomas and adenomas.

J Clin Endocrinol Metab 2003;88:354-7.

19) Aldred MA, Morrison C, Gimm O, Hoang-Vu C, Krause U, Dralle H, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma is frequently downregulated in a diversity of sporadic nonmedullary thyroid carcinomas. Oncogene 2003;22:3412-6.

20) Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, Alexander EK, Dorn GW 2nd, Tallini G, et al. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in thyroid tumors: evi- dence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 2003;88:2318-26.

21) Hamann J, Eichler W, Hamann D, Kerstens HM, Poddighe PJ, Hoovers JM, et al. Expression cloning and chromosomal map- ping of the leukocyte activation antigen CD97, a new seven- span transmembrane molecule of the secretion receptor superfamily with an unusual extracellular domain. J Immunol 1995;

155:1942-50.

22) Eichler W, Hamann J, Aust G. Expression characteristics of the human CD97 antigen. Tissue Antigens 1997;50:429-38.

23) Aust G, Eichler W, Laue S, Lehmann I, Heldin NE, Lotz O, et al. CD97: a dedifferentiation marker in human thyroid carcinomas. Cancer Research 1997;57:1798-806.

24) Hoang-Vu C, Bull K, Schwarz I, Krause G, Schmutzler C, Aust G, et al. Regulation of CD97 protein in thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:1104-9.

25) Arturi F, Russo D, Bidart JM, Scarpelli D, Schlumberger M, Filetti S. Expression pattern of the pendrin and sodium/iodide symporter genes in human thyroid carcinoma cell lines and

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26) Riedel C, Levy O, Carrasco N. Post-transcriptional regulation of the sodium/iodide symporter by thyrotropin. J Biol Chem 2001;276:21458-63.

27) Demetri GD, Fletcher CD, Mueller E, Sarraf P, Naujoks R, Campbell N, et al. Induction of solid tumor differentiation by the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand troglitazone in patients with liposarcoma. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:3951-6.

28) Mueller E, Smith M, Sarraf P, Kroll T, Aiyer A, Kaufman DS, et al. Effects of ligand activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in human prostate cancer.

Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:10990-5.

29) Kulke MH, Demetri GD, Sharpless NE, Ryan DP, Shivdasani R, Clark JS, et al. A phase II study of troglitazone, an activator of the PPARgamma receptor, in patients with chemotherapy- resistant metastatic colorectal cancer. Cancer J 2002;8:395-9.