이용한 한국인 간내담관암에서의 염색체 변화에 대한 연구

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Comparative Genomic Hybridization 법을

이용한 한국인 간내담관암에서의 염색체 변화에 대한 연구

성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 외과학교실, 한양대학교 의과대학 외과학교실* , 유전학교실* *

최 성 호 , 손 태 성 , 조 재 원 , 김 성 주 허 진 석 , 김 용 일 , 이 광 수 * , 조 율 희 * *

A study on the chromosomal aberrations in Korean intrahepatic cholangiocarcinomas with comparative genomic hybridization

Seong-Ho Choi, M.D., Tae-Sung Sohn, M.D., Jae-Won Joh, M.D., Sung-Joo Kim, M.D., Jin-Seok Heo, M.D., Yong-Il Kim, M.D.,

Kwang-Soo Lee, M.D.*, Youl-Hee Cho, M.D.**

Department of General Surgery, College of Medicine, Sungkyunkwan University, Samsung Medical Center

Department of General Surgery* and Genetics**, College of Medicine, Hanyang University

Abstract A

Aiimmss aanndd MMeetthhoodd :: Comparative genomic hybridization serves as a screening test for regions of copy number changes in tumor genomes. I have applied the technique to map DNA losses and gains in 13 cases of frozen cholangiocarcinomas.

R

Reessuullttss :: All of the 13 cases showed genetic alterations. Loss of short arm of chromosome 19 (92%) was the most common changes observed. 22q(62%), 1p(54%), 17p(54%) and 19q(54%) also showed nonrandom patterns of genomic losses with high frequencies. Among the genomic gains, 13q was revealed as the most common site (69%), and 8q (46%) and 12q (46%) also showed relatively high frequencies of genomic gains. Genomic amplifications were detected on 5p13, 10q21.1 and 18q11.3 in 3 different cases, respectively.

C

Coonncclluussiioonn:: This study represents the first analysis of intrahepatic cholangiocarcinomas by CGH, and it confirms the presence of nonrandom genetic changes occur in the pathogenesis of cholangiocarcinomas. These findings should lead to the characterization of new loci involved in cholangiocarcinoma pathogenesis.

Key Words : Comparative genomic hybridization, Intrahepatic cholangiocarcnoma 색 인 용 어 : 간내담관암, 유전자 비교교잡

Korean Journal of HBP Surgery Vol. 3. No. 2. 1999

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한국간담췌외과학회지Korean Journal of HBP Surgery

서 론

담도계 기원 악성 종양의 90% 정도는 간외 담도계 에 발생하고 간내 담도계에 발생하는 예는 10%정도 에 불과한 것으로 알려져 있는데 이중 낭선암(cys- tadenocarcinoma)은 따로 분류하고 충실성 선암만 을 간내 담관암(intrahepatic cholangiocarcinoma) 이라고 한다.² 간내담관은 주간관의 2차 분지보다 원위부 간측의 담관을 이르며 이에 발생한 예를 말 초형 담관암(peripheral cholangiocarcinoma)으로 분류하고 있다.³

통상적으로 간내 담관암은 간세포암에 이어 두 번 째로 흔한 원발성 간암이라고 하지만 발생빈도는 상당히 낮아서 서양에서는 원발성 간암의 20% 전후 를 차지하고 간세포암이 흔한 지역에서는 10% 미만 을 차지하는 것으로 알려져 있다.^{1, 4}

간내담관암의 발생 요인으로는 간내 결석증,⁵ 간

흡충증,^{6, 7, 8} 낭종성 질환,⁹ 원발성 경화성 담도염,¹⁰

궤양성 대장염, Thorotrast 조영제 사용 및 기타 화 학물질이⁴알려져 있다. 그러나 간내담관암의 발생 과정에 대한 분자 유전학적인 연구는 거의 수행된 바가 없다.

일반적으로 암의 발생은 여러 성장인자, 종양유전 자, 종양억제 유전자 등의 변이를 포함한 다양한 유 전적 변화가 여러 단계의 발암 과정에 축적된 결과 라고 할 수 있다. 지난 20여년 동안 70여종이 넘는 암 유전자와 십 여종의 암 억제 유전자가 발견되었 으며,¹¹이러한 유전자들의 변이가 전암 병변부터 진 행된 암에 이르는 다단계 암화 과정의 전 과정에서 연속적으로 일어나고 축적되는 것으로 알려지고 있

다.^{12, 13, 14}암에서의 유전적 변화를 조사하는 것은 암

의 발생 원인을 이해하는데 도움을 줄뿐 아니라 환 자의 치료 방침 결정 및 예후 판정에도 유용한 것으 로 알려져 있다.

암에서의 유전적 변화를 조사하는 방법으로는 세 포유전학적 방법, 분자유전학적 방법 등이 이용되 고 있다. 세포유전학적 방법은 암 세포를 배양하여 그 염색체 표본을 작성하고 염색체 이상을 분석하 는 방법이다. 이는 암세포의 염색체 전반을 검토할 수 있는 좋은 연구 방법이기는 하지만, 암 세포의 배양을 위해서는 신선한 암을 이용하여야 하기 때 문에 전향적인 연구만이 가능하며 암세포 배양 자

체가 기술적으로 매우 어려우며, 배양 과정에 2차적 인 염색체 이상이 유발될 수 있고, 기원을 알지 못 하는 marker 염색체에 대한 해석이 불가능하다는 단점이 있다.¹⁵ 분자 유전학적인 연구 방법은 종양 조직에서 추출된 DNA나 RNA를 대상으로 유전인 자의 변화 및 발현 정도를 조사하는 방법이다.

DNA를 연구 재료로 이용하는 경우에는 파라핀에 포매된 조직에서도 분석이 가능한 경우도 있어서 후향적 연구도 가능한 장점이 있으나, 대개는 염색 체의 국소적인 부위에 대한 변화만을 조사하게 되 어서 암세포가 가지고 있는 전체적인 변화를 추정 하기에는 부적합한 방법이라고 할 수 있다.

Comparative genomic hybridization(CGH)법은 최근에 개발된 분자세포 유전학적 연구 기법으로 암 조직내의 유전적 변화를 전체 염색체의 각 부위 에서의 DNA의 복제수(DNA copy number)의 증가 (gain) 및 소실(loss)을 분석할 수 있는 방법으로 여 러 인체의 암에서 특정 부위의 유전자의 증가 및 소 실을 손쉽게 분석할 수 있는 방법으로 인정되고 있

다.^{16, 17} CGH법은 기본적으로 서로 다른 두개의 형

광 물질로 표식된 종양 DNA와 정상 DNA를 정상 중기상 염색체에 hybridization 시켜서 정상 DNA에 대한 종양 DNA의 상대적 형광 강도를 측정하여 각 염색체 부위에서의 DNA 복제 수의 증가 및 손실을 측정하는 방법이다. 이러한 CGH 기법의 유용성은 모든 염색체에서 유전자의 변이를 검색하여 새로운 암 유전자나 종양억제 유전자의 위치를 제시할 수 있으며, 또한 기존에 밝혀진 유전자 변이의 역할 및 상호 관계를 쉽게 분석할 수 있는 점이다.

본 연구는 CGH 기법을 이용하여 인체 간내담관 암에서의 유전적 변이를 관찰하여 DNA 복제수의 변이가 빈번한 부위를 제시하고, 이 부위에 대한 기 존의 종양 유전자 및 종양 억제 유전자의 연관성을 밝히고, 더 나아가 간내담관암의 발암 과정에 관여 하는 새로운 유전자의 위치를 제시하고자 한다.

대상 및 방법 1. 대 상

연구 대상은 간내 담관암으로 진단 받고, 간절제 술을 시행받은 환자 13명의 절제 조직을 -70℃에 보 관하여 이용하였다.

(3)

양 성 대 조 군 으 로 는 유 방 암 유 래 세 포 주 인 MPE600 세포주의 DNA를 이용하였으며, 음성 대조 군으로는 정상인의 말초 혈액에서 추출한 DNA를 이용하였다.

2. 방 법

CGH 방법은 Kallioniemi 등¹⁸의 방법을 이용하였 으며, 본 연구에 사용된 시약과 기구는 다음과 같으 며 기타시약은 특등품을 사용하였다.

SpectrumGreen-dUTP (Vysis Inc, USA), SpectrumRed-dUTP (Vysis Inc, USA.), Nick translation kit (Vysis Inc, USA), Human Cot-1 DNA (Vysis Inc, USA), Dextran sulfate (Sigma Inc, USA), Formamide (Sigma Inc, USA), NaCl (Sigma Inc, USA), Trisodium citrate 2H²O (Sigma Inc, USA), Sodium acetate (Sigma Inc, USA), DAPI-II (Vysis Inc, USA), 현미경(Zeiss Axioskop 20, German), 형광필터(Chroma, USA), CCD carmera (resolution 768× 575 pixels, Cohu, USA), Cytovision System Version 2.5 (Applied Imaging Corporation, UK))을 사용하였다.

1) 중기 염색체 표본 제작

헤파린이 처리된 정상인의 말초혈액 0.4ml을 10%

Fetal bovine serum, 0.2% Penicillin-Streptomycin, 2% Phytohemagglutinin-M(PHA-M)이 첨가된 RPMI1640 배지 10ml에 넣어 37℃로 유지된 CO²배 양기에서 72시간동안 배양하였다. 중기상 염색체를 얻기 위하여 배양종료 45분전에 Colcemid(0.02㎍/

㎖)를 처리하였다. 배양된 세포를 1000 rpm으로 원 심 분리한 후 상층액을 버리고 37℃로 유지된 항온 기에서 30분간 0.075M KCl로 처리한 다음 Carnoy’s 고정액으로 3회 고정하였다. 깨끗하게 닦아 차게 보 관해 둔 슬라이드 위에 세포 부유액을 한 두 방울 떨 어뜨려 염색체 표본슬라이드를 만들고 실온에서 말 려 CGH에 이용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

2) 정상인의 림프구와 종양조직에서의 DNA 추출 혈액 내 림프구에서 DNA 분리

Sambrook등¹⁹의 방법에 준하여 다음과 같이 환자 의 말초혈액 10ml을 채혈하여 EDTA로 항 응고 처 리한 후 Lympho-prep 용액(Sigma Inc, USA)으로 림프구를 분리하였다. 분리한 림프구에 TNE 완충 액(100mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM

EDTA pH 8.0, 0.5% sodium dodecyl sulfuate) 동 일양과 proteinase K 용액(20mg/ml) 30-50㎕을 첨 가하여 잘 섞고 50℃에서 2시간 반응하였다. 반응 후 동일 양의 phenol/chloroform/isoamylalcohol 을 첨 가 하 여 약 5분 간 서 서 히 섞 어 주 었 다 . 12,000rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 새 시험관으로 옮기고 RNAase(1mg/ml) 3㎕을 첨가하 여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 다시 동일 양의 phenol/chloroform/isoamylalcohol을 넣은 후 약 5 분간 서서히 섞어주어 원심분리 하였다. DNA가 포 함된 상층액을 새로운 시험관에 옮긴 후 추출 과정 을 2회 반복하였다. 잘 분리된 DNA 용액에 3M sodium acetate 1/10양과 100% ethanol 2배를 첨가 하여 잘 섞어 주었다. DNA 침전을 위해 -70℃에서 30분간 방치한 후 12,000rpm에서 20분간 원심 분 리하여 상층액을 버리고 남은 DNA 침전을 100%

ethanol과 70% ethanol로 순차적으로 세척하였다.

DNA 침전을 진공 원심 건조기로 잘 말린 후 TE 완 충액으로 녹이고 fluorometer(DyNA Quant200, Hoefer, USA)로 정량하고 nick translation을 위하 여 DNA의 양은 100㎍/ml로 조정하였다.

종양조직에서 DNA 분리

냉동 보관하고 있던 종양조직을 petri-dish에 옮겨 녹인 후 수술용 칼로 잘게 절편하였다. 절편된 종양 조직을 phosphate buffer saline (PBS)으로 세척한 후 homogenizer로 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 종양 조직을 2000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액 은 버리고 남은 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세 척된 종양 세포를 15ml 시험관에 옮겨 TNE 완충액 동일 양 과 proteinase K 용액 (20mg/ml) 30-50㎕

을 첨가하여 50℃에서 12시간 방치하였다. 다음의 과정은 혈액에서의 DNA분리법과 동일 하게 시행 하였다.

3) Nick translation을 이용한 DNA 표식 추출한 DNA 1㎍을 이용하여 표식하였다. 얼음에 꽂아 놓은 미세 시험관에 증류수 7.5㎕, 추출한 DNA 10㎕, 0.2mM SpectrumGreen dUTP2.5㎕, 0.1mM dUTP 5㎕, dNTP 혼합액 10㎕, 10X nick translation buffer 5㎕, nick translation enzyme의 반응용액 (Nick translation kit, Vysis)10㎕를 혼합 하였다. 이 혼합액을 15℃에서 2시간 30분, 70℃에

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서 10분간 반응시킨 후 4℃에서 사용할 때까지 보 관하였다. 표식된 DNA의 길이를 확인하기 위해 5

㎕를 1% 한천 겔에 전기 영동하여 적외선 하에서 관찰하였다. 표식된 반응 산물의 길이가 500bp- 5000bp의 길이가 되도록 하여 사용하였다.

종양 DNA 는 SpectrumGreen-dUTP로 표식하고 정상 DNA 는 SpectrumRed-dUTP로 표식하였다.

4) Comparative Genomic Hybridization 과정 준비된 probe의 혼합

SpectrumGreen으로 표식된 종양 DNA 300ng, SpectrumRed로 표식된 정상 DNA 150ng, 10ug Human Cot-1 DNA(Vysis Inc, USA) 10㎕를 1.5 ml 시험관에서 혼합하였다. 이 DNA혼합액에 3M sodium acetate 1/10 양과 100% ethanol 2.5 배를 첨가 하여 잘 섞어 주고, -70℃에서 30분간 침전을 시켰 다. 14000 rpm에서 30분간 원심 분리하고 상층액 을 제거하여 70% ethanol로 세척한 후 침전물을 잘 말렸다. 침전물에 master 용액(0.1% dextran sulfate, 2X SSC, 50% formamide) 10㎕를 첨가하여 잘 섞어주었다. 이 probe 용액을 73℃에서 7분간 변성 시켜 바로 hybridization에 이용하였다.

정상 중기상 염색체와 probe의 hybridization 위상차 현미경으로 슬라이드에서 최적의 중기 염 색체 지역을 선별하여 유리칼로 표시하였다. 중기 염색체 표본을 73℃에서 약3분간 변성시킨 후 70%

ethanol, 85% ethanol, 100% ethanol 순으로 탈수 시키고 공기 중에서 잘 말렸다. 중기 염색체와 준비 된 probe 혼합액을 반응시킨 후 20×20 mm cover- slip을 덮고 Paper-Bond(Kokuyo, Japan)로 주변을 잘 밀봉하여 습기가 있는 37℃의 암소에서 3일간 반응시켰다.

Hybridization 후 슬라이드 세척 과정

3일간 hybridization한 슬라이드를 꺼내어 밀봉된 Paper-Bond를 제거하였다. 슬라이드를 43℃로 유 지된 세척용액-I (50% formamide, 2X SSC)에서 각 각 10분씩 3회, 세척용액-II (2X SSC)에서 10분간 1 회 세척하였다. 이를 상온의 PN buffer (0.1M Na2HPO4 / NaH2PO4)에 10분간 담가두었다. 세척 이 완료된 슬라이드를 증류수에 몇 초간 담근 후 잘 말 렸 다 . Hybridization된 위 치 에 DAPI 용 액 (0.2ug/ml) 10㎕로 염색한 후 20×20 mm coverslip

을 덮었다. Cover -slip주변을 메니큐어로 밀봉시킨 후 하루 밤 동안 암소에서 대조 염색시키고 검경 전 까지 4℃에 보관 하였다.

5) CGH 영상 획득

Cytovision system (Software Version 2.5, Applied Imaging Corp, UK.)에 연결된 CCD cam- era 와 DAPI (Zeiss filter set 02, excitation: G365, beamsplitter: FT 395, emission: LP 420), FITC (Zeiss filter set 10, excitation: BP 450-490, beamsplitter: FT 510, emission: BP 515-565) , TRITC (Chroma filter set HQ Cy3+excitation filter from filter set 15, excitation: BP 546/12, beamsplitter:

FT 565, emission: BP 570-650) 에 적당한 filter가 갖추어진 형광현미경(Axioscope, Zeiss, Germany) 을 이용하여 CGH 영상을 얻었다.

이 후의 영상 분석 과정은 Cytovision system Software Version2.5 (Applied Imaging Corp, UK.) 하에서 분석하였다.

6) 자료 분석

Hybridization이 잘 이루어지고, 염색체가 겹치지 않은 중기상을 선택하여 종양 조직마다 15-20개의 중기상을 분석하였으며, 관찰한 중기상의 평균치를 이용하여 염색체의 소실과 증가를 판정하였다.

결 과

양성 대조군으로 이용한 MPE600 유방암 세포주 의 DNA를 CGH법으로 분석한 결과 MPE600 세포 주가 가지고 있는 것으로 알려진 9p, 16q 및 11q 말 단의 소실과 1q의 증가를 확인할 수 있었다. 이로서 CGH 는 매우 민감한 실험 방법이며, 실험 과정이 잘 수행되고 있음을 확인할 수 있었다.

CGH를 시행한 13예의 간내 담관암 모두에서 이 상 소견을 관찰 할 수 있었다. 대표적인 1예의 사진 을 (Fig. 1) 에 제시하였다. (Fig. 1(A)) 는 3가지 형 광 색조의 합성 영상으로 초록색조는 종양 DNA의 overrepresentation을 나타내고, 붉은색조는 under- representation을 나타낸다. 동원체와 heterochro- matin 부위는 DAPI 대조 염색에 의하여 연한 푸른 색조로 염색되어 보인다. (Fig. 1(B)) 는 DAPI 대조 염색에 의한 G-banding 양상을 보여주고 있다.

(Fig. 1(C)) 는 각 염색체에 대한 FITC와 Teas Red

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Fig. 1 A typical example of comparative genomic hybridization analysis(case No.11).

(A) A metaphase spread with combined image of 3 fluorochrome signals. (B) DAPI

counterstaining of the same metaphase spread shown in A. The G-banding pattern was used for chromosome identification. (C) A profile showing the average FITC/Teas Red signal ratio

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Table 1. Abnormalities detected by CGH analysis in 13 intrahepatic cholangiocarcinomas.

Overrepresentations are in bold and amplification sites are indicated by italic.LossGain

CommonCommonOthersOthers

1p17p19p19q22q13q117p1322q3, 4, 12, 8p22-23, 14q24-32,13q2q33-36, 5p13, 6p,p, 7q21-qter, 8q,11p12-15,

15q23-26, 21q2211q, 2021p36.1-36.317p11.2-1319p19q22q16p11.2-12,13q21-342q22-32

317p1319p19q16q23-2413q21-2212q15-2241p22q3p21.1-26, 6q21-27, 10q21-2613q1q, 2q22-32, 3q, 5q14-23, 7p, 7q21, 10p14-15,

14q23-32, 15q22-26, 16q11q23-25, 12p13-12517p19p19q4q12-34, 10q

61p36.1-36.317p1319p19q22q7qter, 12q24.1-24.3, 16p1q24-31, 2q22-32, 12q13-21, 13q21, 14q21-24719p22q16q

812q12-15, 17q11.2-212, 19p919p13.319q13.39q34, 16p1213q21-313p12-26.2, 4q11-21.3, 5q14-21, 8q, 12q15-21.3,18q22

101p36.1-36.317p11.2-1319p13.319q13.3-13.422q6p22-25, 12q24.1-24.3,13q21.3-311q23-31, 4p14-15.2, 4q12-34, 5p13-14, 5q14-22,16p13.2-13.3, 17q24-258q, 9p21-23, 11p12-14, 11q14.3-22.3,

12p12.1-13.1, 12q15-21.3, 14q21-24.2,18q11.2-12

111p35-36.217p11.2-1319p19q22q7qter, 16p12-13.3, 16q23-2413q21-221q21.2-32.3, 2q22-32.3, 4q26-32, 6q12-23.3,7p12-21, 8q, 9p22-24. 9q13-22.3, 10q21.1,

12q14-15, 14q21-24, 18p, 20p12-13121p17p1319p22q5q, 15q, 16p13-24, 18q22,13q21-343p13-q29, 6, 7q21-36, 8p12-qter, 9q12-33,

1321q2212p11.2-12.3, 12q14-21, 14q, 17q, 18p11.3, 20

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Fig. 2 Summary of the genetic aberrations detected by comparative genomic hybridization in 13 intrahepatic cholangiocarcinomas. Red vertical lines on the leftside of each chromosome represent losses of genetic material, and green

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Table 2. The frequencies of chromosome regional loss and gains in intrahepatic Cholagiocarcinomas detected by CGH analysis. Common alteration sites are indicated in bold.

Chromosome Loss Gain

Regions No. of cases % No. of cases %

1p 7 54 0 0

1q 0 0 3 23

2p 0 0 0 0

2q 0 0 4 31

3p 3 23 2 15

3q 2 15 4 31

4p 2 15 2 15

4q 1 8 5 38

5p 0 0 4 31

5q 2 15 3 23

6p 1 8 3 23

6q 1 8 4 31

7p 0 0 4 31

7q 1 8 3 23

8p 1 8 1 8

8q 0 0 6 46

9p 0 0 3 23

9q 1 8 2 15

10p 1 8 1 8

10q 1 8 3 23

11p 0 0 3 23

11q 0 0 3 23

12p 1 8 3 23

12q 3 23 6 46

13q 0 0 9 69

14q 2 15 3 23

15q 4 31 0 0

16p 5 38 0 0

16q 4 31 0 0

17p 7 54 0 0

17q 1 8 3 23

18p 1 8 3 23

18q 1 8 3 23

19p 12 92 0 0

19q 7 54 0 0

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의 hybridization 강도를 비율로서 표시한 그림이 다. 비율이 0.85 이하이면서 일관되게 감소 경향을 보이는 경우를 소실로 판정하였고, 1.15이상이면서 일관되게 증가 경향을 보이는 구역을 증가로 판정 하였다. 또 비율이 1.5 이상으로 넓은 구역은 over- representation으로, 1.5 이상이면서 좁은 구역은 증폭(amplification)으로 판정하였다.¹⁸

13예의 간내담관암 모두에서 유전적 변화를 확인 할 수 있었다. 각 예에 대한 변화를 (Table 1) 에 제 시하였으며, (Fig. 2) 에 도식화한 그림을 제시하였 다. 염색체의 소실은 19p에서 92%의 비율로 관찰 되어 가장 높았으며, 그 외에 1p (54%), 17p (54%), 19q (54%) 및 22q (62%)에서도 높은 빈도로 관찰되 었다. 염색체의 증가는 13q에서 69%로 가장 빈번 히 관찰되었으며, 8q와 12q에서도 각각 46%의 빈 도로 관찰되었다. 또한 5p13, 10q21.1 및 18q11.3

의 증폭이 각각 1예씩 관찰되었다. (Fig. 3)

고 찰

CGH는 매우 민감한 실험 방법으로 종양 조직내 의 DNA 복제수의 변화를 염색체 수준에서 효율적 으로 추정할 수 있는 방법이다.^{16, 17} 통상적인 세포 유전학적인 연구 방법은 종양 세포를 배양하여 염 색체 표본을 작성하고 핵형 분석을 시행하는 방법 이다. 그러나 이런 방법은 여러 가지 제한점을 갖고 있다. 우선 배양을 위해서는 신선한 종양 조직이 필 수적이고, 종양세포의 배양 이 기술적으로 매우 어 려운 것으로 알려져 있으며, 배양에 성공을 하더라 도 그 염색체 표본의 질이 매우 나쁘다. 따라서 복 잡한 핵형의 이상이 존재할 때에는 핵형 분석이 불 가능하며, 배양 과정 중의 2차적인 유전적 변화가 초래될 수 있기 때문에 배양 후의 핵형이 종양 조직

20p 0 0 4 31

20q 0 0 3 23

21q 2 15 0 0

22q 8 62 0 0

Fig. 3 Partial karyotypes and CGH profiles showing three cases of regional amplifications, (A) 5p13 in case No. 1, (B) 18p11.3 in case No.12 and (C) 10q21.1 in case No 11..

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내의 핵형과는 서로 다를 수도 있다.⁵ 이러한 제한 점들은 CGH법으로 극복할 수 있다. 그러나 CGH법 도 제한적인 요소들을 가지고 있는데, 우선 균형형 의 유전적 이상과 ploidy 변화(3n, 4n 등)는 검출 할 수 없으며, 동원체 주위, 이형염색질(heterochro- matin) 부위 및 염색체 말단부의 이상도 신뢰성 있 게 검출할 수 없다. 또한 5Mb 이하의 작은 부위의 이상, 정상 세포가 50%이상 섞여 있는 경우, 종양 조직내에 유전적 이질성(genetic heterogeneity)이 존재할 경우에도 신뢰성 있는 검출을 기대하기는 어렵다.¹⁸그러나 많은 경험을 가진 연구자가 잘 갖 추어진 시설에서 실험을 진행하고 세심한 결과 분 석을 한다면, 종양조직내의 유전적 변화를 염색체 수준에서 한번에 검사할 수 있는 매우 강력한 연구 방법이라고 알려져 있다. 본 연구에서는 13예의 간 내담관암 조직을 대상으로 CGH를 시행하여 염색 체 수준의 유전적 변화를 조사하였다.

간내담관암은 그 발생빈도가 낮지만, 서양보다는 동양에 상대적으로 많은 질환으로 알려져 있고, 따 라서 간내담관암을 대상으로 한 유전학적 연구는 주로 동양권에서 이루어졌다. 주로 몇 가지의 암유 전자와 종양억제 유전자에 대한 단편적인 연구 만 이 이루어졌고,20, 21, 22, 23CGH를 시행한 예는 찾아볼 수 없어서, 본 연구가 간내담관암을 대상으로 CGH 를 시행한 첫 연구인 것으로 생각된다.

13예의 간내담관암 조직 중 12예(92%)에서 19p의 소실이 관찰되어 가장 빈번한 이상으로 관찰되었 다. 19p에는 JUND, MEL, LPSA, JUNB, RAD23A, VAV1, CDC34, MATK, PJS, STK11 및 CDKN2D 등 의 암 관련 유전인자들이 존재하는 것으로 알려져 있으나 특정 종양에서 19p의 소실이 높은 빈도로 보고된 적은 없다. 따라서 19p의 소실은 간내담관 암의 발생과정에 중요한 역할을 할 가능성이 많은 부위라고 할 수 있겠다. 그 외에도 22q에서 62%, 1p, 17p 및 19q에서 54%의 소실 빈도를 보이고 있 는데 22q는 종양억제 유전자인 NF2 (22q12.2)의 존 재부위로 여러 종양에서 소실을 보이고 있다.²⁴17p 는 p53 종양억제 유전인자(17p13.1)의 존재 부위로 거의 모든 암에서 소실을 보이는 것으로 알려져 있 다.24, 25, 26, 27

염색체의 증가는 13q에서 9예(69%)가 관찰되어

가장 높은 빈도를 보였는데, 13q는 종양억제 유전 자인 retinoblastoma (Rb, 13q14.1) 유전자가 존재 하는 부위로 대부분의 암에서 소실이 많이 일어나 는 곳인데²⁸본 연구 결과에서는 상반된 결과를 보이 고 있다. 이는 13번 염색체에 존재하는 Rb 유전자 이외의 다른 암 연관 유전인자의 증가가 간내담관 암의 발생에 중요한 역할을 할 가능성을 보여주고 있다고 하겠다.

본 연구 결과 한국인 간내담관암에서 빈발하는 염 색체 수준의 유전적 변화를 확인할 수 있었다. 비록 그 변화의 양상은 매우 복잡하였으나 무작위적인 변화가 아니라 몇 가지 뚜렷한 경향을 보이고 있음 을 알 수 있었다. 향 후 본 연구 결과 밝혀진 관련 부위를 대상으로 암 관련 유전인자 각각의 변화를 추적하는 연구가 필요하겠으며, 또한 새로운 암 관 련유전자 검색 과정의 지표로도 사용될 수 있을 것 으로 생각된다.

결 론

간내 담관암으로 진단 받고, 간절제술울 시행받은 환자 13명의 절제 조직을 대상으로 comparative genomic hybridization (CGH) 기법을 이용하여 인 체 간내담관암에서의 유전적 변이를 관찰하여 DNA 복제수의 변이가 빈번한 부위를 제시하고, 이 부위에 대한 기존의 종양 유전자 및 종양 억제 유전 자의 연관성을 밝히고, 더 나아가 간내담관암의 발 암 과정에 관여하는 새로운 유전자의 위치를 제시 하고자 본 연구를 수행하여 다음과 같은 결과를 얻 었다.

1. CGH를 시행한 13예의 간내 담관암 모두에서 이상 소견을 관찰할 수 있었다

2. 염색체의 소실은 19p에서 92%의 비율로 관찰 되어 가장 높았으며, 그 외에 1p (54%), 17p (54%), 19q (54%) 및 22q (62%)에서도 높은 빈 도로 관찰되었다

3. 염색체의 증가는 13q에서 69%로 가장 빈번히 관찰되었으며, 8q와 12q 에서도 각각 46%의 빈 도로 관찰되었다.

4. 5p13, 10q21.1 및 18q11.3의 증폭이 각각 1례 씩 관찰되었다

이상의 결과로부터 한국인 간내담관암에서 빈발

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하는 염색체 수준의 유전적 변화를 확인할 수 있었 다. 비록 그 변화의 양상은 매우 복잡하였으나 무작 위적인 변화가 아니라 몇 가지 뚜렷한 경향을 보이 고 있음을 알 수 있었다. 향 후 본 연구 결과 밝혀진 관련 부위를 대상으로 암 관련 유전인자 각각의 변 화를 추적하는 연구가 필요하겠으며, 또한 새로운 암 관련유전자 검색 과정의 지표로도 사용될 수 있 을 것으로 생각된다.

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