http://dx.doi.org/10.5369/JSST.2018.27.3.170 pISSN 1225-5475/eISSN 2093-7563
TiO 2 /GOD 혼합물 기반의 글루코스 바이오 센서의 제작과 표면 처리를 통한 감도개선
이준엽1,2 · 정동건1 · 이재용1 · 김재건2 · 정대웅2,+ · 공성호1,+
Fabrication and Improved Sensitivity with Surface Treatment of TiO 2 /GOD Mixture based Glucose Biosensor
Junyeop Lee1,2, Dong Geon Jung1, Jae Yong Lee1, Jae Keon Kim2, Daewoong Jung2,+, and Seong Ho Kong1,+
Abstract
In this paper, the TiO
2/glucose oxidase (GOD) mixture has synthesized through simple and low-cost fabrication methods. The phys- ical properties of the mixture were proved using an FT-IR/NIR spectrometer, an X-Ray diffractometer, and a Raman spectrometer. GOD maintained its bioactivity during all fabrication process. The current characteristics of the glucose biosensor were proportional to the glu- cose concentration and effective surface area of square pyramid on a silicon substrate. The maximum current change was measured in a pH 7.0 buffer solution. The simple and low-cost fabrication process and surface treatment can be used widely in previous research for improvements in effective surface area.
Keywords: Glucose biosensor, Glucose oxidase (GOD), Titanium dioxide (TiO
2), Surface treatment, Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)
1. 서 론
글루코스(glucose)는 모든 살아있는 유기체의 필수 대사 산물이 다. 혈액 속의 글루코스 수치의 정상 범위는 4.4-6.6 mM이며 혈 액 속의 글루코스 수치가 이 범위보다 높거나 낮으면 인슐린(insulin) 의 분비에 문제가 생겼거나 인슐린이 정상적으로 분비 되더라도 글루코스 수치가 조절되지 않는다는 것을 나타낸다[1]. 전기화학 적(electrochemical) 방식의 글루코스 바이오센서는 산화-환원이 일 어날 때 전자의 이동이 일어나는 원리를 이용한다. 글루코스와 단 백질 효소(enzyme)가 결합할 때 과산화수소(H
2O
2) 가 생성되고 생 성된 과산화수소는 전극 표면에서 분해되어 전자를 내어놓는다. 이 과정에서의 전자 이동을 감지함으로써 글루코스의 농도를 측정한
다. 단백질 효소는 글루코스와 전극 사이의 전자 이동을 가능하게 하는 매개체(mediator)역할을 한다.
(1)
(2) 1 세대 글루코스 바이오 센서의 경우 식(1)의 반응을 일으키는 단 백질 효소와 시료 내에 존재하는 기타 물질들의 간섭 때문에 글루 코스에 대한 선택도(selectivity)가 낮다는 문제점이 존재한다[1-4].
이러한 문제점을 해결하기 위해 글루코스와 선택도가 높은 매개체 에 대한 연구가 활발히 진행되었다[5].
글루코스 산화효소(glucose oxidase, GOD)는 글루코스에 대 한 선택도가 매우 높은 효소(enzyme)이며 이 효소를 다양한 물질의 표면에 고정화(immobilization)할 경우 랩온어칩(Lab- on-a-chip, LOC) 과 같은 바이오 센서 활용 분야에 널리 쓰일 수 있다.
TiO
2는 뛰어난 생체적합성(biological compatibility)을 띄는 금 속산화물로서 다양한 단백질(protein)의 고정화에 널리 쓰이고 있 다[6]. 본 논문에서는 TiO
2와 GOD를 합성하여 혼합물을 형성 하 였으며 MEMS(Micro Electro Mechanical Systems) 을 이용하여 실리콘 웨이퍼의 표면에 백금(Pt) 전극을 형성하고 TiO
2/GOD 혼 합물을 스핀코팅(spin coating)함으로써 전극과 GOD간의 즉각적 인 전자의 이동을 가능하게 하였으며 글루코스-단백질 효소간 반 응을 일으키는 유효 표면적을 증가시켜 감도가 향상된 글루코스 바이오센서를 제작하였다.
β D – – glu cos e O +
2→ D glucono – – δ – lactone + H
2O
2H
2O
2→ O
2+ 2H
++ 2e
–1
경북대학교 전자공학부(School of Electronics Engineering, Kyungpook National University)
80 Daehakro, Bukgu, Daegu 41566 Korea.
2
한국생산기술연구원, 항공시스템기술그룹(Aircraft System Technology Group, Korea Institute of Industrial Technology)
57, Yangho-gil, Yeongcheon-si, Gyeongsangbuk-do, 38822, Korea
+
Corresponding author: [email protected]
+
Corresponding author: [email protected]
(Received: A. 00, 2018, Revised: A. 00, 2018, Accepted: A. 00, 2018)
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2. 실험 방법
2.1 TiO2와 글루코스 산화효소(glucose oxidase, GOD)의 합성
Fig. 1 은 글루코스 산화효소와 TiO
2혼합물의 합성 과정을 보 여준다. 첫 번째로 50 mg의 글루코스 산화효소를 pH 7의 탈이 온수(deionized water, DI water) 10 mL 에 용해시킨다. 그리고 200 mg 의 TiO
2파우더를 글루코스 산화효소가 녹아있는 용액에 첨가한다. 혼합물을1시간 동안 초음파처리(ultrasonication) 한 후 5
oC 에서 24시간 동안 보관하였다. 합성된 TiO
2/GOD 혼합물을 SEM 사진을 통해 확인하였다. Fig. 1(a)는 TiO
2와 GOD의 합성 전, (b)는 후의 사진이며 Fig. 2는 합성된 TiO
2와 GOD의 SEM 사진이다.
2.2 실리콘 웨이퍼의 표면적 증가를 위한 정사각뿔 형성
글루코스와 GOD의 반응속도를 증가 시키기 위하여 MEMS 공 정을 이용하여 실리콘 표면에 정사각뿔 형태를 형성함으로써 글루 코스와 GOD가 반응할 수 있는 표면적을 증가시켰다.
Fig. 3(a) 는 포토리소그래피(photolithography)가 끝난 후 실리콘 웨이퍼의 사진이다. 먼저, 4인치 P 타입의 (100) 실리콘 웨이퍼를
열확산로(furnace)에서 산화(oxidation)시켜 100 nm의 SiO
2막을 형 성하였다. 그 후, GXR-601 포토레지스트(photoresist)를 스핀코팅 한 후 90
oC 의 핫플레이트(hotplate)에서 3분동안 소프트 베이크(soft bake) 를 수행하여 용매(solvent)를 제거해주었다. 용매가 제거된 웨 이퍼를 365 nm (i-line)의 자외선(ultra violet, UV)에 15초 동안 노 광시키고 AZ 300K 현상액(developer)에 담가 실온에서 25초간 현 상시켰다. 수 마이크로미터(20~100 μm)의 사각형 형태가 패터닝 (patterning) 된 웨이퍼 표면에 드러난 SiO
2층을 6:1의 BOE(buffered oxide etchant) 를 이용하여 3분동안 식각해 주었다. 습식식각 후 남 은 포토레지스트는 아세톤(acetone)과 메탄올(methanol)을 이용하 여 제거하였다.
Fig. 3(b) 는 Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25 wt%
용액을 이용하여 실리콘 웨이퍼를 비등방성 습식식각 한 후의 사 진이다. 사용한 TMAH 용액의 식각속도는 85
oC 용액에서 0.48 μm/min 의 식각율을 보여주며. 가장 큰 정사각형 패턴의 가로, 세 로 길이가 100 μm인 것과 54.7도로 식각되는 TMAH 용액의 특 성을 고려하여 정사각뿔의 최대 높이인 70.62 μm가 충분히 형성 될 수 있게끔 148 분 동안 웨이퍼를 식각해 주었다.
Fig. 4 는 TMAH 용액에서 식각된 웨이퍼 표면의 현미경 사 진이다. 식각된 사각형 표면을 보면 패시베이션 층(passivation layer) 으로 사용된 SiO
2층 밑으로 언더컷(undercut)이 일어난 것을 확인할 수 있다. 이 때 남아있는 SiO
2층을 식각하지 않 고 그대로 전극을 증착 할 경우 Fig. 5와 같이 전극이 분리되 는 현상이 발생할 수 있다. 따라서 TMAH를 이용한 Si 식각 Fig. 1. (a) The glucose oxidase (GOD), TiO
2solution which was dis-
solved in DI water and (b) synthesized TiO
2/GOD com- pounds.
Fig. 2. SEM image of the synthesized TiO
2/GOD powders.
Fig. 3. Images of (a) patterned wafer and (b) quadrangular pyramid pattern which was etched with TMAH.
Fig. 4. Microscope image of silicon wafer surface etched with
TMAH solution
후 반드시 BOE를 이용한 SiO
2식각을 해주어야 전극의 분리 를 예방할 수 있다. Fig. 6 은 정사각뿔이 형성된 실리콘 웨이 퍼 표면의 SEM 사진이다.
2.3 실리콘 표면에 TiO2/GOD 혼합물 고정화
Fig. 7 은 2500 rpm으로 5
oC 에서 24시간 동안 보관한 TiO
2/GOD 혼합물을 스핀코팅으로 실리콘 웨이퍼 표면에 코팅한 모습을 보여 주는 SEM 사진이다. 분당 회전수 (revolutions per minute)가 2000 rpm 미만에서는 스핀코팅 후 용액 상태의 혼합물이 웨이퍼 표면 에 잔류하여 혼합물이 균일하게 코팅되지 않았으며 2500 rpm을 초과하면 혼합물이 원심력에 의해 정사각뿔 형태의 표면 안쪽까지 완전히 코팅되지 않는 문제점이 발생했다. 따라서 이 실험에서는 2500 rpm 으로 혼합물을 스핀코팅 하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 TiO2/GOD 혼합물의 특성 평가
글루코스 산화효소(glucose oxidase, GOD) 내의 아미드 그룹의 존재를 FT-IR 분광법 (fourier-transform infrared spectroscopy), 라 만 분광법 (raman spectroscopy), XRD(x-ray diffraction)를 이용하 여 조사하였다.
Fig. 8 은 실험에 사용한 TiO
2의 구조를 XRD로 분석한 그래프 이다. 그래프에 나타난 피크(peak)를 분석한 결과 실험에 사용한 TiO
2는 Table 1에 정리한 것처럼 아나타제(anatase) 구조와 루틸 (rutile) 구조의 피크를 모두 보여주었다. 따라서 실험에 사용한 TiO
2powder 의 경우 아나타제와 루틸 구조의 TiO
2가 혼합되어 있음을 알 수 있다.
Fig. 9 은 세 가지 종류의 시료를 각각 FT-IR 분광법으로 분석한 Fig. 5. SEM image of separated electrode due to the residual SiO
2layer.
Fig. 6. SEM images of quadrangular pyramid on silicon substrate. (a) top view, (b)side view, (c) and (d) corss-section view.
Fig. 7. SEM image of the quadrangular pyramid coated with TiO
2/ GOD compounds.
Fig. 8. XRD spectrum of TiO
2nanoparticles
그래프이다. GOD는 아미드 I(amide I), 아미드 II(amide II) 그룹 에 속하는 흡수대(absorption band)인 1547, 1655 cm
-1에서 피크를 보여주었으며 TiO
2/GOD 혼합물 또한 동일한 피크를 보여주었다.
Fig. 10 은 라만 분광법을 통해 각 시료를 분석한 결과이다. 글루코 스 산화효소는 2907 cm
-1에서 가장 높은 피크를 보여주었으며 이 는 C-H 결합의 스트레칭(stretching)을 나타낸다. TiO
2의 경우 C- C-O 와 C-C-C간 변형에 해당하는 308, 516, 639 cm
-1의 피크를 보 여주었다. TiO
2/GOD 혼합물의 경우에는 GOD와 TiO
2의 스펙트럼 을 결합한 피크를 보여주었다. Fig. 9의 FT-IR 분광법과 Fig. 10의 라만 분광법 특성을 토대로 TiO
2와 글루코스 산화효소가 결합 과 정 중에 화학적인 변성 없이 물리적으로 결합되었다는 것을 확인 할 수 있다.
3.2 제작된 글루코스 바이오센서의 전류특성 평가
Fig. 11 은 글루코스의 농도를 단계별로 높여 주었을 때 전류의 변화를 나타낸 그래프이다. 반응하는 글루코스 용액의 농도를 2, Table 1. XRD spectrum peaks of TiO
2nanoparticles
Anatase Rutile
2θ (deg.)
25.26 -
- 27.4
- 36.02
37.8 -
- 41.26
48.04 -
53.92 -
- 54.29
55 -
62.66 -
68.76 -
70.24 -
73.18 -
75 -
Fig. 9. IR dispersion spectra of TiO
2, GOD, TiO
2/GOD compounds
Fig. 10. Raman spectrum of TiO
2, GOD, TiO
2/GOD compounds
Fig. 11. The response of the glucose biosensor on series injection of glucose solution with different concentration.
Fig. 12. The calibration curve of the glucose biosensor by different
effective surface area.
4, 6, 8, 10 mM 순서로 단계적으로 증가시켜 주었으며 용액 주입 시 나타나는 노이즈의 영향을 최소화 하기 위해 각 농도별 용액 주입 후 10 초가 경과되었을 때의 전류값을 기록 하였다. 결과적 으로 글루코스 용액의 농도에 비례하는 전류 특성을 확인할 수 있 었다. Fig. 12는 가로 세로의 길이가 각각 다른 정사각뿔 표면에 10 mM 글루코스 용액을 주입하였을 때 전류의 변화량을 나타낸 다. 형성된 정사각뿔의 표면적은 밑면의 한 쪽 모서리의 길이를 x 로 두었을 때 약 1.73 x
2이다. 그래프의 기울기를 통해 각기 다른 표면적에 따라 반응속도가 달라짐을 확인할 수 있다. Fig. 13은 pH 에 따른 글루코스 바이오센서의 전류 변화량을 나타낸 그래프이 다. GOD는 단백질 이므로 pH에 민감한 특성을 보여준다. 제작된 센서에서는 pH 7.0에서 가장 큰 전류 변화량을 보여주었다.
4. 결 론
본 연구에서는 간단한 제조 방법을 이용하여 TiO
2/GOD 혼합물 을 합성하였다. 합성된 혼합물을 FT-IR 분광법, 라만 분광법, XRD 를 통해 분석한 결과 합성 과정에서 GOD의 생물 작용(bioactivity) 특성이 변성되지 않고 유지되었음을 확인할 수 있었다. 또한 정사 각뿔이 형성된 실리콘 기판 위에 스핀코팅을 이용하여 TiO
2/GOD 혼합물을 균일하게 코팅 하였으며 이를 전계방사형 주사현미경(FE-
SEM) 을 통해 확인할 수 있었다. 제작된 글루코스 바이오센서는 전 기화학적 분석을 통해 글루코스 농도와 실리콘 기판의 유효 표면 적 및 완충용액의 pH 정도에 따라서 특성을 평가하였다. 글루코 스 농도와 실리콘 기판의 유효 표면적에 대해서는 선형적으로 증 가하는 전류 특성을 나타내었으며, 완충용액의 pH에 대해서는 pH 7.0 에서 가장 큰 전류변화 특성을 보였다. 본 논문의 연구에서 수 행한 마이크로 스케일의 표면 처리는 기존의 나노 입자를 이용한 바이오 센서에 대해서 범용적으로 적용될 수 있으므로 비교적 간 단한 MEMS 공정을 통해 효과적으로 감도를 높일 수 있을 것으 로 기대된다.
감사의 글
이 논문은 2015학년도 경북대학교 전임교원 연구년 교수 연구 비에 의하여 연구되었음.
REFERENCES
