The Clinical Significance of Cyclooxygenase 2 Expression in Colorectal Cancer

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서 론

결직장암은 국내 암 사망률 4위에 해당하는 흔한 질환으 로 식습관의 서구화로 그 발생빈도가 증가할 전망이다. 여 타 소화기계 암과 마찬가지로 조기 발견과 수술적 절제가 중요하지만 조기 암인 경우 증상이 없는 경우가 대부분이 며 진행성 암인 경우 원격전이의 빈도가 높아 예후가 좋지 않다. 따라서 효과적인 선별검사와 암 예방법의 개발이 절실 하다.

Aspirin과 같은 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti- inflamatory drug, NSAID) 약물들이 결직장암의 유병률을 감 소시킬 수 있다는 많은 증거가 있다.(1-5) NSAID가 chemical carcinogen에 의해 야기된 설치류의 결직장암의 유병률, 다 양성, 크기를 감소시키는 것으로 보고했고,(1) 또한, 가족성 용종증 환자에서 sulindac의 비대조무작위연구에서 NSAID 가 결직장 폴립의 수와 크기를 감소시키며,(2,3) 역학적 연 구에서 대장암으로 진행할 수 있는 상대적 위험도는 아스 피린이나 NSAID을 복용한 환자에서 의미 있게 낮게 나타 난다고 보고하고 있다.(4,5)

NSAID의 주요한 목표물은 cyclooxygenase (COX)이고 이 것은 arachidonic acid를 PGH2 (prostglandins, prostacyclin, thromboxane과 같은 모든 prostanoid의 공통적인 전구체)로 의 전환을 촉매하는 효소이다.(6) 현재 두 가지의 COX 동일 체(COX-1, COX-2)가 확인되어 있다.(7) COX-1은 대부분의 조직에서 발현되고 인체의 항상성을 유지한다. 반면, COX- 2는 성장인자와 mitogen 등의 다양한 자극에 의해 유도되는

The Clinical Significance of Cyclooxygenase 2 Expression in Colorectal Cancer

Hyun Rok Jang, M.D., Keun Ho Yang, M.D., Byung Noe Bae, M.D., Ki Hwan Kim, M.D., Se Hwan Han, M.D., Hong Joo Kim, M.D., Young Duck Kim, M.D., Hong Yong Kim, M.D. and Joung Yeon Kim, M.D.¹

Purpose: Epidemiologic studies have indicated that the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs, which inhibit cyclooxygenase activity, reduce the risk of colorectal cancer.

In addition, several studies have demonstrated the increased expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) in human colorectal cancer tissues. However, the role of COX-2 in colorectal cancer has not been fully established. The aim of this study was to clarify the clinicopathologic significance of COX-2 expression in human colorectal cancer.

Methods: We performed immunohistochemical straining for COX-2 expression in 124 human colorectal cancer speci- mens. COX-2 expression was then compared with clinicopathologic factors and survival outcomes.

Results: COX-2 was expressed in the cytoplasm of the cancer cells. COX-2 expression was noted in 86.3% of the cancer patients and significantly correlated with the histologic type. The depth of invasion ,tumor size, lymph node meta- stasis and stage were not correlated with COX-2 expression.

Multivariate analysis for the factors associated with survival showed that serum CEA, size, depth and lymph node involvement correlated with survival, but COX-2 expression had no correlation.

Conclusion: These data suggest that COX-2 expression in primary lesion of colorectal cancer may not be a useful

결직장암에서 COX-2발현의 임상적 의의

인제대학교 상계백병원 외과학교실, ¹병리학교실

장현록․양근호․배병노․김기환․한세환․김홍주․김영덕․김홍용․김정연¹

책임저자：배병노, 서울시 노원구 상계 7동 761-1 ꂕ 139-707, 인제대학교 상계백병원 외과학교실 Tel: 02-950-1023, Fax: 02-933-9389

E-mail: [email protected]

접수일：2002년 10월 1일, 게재승인일：2002년 10월 22일 본 논문의 요지는 2002년 대한외과학회 춘계학술대회에서 포스터 발표되었음.

본 논문은 2001년도 인제대학교 학술연구조성비 보조에 의한 것임.

marker for evaluating prognosis. However, further studies are necessary for identification of the roles in colorectal carcino- genesis. (J Korean Surg Soc 2003;64:39-43)

Key Words: Cyclooxygenase-2 (COX-2), Colorectal cancer, Immunohistochemistry

중심 단어: COX-2, 면역조직화학염색, 결직장암 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Departments of Surgery and ¹Pathology, Inje University, Sanggye Paik Hospital, Seoul, Korea

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ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 효소이다.(8,9) COX-2는 결직장암에서 항진자(up- regulator)

로서 보고되어 왔고 결직장암 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 믿고 있다.(10,11) 최근 실험연구에서 COX-2가 apoptosis를 억제하고,(12) 혈관생성을 조절하고, (13) matrix metalloproteinase (MMP)와 관련되어 있는 것으로 보고 있 다.(14)

본 연구에서는 COX-2와 여러 임상 및 병리학적 인자와 의 관련성을 연구하여 대장암에서 COX-2발현이 가지는 임 상적 의의를 알아보고자 하였다.

방 법

1. 환자 선정과 조직 획득

본 연구의 대상은 1994년부터 1997년까지 인제대학교 상 계백병원에서 결직장암으로 수술을 받고 추적검사가 가능 하였던 124의 조직 표본으로 하였다. 평균 연령은 63±10세 였고 성별은 남자가 75명, 여자 50명이었다. 병기별로 살펴 보면 AJCC (American Joint Committee on Cancer) TNM 병기 I 19명, 병기 II 49명, 병기 III 41명, 병기 IV 15명이었다.

2. 연구 방법

4μm 두께로 박절하여 coating slide에 부착하고 xylene에 탈 파라핀한 후, 70% 알코올까지 점차로 낮은 농도의 알코 올에 함수하고 증류수로 세척한 후, 희석된 과산화수소수 에 10분간 처리하여 내인성 peroxidase의 활성을 없앤 후 면 역조직화학 염색을 시행하였다(Fig. 1). microwave 전 처리 를 한 후 실온에서 차단항체와 30분간 반응시켜 비특이적 항원을 차단하고 COX-2 단클론항체(Cayman chemical, Ann Arbor, MI, USA, 1:1,000)를 이용하여 avidin-biotin complex- immunoperoxidase 방법으로 염색한다. 일차 항체를 실온에 서 1시간 반응시킨 후 PBS로 세 차례 세척하고 이차항체 (universal biotinylated secondary immunoglobulin antibody)로 반응시킨다. Streptavidin, 3,3-diaminibenzidine tetrahydrochlo- ride로 발색한 후 Harris 헤마톡실린으로 대조 염색하여 봉 입하였다.

염색 판독은 종양세포의 세포질에서 갈색 과립 상으로 염색된 경우를 양성으로 하며 발현강도 및 비율을 각각 표 시하였다.

3. 분석

통계분석은 SPSS 응용프로그램 version 10.0을 이용하였 고 상관관계분석은 Chi-square 법을 사용하였으며 생존분석 은 병기 IV인 15예를 제외한 후 Kaplan-Meier법, Cox 회귀분 석모형을 이용하였다. P값이 0.05 이하인 것을 유의한 것으 로 하였다.

결 과

선정된 조직으로 COX-2 면역조직화학 염색을 시행한 결 과 주로 종양세포의 세포질에 강하게 염색이 되었을 뿐만 아니라, 종양근처의 정상상피세포 특히 음와세포(crypt cell) 에서 COX-2의 발현이 일부 조직에서 관찰할 수 있었지만 미약하였다(Fig. 1).

124예의 결직장암 중 COX-2 단백질의 발현은 107예 (86.3%)가 양성이었고, 성별과 나이에 따른 발현 여부는 유 의한 차이를 보이지 않았다. 종양의 위치에 따른 발현은 결 장이 55/62 (88.7%), 직장이 52/62 (83.9%)으로 통계적 차이 는 없었고, 수술 전 혈 중 CEA농도에서 차이를 보이지 않았 다(P=0.593). 육안적 분류와 COX-2 발현과의 유의성은 없었 으나(P=0.902) 조직학적 분류에 따른 COX-2의 발현은 통계 적으로 유의하게 차이가 있었다(P=0.001). 점액성 암의 경 우 4/9 (44.4%)로 현저히 떨어져 있었다. 장벽침윤도의 경우 T1, T2 (95.0%)가 T3, T4 (84.6%)보다 발현율이 높았지만 유 의하지는 않았다. 임파선 전이 여부에 따른 차이는 없었고, 종양 주위의 혈관침윤이 있는 경우 발현이 75.0%로 감소되 었으나 통계적 유의성은 없었다(P=0.227). 염색체 배수성 검사나 S기 분율에 대한 검사에 대한 발현은 차이가 없었으 나. TNM병기 및 술 후 재발 여부에 따른 발현은 진행병기 의 경우와, 재발한 경우 감소하는 경향을 보였으나 유의하 지 않았다(P=0.123, P=0.196)(Table 1). COX-2의 발현에 따 른 5년 생존율은 양성인 경우 80.9%, 음성인 경우 68.8%로 차이를 보였으나 통계적 유의성은 없었다(P=0.1299)(Fig. 2).

Cox 생존회귀분석모형을 통한 생존분석에서는 혈청 CEA, 크기, 침윤 정도, 림프선 침윤 유무 등이 생존율과 관련성을 보였고 COX-2 발현, 혈관침윤, 현미경적 소견에는 관련성

Fig. 1. Immunohistochemical staining of COX-2 in a representative section of colorectal carcinoma (×100). COX-2 expression is observed in the cytoplasm and in the nuclear envelope of the tumor cells, and some stromal cells are stained.

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ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

이 보이지 않았다(Table 2).

고 찰

결직장암은 나쁜 예후를 가지는 암 중의 하나이며 1998년 에 미국에서만 55,000명이 사망하였다.(15) 유병률의 증가

와 나쁜 결과의 유사한 경향이 일본에서도 보고되었다.(16) 이러한 환자들을 치료하기 위한 여러 가지 새로운 치료기 술 중 NSAID가 최근에 많은 관심을 끌고 있다. NSAID는 인간에서의 결장폴립과 동물표본에서 의미 있는 항암효과 를 나타내고 있다.(1,16) 비록 이 항암효과의 정확한 기전은 분명하지 않지만 이 효과가 COX-2 활동의 조율을 통한 항 혈관생성효과에 부분적으로 기여할 것으로 생각되어 왔었 다. 여러 실험적 모델로부터 COX-2발현이 신혈관생성의 증 식과 관련되어 있다는 것을 보여주고 있다.(11)

1990년 초에 역학적 연구에서 NSAID를 복용하는 개인에 서 결직장암으로부터 사망률이 40∼50% 감소하고,(4,17-19) slulindac을 복용한 환자에서 선종의 크기와 숫자가 감소한 다고 보고하고 있다.(2,3,20,21) 이러한 연구를 바탕으로 NSAID의 COX 억제와 결직장암 사이의 관계가 조사되었 다. COX-2가 결직장암 환자의 거의 80%에서 과 발현된다 는 것이 발견된 후 암에 대한 COX-2의 역할이 연구의 중심 이 되어 왔었다.

최근 연구에서 COX-2발현이 결직장암의 크기와 침윤정 도와 관련이 되어 있다는 것을 보고하고 있다. 43명의 생체 표본연구에서 Fujita 등(22)은 COX-2가 크기와 침윤정도에 따라 증가한다는 것을 확인했다. Yang 등(23)은 가족성 용 종증 환자의 선종에서 크기에 의존하여 prostanoid가 증가 한다는 것을 설명했다. 또한, Sheehan 등(24)은 COX-2발현 이 진행된 병기의 경우, 암이 클 경우, 그리고 림프절 전이 가 있는 경우에 증가한다고 설명했다. 하지만, 본 연구에서 는 대부분의 임상 병리학적 인자들이 COX-2발현 여부와 무관한 것으로 나타났다. 장벽 침윤도, 혈관침윤 여부, 병 기, 재발 여부 등이 약간의 차이를 보였으나 통계적 유의성 이 없었다. 단지 조직학적 분류만이 차이가 있었는데 점액 성암의 경우 COX-2발현이 현저히 감소하였다(P=0.001). 이 는 점액성암이 비점액성암에 비해 생존율이 나쁘고 COX-2 Table 1. Correlation between COX-2 expression and clinico-

pathological features

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ COX-2 expression

Variable ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ P

(-) (+)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ M 12 (1.2%) 62 (83.8%)

Gender 0.324

F 5 (10.0%) 45 (90.0%)

＜60 7 (12.7%) 48 (87.3%)

Age 0.776

≥60 10 (14.5%) 59 (85.5%) Colon 7 (11.3%) 55 (88.7%)

Location 0.433

Rectosigmoid 10 (16.1%) 52 (83.9%)

＜10.0 7 (14.6%) 41 (85.4%)

S-CEA (ng/ml) 0.593

≥10.0 8 (11.3%) 63 (88.7%)

＜5 9 (15.5%) 49 (84.5%)

Size (cm) 0.607

≥5 8 (12.3%) 57 (87.7%) Polypoid 2 (10.0%) 18 (90.0%) Gross Ulcerofungate 9 (13.8%) 56 (86.2%) 0.902

Ulceroinfiltrat e 5 (13.5%) 32 (86.5%)

Well 8 (100.0%)

Micro Moderate 11 (10.8%) 91 (89.2%) 0.001 Poor 1 (20.0%) 4 (80.0%) Mucinous 5 (55.6%) 4 (44.4%) pT1, T2 1 (5%) 19 (95.0%)

Depth 0.196

pT3, T4 16 (15.4%) 88 (84.6%) LN (-) 5 (11.6%) 38 (88.4%)

0.623 involvemen (+) 12 (14.8%) 69 (85.2%)

(-) 5 (11.6%) 38 (88.4%)

Venous 0.227

(+) 5 (25.0%) 15 (75.0%) invasion

(++) 7 (11.5%) 54 (88.5%) Diploid 5 (15.6%) 27 (84.4%)

DNA ploidy 0.747

Aneuploid 6 (13.0%) 40 (87.0%) S-phase ＜15 5 (16.1%) 26 (83.9%)

0.525 fraction ≥15 5 (11.1%) 40 (88.9%)

1 1 (5.3%) 18 (94.7%) Stage 2 7 (14.3%) 42 (85.7%) 0.123

3 4 (9.8%) 37 (90.2%) 4 5 (33.3%) 10 (66.7%) 0 11 (11.3%) 86 (88.7%)

재발여부 0.196

1 6 (23.1%) 20 (76.9%) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ LN = lymph node a.

Fig. 2. Kaplan-Moler disease-free survival curves of patients with and without COX-2 expression. A statistically difference was not observed between the two groups (P=0.1299).

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발현이 높게 나타나리라는 예상과는 상반된 결과를 보이고 있다. 점액성암은 비점액성암과는 암발생 과정에 차이가 있을 것으로 추측되며 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으 로 생각된다. Shattuck-Brandt 등(25)의 연구에서 분화가 좋 은 대장암에서 COX-2가 강하게 발현되었다고 보고하고 있 다. 본 연구에서 비록 통계적 유의성은 없었으나 TNM 병기 I과 조직 분화도가 좋은 암이 COX-2 발현의 증가를 보였다.

따라서 COX-2가 암 발생의 초기에 발현됨을 시사한다고 보여진다.

COX-2의 발현 여부와 생존율과의 관계에 대한 연구는 보고자에 따라 차이가 있다. Sheehan 등(24)은 생존율과 COX-2와의 관련성을 보고하고 있다. 본 연구에서는 COX-2 발현 여부에 따른 생존율의 차이가 없이 오히려 COX-2 음 성인 경우가 약간 불량한 예후를 보인 것으로 보아 생존율 과의 연관성은 없는 것으로 생각된다. 다변량분석에서도 혈청 CEA, 크기, 침윤정도, 림프선 전이, 병기 등만 생존율 에 영향을 미치는 것으로 나타났다.

최근의 실험적 연구에서는 COX-2가 원격전이와 세포사 (apoptosis)에 영향을 주는 것으로 보고하고 있다. Tsujii 등 (13,14)에 의하면 COX-2가 내피세포의 이동을 자극하여 혈 관형성을 자극하고 MMP-2에 영향을 미쳐 collagenase level 을 활성화시킨다고 보고하였다. Elder 등(26)은 COX-2를 선 택적으로 억제하는 NS-398을 이용하여 결직장암 세포의 apoptosis가 유도되었다고 하였다. 따라서 저자들은 암 발생 과정에서 COX-2의 역할을 좀 더 명확하게 알기 위한 추가 연구의 필요성을 느꼈다.

결 론

본 연구에 의하면 조직학적 분류를 제외하고는 COX-2발 현과 기존의 다른 예후인자들과의 상관성이 없었고, 생존 율의 비교에서도 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 그러 므로 COX-2발현만으로 예후를 판정하기는 힘들 것으로 사 료된다. 그러나 생존율과 병기, 장벽 침윤도, 혈관침윤 여

부, 재발 여부 등에 대해서는 향후 추가적인 연구가 필요하 리라 생각된다. 또한 암 조직에서 COX-2발현의 기전을 알 아보기 위한 혈관신생에 관여하는 혈관내피성장인자(vas- cular endothelial growth factor, VEGF), 종양혈관밀도 그리고 apoptosis에 관련된 인자 등과의 비교연구가 필요하리라 생 각한다.

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Table 2. Cox proportional hazards model for risk factors associated with survival. Values in parenthesis are 95% confidence intervals ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ

Factor B Standard error P Odds ration

Serum CEA (＜10 vs. ≥10) 0.176 0.087 0.043 1.192 (1.006∼1.413)

Size (＜5 vs. ≥5) -0.346 0.170 0.042 0.708 (0.507∼0.988)

Microscopic Finding 0.499 0.514 0.332 1.647 (0.602∼4.507)

Depth (pT1, 2 vs pT3, 4) 1.957 0.911 0.032 7.078 (1.188∼42.166)

LN involvement (negative vs. positive) 2.315 1.007 0.022 10.127 (1.406∼72.950) Venous invasion (negative vs. positive) 0.053 1.185 0.083 7.794 (0.764∼79.543)

DNA ploidy (diploid vs. aneuploid) -0.979 0.654 0.134 0.376 (0.104∼1.353)

S-phase fraction (＜15% vs. ≥15%) -0.105 0.690 0.879 0.900 (0.233∼3.483)

COX-2 expression (negative vs. positive) 2.553 1.497 0.088 12.851 (0.684∼241.467) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ LN = lymph node.

(5)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ 10) Williams CS, Smalley W, DuBois RN. Aspirin use and po-

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