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의학석사 학위논문
돼지 심정지 모델에서 저체온 치료가 뇌조직의 Mitogen-
Activated Protein Kinase 경로에 미치는 효과
Effect of therapeutic hypothermia on Mitogen-Activated Protein Kinase pathway in the brain tissue of swine cardiac arrest model
2016 년 7 월
서울대학교 대학원 의학과 응급의학전공
계 유 찬
A thesis of the Master’s degree
Effect of therapeutic hypothermia on Mitogen-Activated Protein Kinase pathway in the brain tissue
of swine cardiac arrest model
돼지 심정지 모델에서 저체온 치료가 뇌조직의 Mitogen- Activated Protein Kinase 경로에 미치는 효과
July 2016
The Department of Emergency medicine, Seoul National University
College of Medicine
Yu Chan Kye
i
돼지 심정지 모델에서 저체온 치료가 뇌조직의 Mitogen- Activated Protein Kinase 경로에 미치는 효과
지도교수 서 길 준
이 논문을 의학석사 학위논문으로 제출함
2016 년 7 월
서울대학교 대학원 의학과 응급의학전공
계 유 찬
계유찬의 의학석사 학위논문을 인준함
2016 년 7 월
위 원 장 성 승 용 (인) 부위원장 서 길 준 (인) 위 원 권 운 용 (인)
ii
Effect of therapeutic hypothermia on Mitogen-Activated Protein Kinase pathway in the brain tissue of swine cardiac arrest model
(- Effect of therapeutic hypothermia on MAPK pathway -)
by Yu Chan Kye
A thesis submitted to the Department of Emergency medicine in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master of Science
in Emergency medicine at Seoul National University College of Medicine
July 2016
Approved by Thesis Committee:
Professor Seung Yong Seong Chairman Professor Gil Joon Suh Vice chairman Professor Woon Yong Kwon
iii
초 록
서론: 돼지 심정지 모델을 이용하여 저체온 치료를 시행했을 때 뇌조직에서 일어나는 Mitogen-Activated Protein Kinase의 변화를 분석하여 저체온 치료의 임상효과를 설명할 수 있는 기전을 제시하고자 한다.
방법: 돼지 24마리(샴군 6마리 포함)를 대상으로 6분간의 심실세 동을 유발한 후 심폐소생술을 실시하여 자발순환이 회복된 뒤 6마 리씩 각각 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군으로 무작위 배정하고 중심 체온을 정상 체온 및 32 °C에서
34 °C 사이로 유지하는 저체온 치료를 실시하였다. 저체온 치료가
종료된 후 8시간에 걸쳐 재가온을 시행하였고 자발순환이 회복된 후 60시간이 지난 시점에서 돼지들의 뇌조직을 적출하여 분석을 시 행하였다.
결과: 각 실험군의 뇌 해마 조직을 적출하여 p38, JNK 및 ERK 경 로의 단백질 발현정도를 분석하였다. 인산화된 p38 대 p38의 비율 및 인산화된 JNK 대 JNK의 비율은 정상 체온 유지군 및 저체온 치료군에서 모두 유의하게 샴군보다 증가하였다. 인산화된 ERK 대 ERK의 비율은 저체온 치료군에서만 샴군에 비해 유의하게 증가하
iv 였다.
결론: 저체온 치료는 심정지 이후에 뇌조직에서 발생하는 허혈-재 관류 손상시에 ERK경로를 활성화시켰으며 저체온 치료를 오래 할 수록 활성화 정도가 커지는 경향을 보였다. 또한 저체온 치료 및 정 상 체온 유지군에서 p38과 JNK경로도 활성화 되었으나 ERK경로 는 저체온 치료군에서만 활성화되었다.
--- 주요어: 뇌, 심정지, 유도된 저체온, Mitogen-Activated Protein Kinases
학 번: 2013 - 21661
v
목 차
초록... i, ii 목차... iii 표 및 그림 목록 ... iv, v 서론... 1, 2, 3 실험재료 및 방법 ... 4, 5, 6, 7, 8 결과... 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 고찰... 19, 20 참고문헌 ... 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 초록 (영문) ... 30, 31
vi
표 및 그림 목록
그림 1 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 중심 체온 변화 (11)
그림 2 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 혈역학적 지표 변화 (12)
그림 3 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 혈액검사 지표 변화 (13)
그림 4 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 MAPK 경로 단백질의 western blots (14)
vii
그림 5 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 인산화된 p38 대 p38 비율 (15)
그림 6 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 인산화된 JNK 대 JNK 비율 (16)
그림 7 샴군 및 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군, 48시간 저체온 치료군의 인산화된 ERK 대 ERK 비율 (17)
그림 8 실험결과 해석의 모식도
1
서 론
갑작스런 심정지 환자의 치료방법으로 저체온 치료1,2가 도입된 지 십여년이 지났으나 심정지는 여전히 전세계적으로 중대한 보건학적인 문제3,4 이며 심정지 환자의 대다수가 경제 활동이 왕성한 중장년층이라는 점에서 사회경제적인 파급효과가 막대하다.5,6 심정지가 발생하면 자발순환이 회복되더라도 전신적인 허혈-재관류 손상이 생기게 되고 이것이 심근 수축력의 악화 및 다발성 장기 부전의 원인이 되어 불량한 예후를 가져오는 것으로 알려져 있다.7,8 특히 심정지에서 회복된 후 발생하는 허혈성 뇌손상은 식물인간상태9와 같은 영구적인 신경학적 결손을 가져올 수 있다. 이러한 이유로 심정지 이후에 발생하는 신경학적 손상 및 다발성 장기 부전을 줄이기 위해 많은 연구들이 있었으나 현재까지 저체온 치료1,2와 정상 체온 유지치료10만이 임상적인 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 저체온 치료가 임상적인 효과를 내는 매커니즘은 여러가지가 제기되고 있는데 대사량 및 산소요구량의 감소작용11, 활성화 산소의 감소작용12, 흥분성 아미노산의 감소작용13, 세포 사멸의 억제작용15, 혈액응고 연쇄과정의 억제작용16, 염증성 반응의 억제작용17, 유전학적인 기전18-20 등이며 아직까지 어떤 매커니즘이 주요한 기전인지는 불분명하다.
Mitogen-Activate Protein Kinase (MAPK)는 serine/threonine kinase family의 일종으로 세포외부의 신호자극을 세포내로 전달하는 단백질로 알려져 있다.21,22 MAPK family는 ERK
2
(extracellular signal-regulated protein kinase)와 p38 및 c- JUN-N-terminal kinase (JNK)로 이루어져 있다.23 ERK는 성장인자와 같은 생존인자에 의해 주로 활성화되며 세포의 증식과 생존에 관여하고 JNK와 p38은 산화 손상과 같은 스트레스 상황에서 주로 활성화되어 세포 사멸이나 퇴화에 관여하는 것으로 알려져 있다.24-26 심정지에서 회복된 이후 발생하는 허혈-재관류 손상에서는 p38 및 JNK경로가 활성화27되는 것으로 알려져 있으나 ERK경로의 변화에 대해서는 불분명하다.28
기존에 알려져 있던 연구결과들을 ERK관련 연구부터 고찰해 보면 동물 심정지 모델에서 저체온 치료가 뇌조직의 MAPK경로에 미치는 영향을 연구한 Hicks 등은 저체온 치료가 ERK와 JNK경로는 활성화시켰으나 p38경로에는 영향을 미치지 않았다29고 보고했다. 이 연구에서는 저체온 치료후 바로 뇌조직을 적출해서 분석하였기 때문에 실제 임상에서 사람에게 적용하는 방식과는 달리 재가온 시기가 생략되었다는 차이가 있었다. 심근세포를 이용한 한 연구에서는 저체온 치료가 ERK경로를 활성화시켰다30고 보고했고 심근허혈모델에서 ERK경로를 활성화시키는 효소를 억제시켰더니 저체온 치료의 효과가 줄어들었다31고 보고했다. 반면 마우스 심정지 모델에서 뇌실에 직접 ERK억제제를 투여했으나 저체온 치료의 효과에 감소가 없고 뇌손상이 악화되지도 않아 저체온 치료와 ERK경로는 관련이 없어 보인다32는 보고가 있으며 저체온 치료가 ERK경로를 통해 뇌의 소교세포에 발생한 염증을 억제시켰다33는 보고 및 마우스 뇌허혈모델에서 ERK경로를 억제시켰더니 뇌손상이 감소했다34,35는 보고가 있다. 이처럼 다양한
3
실험조건에서 ERK경로의 변화에 대해서는 일치된 결과를 보이지 않고 있다.36 저체온 치료와 p38 및 JNK경로와의 관련성에 대한 연구로는 사람의 제대 정맥 내피세포를 이용한 연구에서 저체온 치료가 p38 및 JNK경로의 억제를 통해 세포사멸과 기능장애를 억제한다37고 보고했으며 랫드의 뇌허혈모델에서 저체온 치료가 JNK경로의 차단을 통해 뇌세포의 사멸을 줄였다38는 보고가 있다.
그러나 이상의 여러 연구들 모두 실제 임상에서 적용되는 저체온 치료와는 방법의 차이가 있으며 일관적이지 않은 결과를 보이고 있다. 따라서 우리는 본 연구를 통해 심정지이후 발생하는 허혈- 재관류손상시에 저체온 치료가 뇌조직의 MAPK경로에 어떠한 영향을 미치는지 살펴봄으로써 저체온 치료가 임상적인 효과를 나타내는 기전을 제시해 보고자 한다. 기존의 여러 연구들을 통한 본 연구의 가설은 다음과 같다. 심정지 회복후에 발생하는 뇌조직의 허혈-재관류 손상시에 저체온 치료는 세포의 생존과 관련이 있는 ERK경로는 활성화시킬 것이고 세포의 사멸과 관련이 있는 p38 및 JNK경로는 억제시킬 것이다.
4
실험 대상 및 방법
이러한 가설을 검증하기 위해 이전에 수행된 우리의 연구39(Crit Care Med 2014;42:e132-e142)의 유래물로 냉동보관된 뇌조직을 이용하여 분석을 실시하였다. 이전 연구 및 뇌조직의 분석실험은 서 울대학교병원 전임상실험부의 동물실험실에서 이루어 졌으며 심정 지 모델의 실험은 2013년도 그리고 뇌조직의 분석실험은 2015년 도에 이루어 졌다. 모든 실험은 한국동물보호협회에 따른 서울대학 교병원의 동물실험윤리위원회의 승인하에 이루어졌고 Seoul National University Hospital Research Fund (grant number:
0420110450)의 지원하에 이루어 졌음을 밝힌다. 이전 연구39의 실 험과정 및 본 연구를 위한 뇌조직의 분석실험 과정은 다음과 같다.
24마리의 수컷 돼지(체중 32-39 kg)를 4군: 샴군, 정상 체온 유지군, 24시간 저체온 치료군(HT-24), 48시간 저체온 치료군(HT-48)으로 나누어 2주간 20-22 °C의 온도에서 주간 10시간 및 야간 14시간의 구분으로 사육하면서 적응기를 가졌다.
물을 제외한 철야 금식이후 졸레틸(zolazepam and tiletamine, 15 mg/kg; Virbac AH, Fort Worth, TX)을 근주하여 돼지들을 마취시키고 7.0 F의 기관내 튜브를 이용하여 기관삽관후 동물용 기계호흡기(GE Datex-Ohmeda S/5 Aespire Anesthesia Machine (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK))에 연결하였다. 10 ml/kg의 호흡량으로 분당 15회의 호흡을 제공하였으며 FiO2는
5
0.4로 맞추고 호기말 이산화탄소분압이 35-40 mmHg가 유지되도록 하였다. 말초 정맥에 정맥카테터(20-gauge, Jelco;
Smiths Medical, Dublin,OH)를 이용하여 락테이트링거액(lactated Ringer’s solution)을 4 mL/kg/hr로 공급하였다. 폐동맥 카테터(7.5 F; Arrow International, Cleveland, OH)를 우측 대퇴동맥에 정맥 sheath 카테터(8.5 F; Arrow International)를 이용하여 삽입하고 마지막으로 소변량의 감시를 위해 치골상부로 foley 카테터를 삽입한 후 15분간 안정화시켰다.
실험동물이 안정화된 이후 우측 대퇴동맥으로 유도 전극을 삽입하여 우심실 벽에 전극을 위치하게 하여 30-60 mA의 교류전류를 10초간 흘려 심실세동을 유발하였고 심실세동의 확인은 심전도와 평균동맥압이 15 mmHg 이하로 떨어진 것으로 확인하였다. 심실세동으로 발생한 심정지를 6분간 유지한 후 심폐소생술을 시작하였고 흉부압박은 상용화된 자동 흉부 압박도구인 X-CPR(Humed, Seoul, Republic of Korea)40 을 이용하여 흉부압박 대 인공호흡의 비율이 30 대 2가 되도록 심폐소생술을 실시하면서 1 mg의 에피네프린(epinephrine)이 정맥으로 투여되었다. 3분간의 심폐소생술후 제세동기(Zoll Medical, Chelmsford, MA)를 이용하여 150 J의 이상성 경흉부 제세동을 시행하였다. 이후 자발순환이 회복되기까지 매 1분 주기로 심폐소생술과 제세동을 반복하여 실시하였고 자발순환의 회복은 10분이상 조직화된 심전도 파형을 보이면서 평균동맥압이 60 mmHg 이상41인 것으로 확인하였다. 자발순환이 회복된 직후 실험동물들을 군당 여섯 마리씩 네 군으로 무작위 배정하였다.
6
첫번째 군은 샴군이었고 두번째 군은 정상 체온 유지군(NT, 폐동맥 중심체온을 37±0.5 °C로 유지), 세번째 군은 24시간동안 저체온(HT-24, 폐동맥 중심체온을 32-34 °C로 유지) 치료군, 네번째 군은 48시간동안 저체온(HT-48, 폐동맥 중심체온을 32-
34 °C로 유지) 치료군으로 분류하였다. 이후 정상 체온 유지 및
저체온 치료를 위해 체표면 냉각을 통한 자동체온조절기계인 Blanketrol II(CSZ, Cincinnati, OH)를 사용하면서 30분간 4 °C의 생리식염수를 20 mL/kg씩 정맥주입하였다. 저체온 치료가 종료된 후에는 중심체온의 상승이 시간당 0.5 °C가 넘지않게 약 8시간에 걸쳐서 서서히 재가온을 실시하였고 재가온이 완료된 이후 모든 실험이 종료되는 시점(자발순환 회복으로부터 60시간째)까지 37
±0.5 °C의 중심체온이 유지되도록 하였다. 샴군은 심실세동의 유발과 심폐소생술을 시행하지 않았으며 실험기간내 다른 과정은 타 군과 동일하게 하였고 중심체온을 37±0.5 °C로 유지하였다.42 실험기간중에 실험동물의 중심정맥압 및 평균동맥압을 감시하면서 중심정맥압 및 평균동맥압이 각각 8-12 mmHg, 65-90 mmHg의 범위에서 유지되도록 락테이트링거액(lactated Ringer’s solution) 및 필요시 노르에피네프린(norepinephrine)이 투여되었다.43 그 외에 예방적으로 매 12시간마다 1 g의 세파졸린(cefazolin) 항생제가 투여되었고 마취유지를 위해 니트로 옥시드(NO, nitrous oxide, FiNO2 of 0.6 ) 및 엔플루레인(enflulane, 1.5-2.0 %)이 사용되었으며 자발순환 회복후 발생할 수 있는 불수의적인 전신떨림을 방지하기 위하여 근육이완제인 베큐로니움(vecuronium) 을 0.05 mg/kg/hr로 자발순환회복후 48시간째까지 투여하였다.
우측 대퇴동맥 카테터를 통하여 평균동맥압을 감시하였고 심전도,
7
호기말 이산화탄소분압, 맥박산소측정도 감시하였다. 중심정맥압과 폐동맥 중심체온은 각각 폐동맥 카테터의 근위부 홀 및 말단부위 센서를 이용하여 감시하였고 중심정맥산소포화도(ScvO2) 및 혈색소수치, 혈당수치, 동맥혈가스분석을 측정하였다. 자발순환이 회복된 후 60시간이 지난 시점에서 각각의 실험동물을 희생시켜 대뇌반구를 즉시 적출하여 0.1 M의 버퍼용액이 포함된 4 %의 포름알데히드에 고정하였고 남은 뇌조직은 차가운 생리식염수로 세척하여 액체질소에 동결하여 영하 80 °C로 냉동보관하였다.
적출된 대뇌반구에서 허혈성 손상에 취약한 것으로 알려져있는 해마부위를 분리하여 Mitogen-Activated Protein Kinase pathway(ERK, p38, JNK)의 변화를 웨스턴 블롯기법으로 분석하였다. 해마 조직을 4 °C에서 약 5분간 원심분리하여 상층액을 영하 70 °C에서 보관하고 미토콘드리아 추출키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용하여 상층액에서 세포질 단백을 추출하였다. 상층액의 단백질 총량은 bicinchoninic acid protein assay kit(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)을 이용하여 분석하였다. 단백추출물은 다시 12 % 또는 15 %의 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동법을 이용하여 분석하였고 gel에서 분리된 폴리펩타이드는 polyvinylidene difluoride membranes (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)로 옮겨져 분석되었다. 면역블롯팅을 위해 항 p 38 항체(카탈로그 넘버 9212, Cell signaling, Danvers, MA) 및 항 인산화된 p38 항체(카탈로그 넘버 9211, Cell signaling, Danvers, MA), 항 JNK 항체(카탈로그 넘버 9252, Cell signaling, Danvers, MA) 및 항 인산화된 JNK 항체(카탈로그 넘버 9251, Cell
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signaling, Danvers, MA), 항 ERK 항체(카탈로그 넘버 9102, Cell signaling, Danvers, MA) 및 항 인산화된 ERK 항체(카탈로그 넘버 9101, Cell signaling, Danvers, MA)를 이용하였다. 단백질 밴드는 ECL enhanced chemiluminescence system (Amersham International, Buckingham-shire, UK)을 이용하여 분석하였고 컴퓨터 기반의 농도계측기(Lap Work Software; Seoulin Bioscience, Seoul, Korea)를 이용하여 밴드를 정량화 하였으며 정량화시에는 베타 액틴을 이용하여 정상 대조군을 참고하였다.
실험에서 도출된 데이터의 통계처리는 연속 변수의 경우 중앙값과 사분위범위 및 박스플롯을 이용하여 표시하였고 혈역학적 지표 및 혈액검사 지표는 비모수적 연속변수로서 반복측정분산분석(repeate d measures analysis of variance)을 이용하여 분석하였다.
조직분석을 통해 얻은 데이터는 Kruskal-Wallis 테스트 및 Mann-Whitney U post-hoc test with Bonferroni 검정을 이용하여 분석하였고 모든 통계분석에서 p값이 0.05보다 작은 경우에 통계적으로 유의한 차이가 있다고 판단하였다. 본 연구에서는 통계분석을 위해 윈도우용 SPSS(SPSS, Chicago, IL) 버전 21.0 프로그램을 이용하였다.
9
결과
총 18마리의 돼지가 심실세동으로 유발된 심정지에서 성공적으로 자발순환이 회복되었고 기본적인 초기 생리학적 지표들(체중, 심폐소생술의 기간, 심정지부터 자발순환회복까지의 기간, 에피네프린 투여량, 심폐소생술시작 2분후의 관상동맥관류압, 제세동시도횟수)은 각 군간 통계적으로 유의한 차이가 없었다.39 초기 혈역학적 지표들(폐동맥 중심체온, 평균동맥압, 중심정맥압) 및 초기 혈액검사 지표들(중심정맥산소포화도, 혈색소수치, 혈당수치, 동맥혈 의 pH, 산소분압, 이산화탄소분압, 염기과잉수치) 역시 각 군간에 통계적으로 유의한 차이는 없었다.39
실험기간 동안 폐동맥 중심체온은 각 치료군의 설정대로 잘 유지되었고 특히 저체온 치료군에서는 자발순환 회복후 4시간이내에 목표 온도에 도달하였다.(그림 1) 실험기간 동안 측정된 혈역학적 지표들(평균동맥압, 중심정맥압, 투여된 수액량, 소변배출량)은 군간 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.(그림 2) 실험기간 동안 혈액검사 지표들 역시 동맥혈 pH 및 염기과잉수치를 제외하고는 각 군간 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으며 동맥혈 pH는 저체온 치료군에서 샴군에 비해 실험기간 내내 통계적으로 유의하게 낮았고(p = 0.012 in HT-24, 0.006 in HT-48) 염기과잉수치는 자발순환 회복후 1시간째에만 샴군에 비해 나머지 군에서 통계적으로 유의하게 낮았다.(p = 0.012 in NT, p = 0.012 in HT-24 and p = 0.012 in HT-
10
48)(그림 3) MAPK 경로의 각 단백질(ERK, p38, JNK)을 웨스턴 블롯팅한 결과는 (그림 4)와 같다.
웨스턴 블롯 결과(그림 4)를 컴퓨터기반 농도계측기로 분석한 결과 인산화된 p38 대 p38의 비율은 모든 군에서 샴군에 비해 통계적으로 유의하게 증가된 소견을 보였고 각 군간 차이는 없었다.
( p = 0.02 in NT, p = 0.02 in HT-24, and p = 0.02 HT- 48)(그림 5) 인산화된 JNK 대 JNK의 비율도 모든 군에서 샴군에 비해 통계적으로 유의하게 증가된 소견을 보였고 각 군간 차이는 없었다. (p=0.09 in NT, p=0.041 in HT-24 and p=0.009 in HT- 48)(그림 6) 마지막으로 인산화된 ERK 대 ERK의 비율은 저체온 치료군에서만 샴군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였는데(p = 0.026 in HT-24, p = 0.002 in HT-48) 특히 48시간 저체온 치료군에서는 샴군 뿐만 아니라 정상체온 유지군보다도 통계적으로 유의하게 증가된 결과를 보였다.(p = 0.002)(그림 7)
11 그림 1. 각 군간 폐동맥 중심체온의 변화
샴군(가는 실선), 정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT, 작은 점선), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24, 굵은 점선), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48, 굵은 실선), 중앙값과 사분위범위를 표시함.
12 그림 2. 각 군간 혈역학적 지표들의 변화
샴군(가는 실선), 정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT, 작은 점선), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24, 굵은 점선), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48, 굵은 실선), 중앙값과 사분위범위를 표시함.
13 그림 3. 각 군간 혈검사 지표들의 변화
샴군(가는 실선), 정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT, 작은 점선), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24, 굵은 점선), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48, 굵은 실선), 중앙값과 사분위범위를 표시함. *표시는 샴군에 비해 p값이 0.05보다 작음을 나타내며 +표시는 샴군에 비해 자발순환회복 1시간째 시점에서만 p값이 0.05보다 작음을 나타냄.
14
그림 4. 각 군간 MAPK경로 단백질의 발현
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그림 5. 각 군간 인산화된 p38 대 p38의 비율
정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48)
*표시는 샴군에 비해 p값이 0.05보다 작음을 나타냄.
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그림 6. 각 군간 인산화된 JNK 대 JNK의 비율
정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48)
*표시는 샴군에 비해 p값이 0.05보다 작음을 나타냄.
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그림 7. 각 군간 인산화된 ERK 대 ERK의 비율
정상체온 유지군(37±0.5 °C, NT), 24시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 24시간 동안 32-34 °C 유지, HT-24), 48시간 저체온 치료군(자발순환 회복후 48시간 동안 32-34 °C 유지, HT-48)
*표시는 샴군에 비해 p값이 0.05보다 작음을 나타낸다. +표시는 정상 체온 유지군에 비해 p값이 0.05보다 작음을 나타냄.
18 그림 8. 실험결과 해석의 모식도
굵은 화살표는 흐름을 나타내며 막힌 실선은 억제작용을 나타내고 가는 화살표는 활성화 작용을 나타낸다. ROS 는 reactive oxygen species, δPKC 는 protein kinase C-δ, Cyto C 는 cytosolic cytochrome C 의 줄임말이며 HT 는 저체온 치료를 나타낸다.
19
고 찰
본 연구를 통해 저체온 치료를 하면 심정지이후 발생하는 뇌조직의 허혈-재관류 손상시에 세포 생존과 관련된 ERK경로가 활성화되는 결과를 확인할 수 있었다. 하지만 동시에 세포의 소멸과 관련된 p38 및 JNK경로도 활성화되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 연구의 가설과는 조금 다른 결과이며 이러한 결과가 도출된 원인 및 해석을 고찰본다면 첫째, 본 연구는 여타 기존의 연구와는 달리 in vivo에서 대형 동물을 대상으로 수행되었다는 차이점이 있다. In vitro연구와 달리 in vivo연구는 여러가지 실험 조건들이 엄격히 통제되고 조절되어야 하는 제한점이 있기에 in vitro실험과는 다른 결과가 도출될 수 있다. 둘째로 심근세포나 제대정맥내피세포 등을 이용한 다른 연구와 달리 뇌의 해마조직을 분석한 결과이므로 세포의 종류에 따른 결과의 차이가 발생할 수 있다. 셋째로 본 연구에서 저체온 치료는 재가온 기간을 포함해서 수행되었기 때문에 재가온을 실시하지 않은 다른 연구들과 결과의 차이가 나타날 수 있다. 재가온이 저체온 치료의 효과에 얼마나 영향을 미쳤는지는 정확히 알 수 없지만 실제로 인간을 대상으로 하는 저체온 치료는 저체온 기간 뿐아니라 재가온 과정에서도 발생 가능한 각종 부작용을 방지하기 위해 집중적인 감시와 세심한 체온조절이 필수적이며 이를 위해 시간당 0.5 ℃ 이하로 재가온을 권장하고 있다. 넷째로 비록 모든 치료군에서 세포 소멸과 관련된 p38 및 JNK경로가 활성화되었지만 실제로 저체온 치료가 p38 및 JNK경로의 활성화를 어느 정도까지는 약화시켰는지의 여부는
20
불분명하다. 그러나 저체온 치료군에서만 세포 생존과 관련된 ERK경로가 동시에 활성화되었기 때문에 두 가지 상반된 경로의 동적인 균형이 세포 보호적인 방향으로 이루어진다면 결과적으로 세포의 생존에 긍정적인 효과를 나타내고 이것이 저체온 치료의 임상효과에 대한 하나의 기전으로 제시될 수 있을 것이다. 앞서 방법론에서 전술한 바와 같이 본 연구는 2014년도에 보고된 연구39의 연장선상에서 수행된 것으로서 이번 연구의 결과를 토대로 저체온 치료의 임상적인 효과에 대한 하나의 기전을 제시한다면 결국 (그림 8)과 같은 모식도를 제안할 수 있을 것으로 생각된다.
또한 비록 통계적으로 유의한 수준은 아니었으나 저체온 치료의 기간이 길어질수록 ERK경로가 활성화되는 정도가 커지는 경향을 보였다는 것도 본 연구에서 특이할 만한 결과라고 할 수 있다.
이러한 결과를 바탕으로 좀더 낮은 중심체온을 유지하거나 좀더 길게 저체온 치료를 유지하는 등의 시도가 임상적인 효과를 가져올 수도 있을 것이라는 예측을 가능하게 한다. 결론적으로 심정지 회복이후 허혈-재관류 손상시에 저체온 치료는 뇌조직의 ERK경로를 활성화시킴으로써 뇌세포를 보호하고 이를 통해 예후를 향상시키는 것으로 추정된다. 본 연구의 결과를 실제 임상에 적용하기 위해서는 좀 더 다양한 환경에서의 실험 결과들이 축적되어야 할 것으로 생각된다.
21
참 고 문 헌
1. Hypothermia After Cardiac Arrest Study Group. Mild therapeutic
hypothermia to improve the neurologic outcome after cardiac arrest. N Engl J
Med 2002;346:549–56.
2. Bernard SA, Gray TW, Buist MD, Bruce M. Jones, William Silvester, Geoff
Gutteridge, et al. Treatment of comatose survivors of out-of-hospital cardiac
arrest with induced hypothermia. N Engl J Med 2002;346:557–63.
3. Lloyd-Jones D, Adams RJ, Brown TM, Mercedes Carnethon, Shifai Dai,
Giovanni De Simone, et al. Heart disease and stroke statistics–2010 update: a
report from the American Heart Association. Circulation 2010;121:e46–e215.
4. Center for Disease Control and Prevention. 2010 In depth analysis for
establishment of cardiac arrest database and calculation of epidemiologic
factor. 2011
5. Nichol G, Thomas E, Callaway CW, Hedges J, Powell JL, Aufderheide TP,
et al. Regional variation in out-of-hospital cardiac arrest incidence and
outcome. JAMA 2008;300:1423–31.
6. Rea TD, Eisenberg MS, Sinibaldi G, White RD. Incidence of EMS-treated
22
out-of-hospital cardiac arrest in the United States. Resuscitation 2004;63:17–
24.
7. Laurent I, Monchi M, Chiche JD, Joly LM, Spaulding C, Bourgeois B, et al.
Reversible myocardial dysfunction in survivors of out-of-hospital cardiac
arrest. J Am Coll Cardiol. 2002;40:2110–16
8. Sunde K, Pytte M, Jacobsen D, Mangschau A, Jensen LP, Smedsrud C, et al.
Implementation of a standardised treatment protocol for post resuscitation
care after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation 2007;73:29–39
9. Laver S, Farrow C, Turner D, Nolan J. Mode of death after admission to an
intensive care unit following cardiac arrest. Intensive Care Med
2004;30:2126–28
10. Nielsen N, Wetterslev J, Cronberg T, Erlinge D, Gasche Y, Hassager C, .et
al. Targeted Temperature Management at 33°C versus 36°C after Cardiac
Arrest. N Engl J Med 2013;369:2197-206
11. Hagerdal M, Harp J, Nilsson L, Siesjo BK. The effect of induced
hypothermia upon oxygen consumption in the rat brain. J Neurochem
1975;24:311-6.
23
12. Horiguchi T, Shimizu K, Ogino M, Suga S, Inamasu J, Kawase T.
Postischemic hypothermia inhibits the generation of hydroxyl radical
following transient forebrain ischemia in rats. J Neurotrauma 2003;20:511–20.
13. Berger C, Schabitz WR, Georgiadis D, Steiner T, Aschoff A, Schwab S.
Effects of hypothermia on excitatory amino acids and metabolism in stroke
patients: a microdialysis study. Stroke 2002;33:519–24.
14. Hachimi-Idrissi S, Van Hemelrijck A, Michotte A, Smolders I, Sarre S,
Ebinger G, et al. Postischemic mild hypothermia reduces neurotransmitter
release and astroglial cell proliferation during reperfusion after asphyxial
cardiac arrest in rats. Brain Res 2004;1019:217–25.
15. Xu L, Yenari MA, Steinberg GK, Giffard RG. Mild hypothermia reduces
apoptosis of mouse neurons in vitro early in the cascade. J Cereb Blood Flow
Metab 2002;22:21–8.
16. Kettner SC, Sitzwohl C, Zimpfer M, Kozek SA, Holzer A, Spiss CK, et al.
The effect of graded hypothermia (36°C–-32°C) on hemostasis in anesthetized
patients without surgical trauma. Anesth Analg 2003;96:1772–6.
17. Akriotis V, Biggar WD. The effects of hypothermia on neutrophil function
24 in vitro. J Leukoc Biol 1985;37:51–61.
18. D’Cruz BJ, Fertig KC, Filiano AJ, Hicks SD, DeFranco DB, Callaway
CW. Hypothermic reperfusion after cardiac arrest augments brain-derived
neurotrophic factor activation. J Cereb Blood Flow Metab 2002;22:843–51.
19. Eberspacher E, Werner C, Englelhard K, Pape M, Laacke L, Winner D, et
al. Long-term effects of hypothermia on neuronal cell death and the
concentration of apoptotic proteins after incomplete cerebral ischemia and
reperfusion in rats. Acta Anaesthesiol Scand 2005;49:477–87.
20. Suehiro E, Fujisawa H, Akimura T, Ishihara H, Kajiwara K, Kato S, et al.
Increased matrix metalloproteinase-9 in blood in association with activation
of interleukin-6 after traumatic brain injury: influence of hypothermic therapy.
J Neurotrauma 2004;21:1706–11.
21. Cobb M, Goldsmith EJ. How MAP kinases are regulated. J Biol Chem
1995;270:14843-6.
22. Davis R. The mitogen-activated protein kinase signal transduction
pathway. J Biol Chem 1993;208:14553-6.
23. Robinson M, Cobb M. Mitogen-activated protein kinase pathways. Curr
25 Opin Cell Biol 1997;9:180-6.
24. Xia Z, Dickens MRJ, Davis R, Greenberg M. Opposing effects of ERK
and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science 1995;270:1326-31.
25. Kummer J, Rao P, Heindenreich K. Apoptosis induced by withdrawal of
trophic factors is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase. J Biol
Chem 1997;272:490-4.
26. Le-Niculescu H, Bonfoco E. Kasuya Y, Claret FX, Green DR, Karin M.
Withdrawal of survival factors results in activation of the JNK pathway in
neuronal cells leading to FAS ligand induction and cell death. Molec Cell Biol
1999;19:751-63.
27. Chen JH, Kuo HC, Lee KF, Tsai TH. Global proteomic analysis of brain
tissues in transient ischemia brain damage in rats. Int J Mol Sci.
2015;16:11873-91.
28. Ozawa H, Shioda S, Dohi K, Matsumoto H, Mizushima H, Zhou CJ,
Funahashi H, Nakai Y, Nakajo S, Matsumoto K. Delayed neuronal cell death
in the rat hippocampus is mediated by the mitogen-activated protein kinase
signal transduction pathway Neurosci Lett;262(1):57-60
26
29. Hicks SD, Parmele KT, Defranco DB, Klann E, Callaway CW.
Hypothermia differentially increases extracellular signal-regulated kinase and
stress-activated protein kinase/c-Jun terminal kinase activation in the
hippocampus during reperfusion after asphyxial cardiac arrest. Neurosci
2000;98:677-85.
30. Hsu CY, Huang CH, Chang WT, Chen HW, Cheng HJ, Tsai MS, et al.
Cardioprotective effect of therapeutic hypothermia for postresuscitation
myocardial dysfunction. Shock 2009;32:210-6.
31. Yang X, Liu Y, Yang XM, Hu F, Cui L, Swingle MR, et al.
Cardioprotection by mild hypothermia during ischemia involves preservation
of ERK activity. Basic Res Cardiol 2011;106:421-30.
32. D'Cruz BJ, Logue ES, Falke E, DeFranco DB, Callaway CW.
Hypothermia and ERK activation after cardiac arrest. Br Res 2005;1064:108-
18.
33. Schmitt KR, Diestel A, Lehnardt S, Schwartlander R, Lange PE, Berger F,
et al. Hypothermia suppresses inflammation via ERK signaling pathway in
stimulated microglial cell J Neuroimmuno. 2007;189:7-16
27
34. Wu D, Ye W, Che X, Yang G. Activation of mitogen-activated protein
kinases after permanent cerebral artery occlusion in mouse brain. J Cerev
Blood Flow Metab 2000;20:1320-30.
35. Alessandrini A, Namura S, Moskowitz M, Bonventre J. MEK1 protein
kinase inhibition protects against damage resulting from focal cerebral
ischemia. Prc Natl Acad Sci USA 1999;96:12866-9.
36. Sawe N, Steinberg G, Zhao H. Dual roles of the MAPK/ERK1/2 cell
signaling pathway after stroke. J Neurosci Res 2008;86:1659-69.
37. Yang D, Xie P, Guo S, Li H. Induction of MAPK phosphatase-1 by
hypothermia inhibitis TNF-alpha-induced endothelial barrier dysfunction and
apoptosis. Cardiovasc Res 2010;85:520-9.
38. Hu WW, Du Ym Li C, Song YJ, Zhang GY. Neuroprotection of
hypothermia against neuronal death in rat hippocampus through inhibiting the
increased assembly of GluR6-PSD95-MLK3 signaling module induced by
cerebral ischemia/reperfusion. Hippocampus 2008;18:386-97.
39. Suh GJ, Kwon WY, Kim KS, Lee HJ, Jeong KY, Jung YS, Lee JH.
Prolonged therapeutic hypothermia is more effective in attenuating brain
28
apoptosis in a Swine cardiac arrest model. Crit Care Med. 2014;42:e132-42
40. Hwang SO, Lee KH, Cho JH, Oh BJ, Gupta DS, Ornato JP, et al:
Simultaneous sternothoracic cardiopulmonary resuscitation: A new method of
cardiopulmonary resuscitation. Resuscitation 2001;48:293–99
41. Gong P, Li CS, Hua R, Zhao H, Tang ZR, Mei X, et al. Mild hypothermia
attenuates mitochondrial oxidative stress by protecting respiratory enzymes
and upregulating MnSOD in a pig model of cardiac arrest. PLoS One
2012;7:e35313
42. Yannopoulos D, Zviman M, Castro V, Kolandaivelu A, Ranjan R, Wilson
RF, et al. Intra-cardiopulmonary resuscitation hypothermia with and without
volume loading in an ischemic model of cardiac arrest. Circulation
2009;120:1426–35
43. Gaieski DF, Band RA, Abella BS, Neumar RW, Fuchs BD, Kolansky DM,
et al. Early goal-directed hemodynamic optimization combined with
therapeutic hypothermia in comatose survivors of out-of-hospital cardiac
arrest. Resuscitation 2009;80:418–24
44. Ravindran J, Gupta N, Agrawal M, Bala Bhaskar AS, Lakshmana Rao PV.
29
Modulation of ROS/MAPK signaling pathways by okadaic acid leads to cell
death via, mitochondrial mediated caspase-dependent mechanism. Apoptosis
2011;16:145–61
30
Abstract
Introduction: We conducted this study to investigate the change of mitogen-
activated protein kinase pathways in the brain tissue after therapeutic
hypothermia in swine cardiac arrest model for presenting the mechanism of
clinical benefit of therapeutic hypothermia.
Methods: After the return of spontaneous circulation by cardiopulmonary
resuscitation following 6 min of no flow time induced by ventricular
fibrillation, pigs(n = 24) were randomly assigned to one of four groups (sham,
normothermia, 24 hr of therapeutic hypothermia, 48 hr of therapeutic
hypothermia). Therapeutic hypothermia (core temperature 32-34 °C) was
maintained and the pigs were then rewarmed for 8 hr. At 60 hr after the return
of spontaneous circulation, the pigs were sacrificed and brain tissues were
harvested.
Results: We measured the tissue levels of p38, JNK, and ERK pathway expressions in swine brain hippocampus of the four groups. The
phosphorylated p38 to p38 ratio and phosphorylated JNK to JNK ratios were
31
significantly increased in all of the intervention groups, relative to the sham
group. The phosphorylated ERK to ERK ratio was increased only in the
therapeutic hypothermia groups (p-value = 0.026 in the 24 hr of therapeutic
hypothermia group and p-value = 0.002 in the 48 hr of therapeutic
hypothermia group, both compared to the sham group).
Conclusion: Therapeutic hypothermia activated the ERK pathway in
ischemia-reperfusion injury of brain tissue after cardiac arrest, which seemed
to be duration of therapeutic hypothermia dependent. The p38 and JNK
pathways were also activated during therapeutic hypothermia and
normothermia. But the ERK pathway was activated only in the therapeutic
hypothermia.
---
Keywords: heart arrest; hypothermia, induced; Mitogen-Activated Protein Kinases
Student number: 2013 – 21661
