Ⅲ 수질분석
3. 총대장균군(Total Coliform)
나. 분석준비
방법 및 시료 보관 1)
구 분 내 용
방 법
시 료 보 관
막여과법
막여과법은 액체 내 존재하는 미생물을 여과막으로 거른 후 이를 배양하여 미생물의 존재 유무 및 개체수를 측정하는 생균 측정법(viable count)으로, 0| 시험방법은 수계에 존재하는 총대장균군과 분원성대장균군을 분석하는 주된 시험방법 중 하나
시료용기 : P(polyethylene), G(glass)에 저온(10 ℃ 이하) 보관 최대보존기간(권장보존기간) : 24시간
조 성 성 분
효모 추출물(yeast extract) 트립토오스(tryptose)
카지톤(casiton) 또는 트리프티케이스(trypticase) 또는 트립톤(tryptone) 락토오스(lactose, C12H22O11, 분자량 : 342.30)
치오펩톤(thiopeptone) 또는 치오톤(thiotone) 또는 펩톤 P(Peptone P) 데속시콜린산나트륨(sodium desoxycholate)
염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.50)
인산일수소칼륨(dipotasium phosphate, K2HPO4, 분자량 : 174.18) 인산이수소칼륨(monopotasium phosphate, K2HPO4, 분자량 : 136.09) 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate)
아황산나트륨(sodium sulfite, Na2SO3, 분자량 : 126.10) 염기성푹신(basic fuchsin)
한천(agar, (C12H18O9)n
1.2 g 7.5 g 3.7 g 9.4 g 3.7 g 0.1 g 3.7 g 3.3 g 1.0 g 0.05 g 1.6 g 0.8 g 10∼15 g [막여과법 고체배지(m-Endo agar LES) 조성]
필요시약 2)
배지 (고체배지, 액체배지, 시판 중인 제품 중 택1) (1) 막여과법 고체배지
(가) 에탄올(95 %) 20 mL를 포함한 정제수 1L에 배지를 다음 표의 막여과법 고체배지 조성대로 넣고 pH (7.2 ± 0.2)를 확인한 다음 완전히 녹을 때까지 저어주면서 끓인 후, 45 ℃ ∼ 50 ℃까지 식힌 다음 5 mL∼ 7 mL를 페트리접시에 부어 굳힌다. 이 때 고압증기멸균하지 않는다.
(나) 조제된 배지는 2 ℃ ∼ 8 ℃의 냉암소에서 2주간 보관할 수 있다.
가)
(2) 막여과법 액체배지
(가) 고체배지와 마찬가지로 에탄올(95 %) 20 mL를 포함한 정제수 1L에 다음의 막여과법 액체배지 조성대로 넣고 pH (7.2 ± 0.2)를 확인한 다음 완전히 녹을 때까지 저어주면서 끓인 후, 45 ℃ ∼ 50 ℃ 까지 식힌 다음 사용한다. 이 때 고압증기멸균하지 않는다.
(나) 조제된 배지는 2 ℃ ∼ 8 ℃의 냉암소에서 96시간 동안 보관할 수 있다.
(3) 시판 중인 액체 배지(m-Endo Broth, plastic Ampules)
(가) 시판 중인 m-Endo Broth 액체배지(2 mL 플라스틱 엠플에 개별 포장된 제품)를 사용한다.
(나) 액상배지는 상대적으로 유통기한이 짧기 때문에 월간 시험물량 등을 고려하여 구입하는 것이 좋으며, 제조일로부터 시간이 경과될수록 배지의 신선도가 떨어져 대장균의 금속성 광택의 발현이 잘 안 되는 경향이 있다.
(다) 일반세균이 폭증하는 여름철의 경우 대장균 계수가 어려울 수 있는데，이때 신선한 배지를 사용하면 대장균 계수가 보다 용이해 질 수도 있다.
[막여과법 액체배지(m-Endo) 조성]
조 성 성 분
효모 추출물(yeast extract)
트립토오스(tryptose) 또는 폴리펩톤(polypeptone) 카지톤(casiton) 또는 트리프티케이스(trypticase) 락토오스(lactose, C12H22O11, 분자량 : 342.30) 치오펩톤(thiopeptone) 또는 치오톤(thiotone) 데속시콜린산나트륨(sodium desoxycholate) 염화나트륨(sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.50)
인산일수소칼륨(dipotasium phosphate, K2HPO4, 분자량 : 174.18) 인산이수소칼륨(monopotasium phosphate, KH2PO4, 분자량 : 136.09) 라우릴황산나트륨(sodium lauryl sulfate)
아황산나트륨(sodium sulfite, Na2SO3, 분자량 : 126.10) 염기성푹신(basic fuchsin)
1.5 g 10.0 g 5.0 g 12.5 g 5.0 g 0.1 g 5.0 g 4.375 g 1.375 g 0.05 g 2.1 g 1.05 g
인산완충희석액
(1) 인산이수소칼륨(monopotassium phosphate, KH2PO4, 분자량: 136.09) 34 g을 500 mL의 정제수에 녹인 후 수산화나트륨용액(0.5 M)으로 실온에서 pH (7.2 ± 0.2)를 확인한 다음 후 정제수를 넣어 1 L가 되도록 만들어 이를 보존용 원액으로 함.
나)
시료 종류별 예상 시료량 선정
공단 계곡수의 경우, 수질오염공정시험법 시료 분류에 명시되어 있지 않다. 따라서 명시된 항목 중에서 상수원수가 공단의 계곡수와 가장 유사하기 때문에 아래 표의 상수원수 기준으로 시료를 여과한다. 그러나 실험자가 오염이 심하여 대장균 군락수가 상당히 많이 나올 것으로 예상되면 실험자 판단 하에 하천수 등의 기준으로 여과 시료량을 줄여서 실험을 진행한다.
3)
※ 참고: 계곡수 총대장균군 실험 제안 시료 부피(mL)
- 수질오염공정시험법 기준(집락개수 20개 ~ 80개)에 맞게 측정하기 위해서 원시료량 5 mL, 10 mL를 시료량으로 하여 실험 진행
- 원시료 여과량이 많으면 총대장균군 군락이 너무 많아 계수가 불가능함
올바른 예(20개~80개) 잘못된 예(TNTC)
*TNTC:
Too Numerous To Count의 약자로 숫자를 세기에 너무 많다는 뜻
[시료의 종류에 따른 여과 예상 시료량]
여과해야할 예상 시료량(mL)
○ ○ ○
○ ○ ○
○ ○ ○ ○
○ ○ ○
○ ○ ○ ○
시료의 종류
호소, 저수지수 상수원수 위락용수 하천수 염소 소독한 하수
하수 원수
100 50 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001
(2) 보존용 원액 1.25 mL 와 염화마그네슘·6수화물(magnesium chloride, MgCI2·6H2O, 분자량 : 203.30) 81.1 g을 정제수 1 L에 녹여 만든 염화마그네슘용액 5.0 mL를 넣은 다음 정제수로 1 L가 되도록 하여 인산완충희석액을 만든 후 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균하여 사용
펩톤희석액
정제수에 10 % 펩톤(peptone) 용액을 넣어 펩톤의 최종 농도가 0.1 %가 되도록 희석하고, 실온에서 pH (6.8 土 0.2)를 확인한 다음 121 ℃에서 15분간 고압증기멸균하여 사용
다)
다. 실험
실험 준비물품 1)
막여과장치
직경 47 mm 크기의 여과막을 끼워서 여과할 수 있게 하는 장치로 화염멸균 등을 이용한 무균조작이 가능하도록 금속재질의 장치를 사용하여야 한다.
배양기
배양온도를 (35 ± 0.5) ℃로 유지할 수 있는 것을 사용한다.
여과막 및 멸균흡수패드
셀를로오즈 나이트레이트(cellulose nitrate)나 셀를로오즈 에스테르(cellulose ester) 재질로 공경(pore size) 0.45 μm, 직경 47 mm 크기의 미생물 분석용 여과막을 사용하며, 보통 지표미생물 배양에는 셀를로오즈 나이트레이트(cellulose nitrate)가 일반적으로 사용되며 콜로니의 계수가 용이하도록 격자 무늬가 있는 여과막을 사용하는 것이 편리하다. 여과막 구입 시 공경 크기에 따라 대장균군이 여과되지 못하고 막을 통과할 수도 있으므로 공경을 반드시 확인하여야 한다. 흡수패드는 두꺼운 여지의 직경 47 mm 크기의 멸균된 것을 사용한다. 일부 시판되는 막여과 제품 중에는 흡수패드가 함께 포함된 경우도 있어 멸균흡수패드가 장착된 페트리 접시를 구매할 경우 흡수패드가 중복되므로 여과막 구매 시 멸균흡수패드 포함 여부도 고려 대상이다.
페트리접시
지름 50 mm, 높이 9 mm, 지름 60 mm, 높이 15 mm의 멸균 포장된 1회용 플라스틱 제품 또는 유리제품인 경우에는 고압멸균기 등을 이용하여 멸균된 것을 사용한다. 일회용제품의 경우 멸균흡수패드가 장착되어 있는 제품도 시판되고 있다.
※ 공단의 경우 멸균흡수패드와 페트리접시가 합쳐지고, 상대적으로 오염위험이 적으며 간편한 1회용 개별 포장된 대장균 모니터(monitor: 47 mm nitrocellulose fixed membrane. s terile)를 사용하기로 한다.
피펫
부피 5 mL ∼ 25 mL의 눈금피펫이나 자동피펫(플라스틱 피펫팁 포함)으로서 멸균된 것을 사용한다.
핀셋
끝이 뭉툭하고 넓으며 여과막을 집어 올릴 때 여과막을 손상시키지 않는 형태의 것으로 화염멸균 가능한 것을 사용한다.
가)
나)
다)
라)
마)
바)
매니폴드 감압 플라스크 진공펌프
여과장치 결합모습 배양기(35 ± 0.5) ℃ 대장균 배양 모니터
일회용 멸균 피펫 배양액(M-Endo) 피펫필러
실험순서 2)
3)
기기 화염멸균
시료 여과
막여과장치의 여과막이 접촉하는 부분과 핀셋을 화염멸균 시킨 후 온도를 45 ℃
～
50 ℃까지 식힘.최종 세균 집락 개수가 20개
～
80개 사이에 들도록 시료량을 조절하여 여과관 상부에 주입배양액 주입 배양액 2 mL 주입
(35 ± 0.5) ℃ 배양 22시간
～
24시간 배양대장균 계수 금속성 광택을 띠는 분홍이나 진홍색 계통의 집락 계수 실험절차 흐름도
시료 병을 상하좌우로 흔들어서 시료를 균질하게 섞어준다.
여과막을 막여과장치에 장착하기 바로 전에 가스버너 등을 이용하여 막여과장치의 여과막이 접촉하는 부분과 핀셋을 화염멸균 시킨 후 온도를 45 °C
～
50 °C까지 식힌다.매니폴드에 대장균 배양 모니터를 장착한다.(GVS Monitor;47 mm Nitrocellulose, 0.45 μ m, Fixed Membrane, Sterile 제품 사용)
최종 세균 집락 개수가 20개
～
80개 사이에 들도록 시료량을 조절하여 여과관 상부에 주입한다. 총대장균수를 예측할 수 없을 경우에는 동일 시료의 희석량을 10배 간격으로 달리하여 약 3개 이상 여과한다. 이때 시료량이 10 mL 보다 적을 경우에는 시료의 균질화를 위하여 멸균된 희석액으로 희석하여 여과하여야 한다. 시료를 희석하고자 할 때에는 멸균된 희석액 40 mL ~ 50 mL를 여과관 상부에 주입 후 시료를 주입하여 여과한다. 시료의 여과가 완료되기 직전에 다시 20 mL ~ 30 mL의 멸균수로 깔때기 등을 씻어주면서 여과한다.시료를 여과한 모니터를 매니폴드와 분리한 후, 뒤집어서 배양액 2 mL(M-Endo Coliform Broth Liquid M)를 주입하여 흡수패드에 배양액을 흡수시킨다.
페트리접시를 거꾸로 배양기에 위치시킨 후 (35 ± 0.5) °C에서 22시간
～
24시간 배양한다.온도가 해당 범위 밖일 경우, 대장균이 자라지 않을 수 있으니 온도 조정에 주의하여야 한다.
가) 나)
다)
라)
마)
바)
4) 실험과정
1. 기기 화염멸균 2. 시료 여과 3. 배양액 주입
4. 뚜껑 닫기 5. 35 ± 0.5 ℃ 배양 6. 대장균 계수
결과 해석 5)
총대장균군수/100 mL = 생성된 집락수/여과한 시료량(mL) x 100
총대장균군의 경우 배양 후 금속성 광택을 띠는 분홍이나 진홍색 계통의 집락을 계수한다.
집락수가 20개
～
80개의 범위에 드는 것을 선정하여 다음의 식에 의해 계산한다.이때 배지표면에 총대장균군 외의 다른 세균이 너무 많이 자랐을 경우에는 이와 같은 내용을 비고에 기록하고 다시 같은 지점의 시료를 채취하여 검사한다. 재검사시에는 시료의 여과량을 줄이고 여과막의 수를 늘려 다른 세균에 의한 간섭현상을 줄인다. 신선한 배지를 사용하는 방법도 유용할 수 있다.
가)
나)
예시
계곡수 C시료를 50 mL, 10 mL 그리고 1 mL씩 여과한 후 배양한 결과, 금속성 광택의 붉은 집락수가 78, 20 그리고 3일때, 이 시료의 총대장균군수는 몇 개인가?
Q1
먼저 총대장균군의 군락이 유효범위(20개 ~ 80개) 내에 있는지 확인한다.
유효범위(20개 ~ 80개) 내에 있는 것만을 선택하여 아래와 같이 계산한다.
따라서, 계곡수 C시료의 총대장균군수는 163 군수/100 mL이다.
A1
군락 수 구 분
유효범위
78 50 mL
○
20 10 mL
○
3 1 mL
×
유효군락수1+유효군락수1 유효시료량1+유효시료량2
78+20 50+10
×100＝ ×100＝ 163.333...
계곡수 D시료를 50 mL, 25 mL 그리고 10 mL씩 여과한 후 배양한 결과, 금속성 광택의 붉은 집락수가 15, 6, 0으로 모두 유효범위(20개 ~ 80개) 미만일 때, 이 시료의 총대장균군수는 몇 개인가?
Q2
실험결과가 모두 유효범위에 들지 않으면 모든 실험결과의 값을 이용하여 아래와 같이 계산한다.
따라서, 계곡수 D시료의 총대장균군수는 25 군수/100 mL이다.
A2
군락 수 구 분
유효범위
15 50 mL
×
6 25 mL
×
0 10 mL
×
15+6+0
50+25+10 ×100＝ 24.705...