다. 실험
실험 준비물품 1)
매니폴드 감압 플라스크 진공펌프
여과장치 결합모습 배양기(44.5 ± 0.2) ℃ 대장균 배양 모니터
일회용 멸균 피펫 배양액(M-Endo) 피펫필러
※ 공단의 경우 멸균흡수패드와 페트리접시가 합쳐지고, 상대적으로 오염위험이 적으며 간편한 1회용 개별 포장된 대장균 모니터(monitor: 47 mm nitrocellulose fixed membrane.
sterile)를 사용하기로 한다.
피펫
부피 5 mL∼25 mL의 눈금피펫이나 자동피펫(플라스틱 피펫팁 포함)으로서 멸균된 것을 사용한다.
핀셋
끝이 뭉툭하고 넓으며 여과막을 집어 올릴 때 여과막을 손상시키지 않는 형태의 것으로 화염멸균 가능한 것을 사용한다.
마)
바)
3)
기기 화염멸균
시료 여과
막여과장치의 여과막이 접촉하는 부분과 핀셋을 화염멸균 시킨 후 온도를 45 ℃
～
50 ℃까지 식힘.최종 세균 집락 개수가 20개
～
60개 사이에 들도록 시료량을 조절하여 여과관 상부에 주입배양액 주입 배양액 2 mL 주입
(44.5 ± 0.2) ℃ 배양 22시간
～
24시간 배양대장균 계수 금속성 광택을 띠는 파란색 계통의 집락 계수 실험절차 흐름도
2) 실험순서
시료 병을 상하좌우로 흔들어서 시료를 균질하게 섞어준다.
여과막을 막여과장치에 장착하기 바로 전에 가스버너 등을 이용하여 막여과장치의 여과막이 접촉하는 부분과 핀셋을 화염멸균 시킨 후 온도를 45 °C
～
50 °C까지 식힌다.매니폴드에 대장균 배양 모니터를 장착한다.(GVS Monitor;47 mm Nitrocellulose, 0.45 μ m, Fixed Membrane, Sterile 제품 사용)
최종 세균 집락 개수가 20개
～
60개 사이에 들도록 시료량을 조절하여 여과관 상부에 주입한다. 총대장균수를 예측할 수 없을 경우에는 동일 시료의 희석량을 10배 간격으로 달리하여 약 3개 이상 여과한다. 이때 시료량이 10 mL 보다 적을 경우에는 시료의 균질화를 위하여 멸균된 희석액으로 희석하여 여과하여야 한다. 시료를 희석하고자 할 때에는 멸균된 희석액 40 mL ~ 50 mL를 여과관 상부에 주입 후 시료를 주입하여 여과한다. 시료의 여과가 완료되기 직전에 다시 20 mL ~ 30 mL의 멸균수로 깔때기 등을 씻어주면서 여과한다.시료를 여과한 모니터를 매니폴드와 분리한 후, 뒤집어서 배양액 2 mL(m-FC with rosolic acid)를 주입하여 흡수패드에 배양액을 흡수시킨다.
페트리접시를 거꾸로 배양기에 위치시킨 후 (44.5 ± 0.2) °C에서 22시간
～
24시간 배양한다. 온도가 해당 범위 밖일 경우, 대장균이 자라지 않을 수 있으니 온도 조정에 주의하여야 한다.가) 나)
다)
라)
마)
바)
4) 실험과정
1. 기기 화염멸균 2. 시료 여과 3. 뚜껑 닫기
4. 배양액 주입 5. 44.5 ± 0.2 ℃ 배양 6. 대장균 계수
결과 해석 5)
분원성대장균군수/100 mL = 생성된 집락수/여과한 시료량 (mL) x 100
분원성대장균군의 경우 배양 후 금속성 광택을 띠는 파란색 계통의 집락을 계수한다. 집락수가 20개 ~ 60개의 범위에 드는 것을 선정하여 다음의 식에 의해 계산한다.
이 때 배지표면에 대장균군 외의 다른 세균이 너무 많이 자랐을 경우에는 이와 같은 내용을 비고에 기록하고 다시 같은 지점의 시료를 채취하여 검사한다. 재검사시에는 시료의 여과량을 줄이고 여과막의 수를 늘려 다른 세균에 의한 간섭현상을 줄인다. 신선한 배지를 사용하는 방법도 유용할 수 있다.
가)
나)