약학회지 제 42 권 제 2 호 144-148(1998) Yakhak Hoeji Vol. 42. No. 2
생약으로부터 / / I vitro DNA 결합활성의 검색
김윤설 • 정세준 • 신화우 • 김윤철 "
원광대학교 약학대학 ^
(Received January 3, 1998)
Screening of In vitro DNA-binding Activity from the Crude Drugs
Youn-Seol Kim, Sei-Joon Jeong, Hwa-Woo Shin and Youn-Chul Kim*
College of Pharmacy, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea
Abstract— One hundred and seventeen crude drugs were screened for DNA-binding activity in vitro.
The DNA-methyl green assay is a useful biochemical screen for the detection or development of bio
logically active compounds which bind to DNA. This assay is based upon the fact that free methyl green undergoes rapid spontaneous molecular rearrangement to its colorless carbinol base so that the liberation of the dye from DNA by displacement can be followed spectrophotometrically as a decrease in absorbance at 650 nm. Seven methanolic extracts of crude drugs including Cinnamomi Cortex spissus, Coicis Semen, Coptidis Rhizoma, Perillae Semen, Plantaginis ^rn e n , Polygalae Radix and Zan
thoxyli Fructus showed less than 2.000 M-g/m/ as their ICso values. The active principles of Plantaginis Semen and Zanthoxyli Fructus were transferred into organic solvents, which showed the IC» values with 588 and 574 나 g/m/. respectively. These fractions have been selected for isolation of biologically ac
tive constituents.
Keywords DNA-binding activity. DNA-methyl green assay. , Crude drugs.
DNA와 결합하는 화합물은 생리활성을 나타내는 것 으로 알려져 있다. 즉, 항말라리아 약물인 quina- crine, chloroquine, 항종양 활성 항생물질인 an- thramycin methyl ether, adriamycin, daunoru
bicin 등이 DNA와 결합한다는 사실이 밝혀졌다.
또한, 핵산과 상호작용하는 약물둘은 암치료를 위한 가 장 유용한 화학요범제 중의 하나이다. 이와 같은 사실 에 입각하여 활성물질외 발견을 위한 방범 중의 하나로 핵산에 선택적으로 작용하는 화합물외 검색이 이루어 지고 있다.
Triphenylmethane 염 료 인 methyl green (MG) 온 DNA의 조직화학적 염색시약이며, M G이 DNA와 결합한 DNA-methyl green(DNA-MG)은 일반적으
* 본 논문에 관한 문의는 이 저자에 게로
( 전화 ) 0653-850-6823 ( 팩스 ) 0653-52-8837
로 deoxyribonuclease(DNase)에 대한 기질로서 이 용되 고 있다 ® DNA-MG이 DNA와 결합능을 가지고 있는 물질과 반응하게 되면 이 물질과 DNA-MG의 MG과 치환된다. 유리된 MG은 pH 5.0이상에서 신속 하게 H 2 O 한 분자가 부가되어 무색의 carbin이을 형 성하게 된다.® 이와 같은 원리를 이용한 DNA-MG assay"**는 단순한 spectrophotometer와 DNA- MG만을 필요로 하는 간단한 방범으로 단시간 내에 검 체외 DNA 결합능을 측정할 수 있어서 천연물로부터 DNA 결함능을 가지는 생리활성물질의 탐색을 목적으 로 이용되고 있다;
저자 등은 천연물로부터 DNA결함능을 가지는 물질 을 탐색할 목적으로 한방 및 민간에서 널리 사용되고 있 는 생약 중 117중을 무작위로 선정하고 각각의 methanol 추출물에 대하여 DNA-MG assay를 이용 하여 검색을 실시하여 보고하고자 한다.
144
Achyranthis Radix ( 우슬 ) Aconiti Tuber( 부자 )
Acori gram inei R hizom a( 석창포 ) Akebiae Caulis ( 목통 )
Alism atis R hizom a( 텍사 ) Amomi tsao-ko Fructus ( 초과 ) Ampelopsis R adix( 백렴 ) Alpiniae F ructus( 익지인 ) Amomi Semen ( 사인 )
Anemarrhenae Rhizom a( 지모 ) Angelicae dahuricae R adix( 백지 ) Angelicae gigantis R adix (당귀 ) Angelicae koreanae Radix( 강활 ) Arctii Semen( 우방자 )
Araliae cordatae R adix( 득활 ) Arecae Semen ( 빈랑자 ) Arisaem atis Tuber( 천남성 ) Armeniacae SGm6ri( 행인 ) Artemisiae asiaticae Herba (*^1) *3) Artemisiae capillaris Herba ( 인진호 ) Asiasari Radix( 세신 )
Asparagi T ub e r(^ 문동 ) Astragali R adix (황기 ) Atractylodis Rhizom a( 창출 ) Atractylodis Rhizom a alba( 백출 ) A urantii Fructus ( 지각 )
A urantii im m atri Pericarpium ( 청피 ) A urantii nobilis Pericarpium (진괴 ) Bambusae Caulis in Taeniam ( 죽여 ) Bombycis Corpus( 백강잠 )
Bupleuri R adix( 시호 ) Caesalpiniae L ignum ( 소목 ) Cartham i Flos ( 홍화 ) Cassiae Semen( 결명자 ) Chaenomelis Fructus ( 모과 ) Chrysanthem i Flos ( 감국 ) Cimicifagae Rhizom a( 승마 ) Cinnam om i Cortex ( 계피 ) Cinnam om i Cortex spissus( 육계 ) C nidii Rhizom a( 천궁 )
Vol 42, No. 2, 1998
생약외 In vitro DNA 결합활성 검색 145
실험방법
시약 및 기기 - DNA methyl green. Doxoru
bicin HCI 은 Sigma 사의 제품을 사용하였으며 . 기타 시약 및 용매는 분석용 특급 또는 1 급 시약을 시•용하였 다 . 흡광도 측정 을 위 하여 ELISA Reader (Molecu
lar Devices) 를 사용하였다 .
재료 및 시료의 조제 - 본 실험에서 사용한 생약은 익산시 소재 한약재상에서 구입하여 감별한 후 세절하 여 시 * 용하였으며 . 증거표본은 원광대학교 약학대학 생 약표본실에 보관되어 있다 (Table I). 건조된 생약 80 트을 MeOH 로 실온에서 3 일간 2 회 추출한 후 여과하고
여액을 40T ； 이하에서 감압농측하여 M eOH 추출물을 얻었다 . MeOH 추출물은 E tO H 에 용해시켜 시료용액 으로 사용하였다 . 각 M eOH 추출물의 2.000, 1.000.
50(Hig/m /용액을 이용하여 1 차 활성검색을 실시하였 으며 , ICso 치가 2.000 |xg/m /이하를 나타낸 M eOH 추 출물에 대해서는 80% 수성 M eOH 에 용해시킨 후 n- hexane 으로 추출하여 n-hexane 기용부를 얻었다 . 80% 수성 MeOH 분획은 중류수를 가하여 60% 수성 MeOH 로 하고 여기에 CHC 13 을 가하여 용매분획을 행 하여 CHC 13 과 60% 수성 M eOH 분획을 얻었다 . 얻어 진 n-hexane. CHCI 3 및 60% 수성 M eOH 용매분획 은 1 차 검색에서와 동일한 농도의 시료용액을 조제하고
Table I Activity of the methanolic extract of crude drugs in the DNA-methyl green assay
Samples Voucher specimen ICsoC^g/m/) Value*
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Coicis Sem en( 의이인 ) Coptidis Rhizom a( 황련 ) C om i Fructus ( 산수유 ) Crataegi Pructus( 산사자 ) Cuscutae Semen ( 토사자 ) Cyperi Rhizom a( 향부자 ) Dioscoreae Rhizom a( 산약 ) Elsholtziae Herba( 향유 ) Ephedrae Herba( 마환 ) Eucommiae Cortex( 두층 ) Evodiae Fructus Farfarae Flos ( 관동화 ) Foeniculi Fructus (회 향 ) Forsythiae Fructus( 연교 ) Fraxini Cortex( 진피 ) Fritillariae B ulbus( 페모 ) Gardeniae FructusO 치자 ) Gastrodiae Rhizom a( 천마 )
Gentianae macrophyllae R adix( 진교 ) Gentianae Scabrae Radix( 용담 ) Gleditsiae Spina ( 조각자 )
Glycine Semen G erm inatum ( 대두황권 ) Glycyrrhizae Radix( 감초 )
Hoelen( 복령 )
Hordei Fructus G erm inatus ( 맥아 ) Liriopis Tuber( 맥문동 )
Lithosperm i Radix ( 자근 ) Lonicerae Flos ( 금은화 ) Lycii Fructus( 구기자 ) Lycii Radicis Cortex (지골괴 ) M achili Cortex ( 후박 ) M agnoiiae Flos ( 신이 ) M enthae Herba( 박하 ) Mori Radicis Cortex( 상백괴 ) M outan Cortex liadicis ( 목단피 ) N elum binis Sem en( 연자육 ) Nepetae Spica( 형개 ) Paeoniae 효 adix( 작약 ) Patriniae Radix ( 패장 ) Perilliae Herba( 소엽 ) Perilliae Semen( 소자 ) Persicae Semen( 도인 ) Phellodendri Cortex( 황백 ) Pinelliae Tuber ( 반하 ) Piperis longi Fructus( 필발 ) Plantaginis Semen( 차전자 ) Platycodi R adix( 길경 ) Polygalae R adix( 원지 )
Polygon! avicularis Herba ( 편측 ) Polygoni m ultiflori Radix( 하수오 ) Polyporus (저 령 )
Ponciri Fructus ( 지실 )*' Prunellae Spica( 하고초 ) Puerariae Radix ( 같근 ) Rehm anniae Radix( 건지황 ) R ubi Fructus ( 복분자 ) Salviae Radix( 단삼 ) Sanguisorbae Radix( 지유 ) Santalini Lignum rubrum ( 자단향 ) Saussureae R adix(-^^)
J. Pharm. Soc. Korea
146 김윤설 ■ 정세준 • 신화*우 ■ 김윤철
Table I—Continued
Samples Voucher specimen ICsoCM-g/m/) Value*
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W P 339
W P 500
W P 203
W P 202
W P 438
W P 474
W P 204
W P 475
W P 119
W P 109
W P 297
W P 040
W P 506
W P 278
W P 399
W P 443
W P 427
W P 408
W P 396
W P 307
W P 397
W P 093
W P 007
W P 178
W P 124
W P 123
W P 346
W P 062
W P 048
W P 389
W P 507
W P 264
W P 144
W P 212
W P 131
W P 280
W P 481
W P 357
W P 444
W P 246
W P 245
W F 101
W P 502
W P 147
W P 449
W P 401
W P 064
W P 323
W P 445
W P 452
W P 362
W P 393
W P 451
W P 002
W P 395
W P 179
W P 087
W P 394
W P 347
W P 137
Schizandrae Fructus ( 오머자 ) Scirpi Rhizom a ( 삼롱 ) Scrophulariae Radix( 현삼 ) Scutellariae Radix ( 횡 ^ )
Sinomeni Caulis et Rhizom a (방기 ) Sophorae Flos ( 괴화 )
Sophorae R adix( 고삼 ) Torilidis F ructus( 시상자 ■ ) Trichosanthis Semen( 괄루인 ) Trichosanthis R adix( 괄루근 ) Typhae Pollen C 포황 ) Viticis F ructus( 만형자 ) X anthii Fructus ( 창이자 ) Zanthoxyli Fructus ( 산초 ) Zedoariae Rhizom a (-§-#) Zyzyphi spinosi Sem en( 산조인 )
Values represent the concentration required for a 50% decrease in the in itial absorbance of the DNA-methyl green solution.
2 차 활성검색에 적용하였다 .
DNA 결합농 측정 - DNA 결합능 측정은 Burres 동
"^•외 방법을 이용하였다 . 즉 , DNA-MG 20 mg 을 7.5 mM MgSCX 를 함유하는 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)100m H 현탁시키고 차광하고 37°C 에서 24 시간 교반하여 DNA-MG 용액을 조제한다 . 검색시료 는 EtO H 에 용해하고 20 씩 96-well microplate 에 넣는다 . 감압하에서 EtO H 를 증발 건조시키고 DNA- MG 용액 200 나/씩 넣은 후 ELISA Reader 를 사용하 여 650nm 에서 흡광도를 측정하고 24 시간 동안 실온 에서 차광상태로 방처한다 . 24 시간 경과 후 다시 650 nm 에서 흡광도를 측정하여 최종 흡광도치와 최초 흡광 도처의 차로부터 감소된 흡광도치를 계산하였다 . con
tro l^ DNA-MG 용액 대신 Tris-HCl buffer 를 사용하 였고 각 실험은 3 회 실행하여 평균치를 구하였다 . 또한 . DNA 결합능의 비교롤 위해 단계별 희석용액의 흡광도 감소율로부터 linear reggression 법을 이용하여 1C
5 o(Inhibition concentration necessary to decrea
se 50% of the absorbance) 를 구하였다 . 흡광도 감소율 (%) =
(IS 흡광도 -1C 흡광도 )-(2S 흡광도 -2C 흡광도 )
(1S 흡광도 -1C 흡광도 ) ： 100
1S 흡광도 ： DNA-MG 을 넣고 처옴 측정한 시료외 흡광도
1C 흡광도 ： Tris-buffer 를 넣고 처옴 측정한 con- trol 외 흡광도
2S 흡광도 ： 24 시간 후 측정한 시료의 흡광도 2C 흡광도 ： 24 시간 후 측정한 control 외 흡광도
결과 및 고찰
117 중 생약의 MeOH 추출물에 대하여 DNA-bind- ing assay 를 이용하여 DNA 결합능을 검색하였다 (Table I). 육계 , 의이인 , 황련 , 소자 , 차전자 , 원지 , 산 초 등 7 종 생약의 MeOH 추출물 시료에서 ICso 치가 2,000 이하의 DNA 결합능을 나타내었다 . 1 차 검색에서 선별된 7 종의 MeOH 추출물에 대해서는 용 메분획을 실시하여 활성물질의 유기용매로의 이행을 검토하였다 . 즉 , 각각의 MeOH 추출물에 대한 용매분 획을 행하여 «-hexane, CHCI 3 및 60% 수성 M eOH 분획을 얻었으며 , 이들 분획의 DNA 결합능 실험결과 는 Table II 와 같다 . 7 종의 모든 생약에 있어서 활성성 분이 유기용매층으로 이행됨을 알 수 있었다 . 특히 , 차 전자와 산초의 «-hexane 가용부가 가장 높은 활성을 보였으며 , 각각 588 및 574ng/mZ 외 ICso 치를 나타내 었으며 이는 DNA 결합눙을 가지는 양성 대조약물인 doxorubicin(IC50=47.5 Hg/m/) 에 버하여 낮은 활성 을 보였다 . 그러나 이돌 «-hexane 가용부에는 많은 화 합물들의 존재가 TLC 로 확인되었으며 , 본 활성검색법 을 이용하여 분리되는 단일의 활성물질은 높은 활성을 나타낼 것으로 생각된다 . 한편 , 육계 , 외이인 , 황련 , 소 자 , 원지 등 5 종의 생약에 있어서는 활성성분이 유기용 매층으로 이행되었으나 , 각각의 M eOH 추출물에서와
Vol. 42, No. 2, 1998
생약외 In vitro DNA 결합활성 검색 147
Table I—Continued
Samples Voucher specimen ICsoCM-g/mO Value*
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0
o o o o o o o o o o o o o
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2.
2, 2.
2, 2, 2.
2.
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2.
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W P 295
W P 208
W P 476
W P 498
W P 148
W P 046
W P 030
W P 194
W P 043
W P 042
W P 447
W P 120
W P 402
W P 207
W P 181
W P 206
Cinnam om i Cortex spissus Coicis Semen
Coptidis Rhizom a Perillae Semen P lantaginis Semen Polygalae Radix Zanthoxyli Fructus
Values represent the concentration required for a 50% decrease in the in itial absorbance of the DNA-methyl green solution.
동등하거나 약간외 활성 중가만을 나타내었다. 이는 이 들 n-hexane 가■&•부가 dnA-MG 용액에 대하여 난용 성인 것에 기인하는 것으로 생각된다.
DNA-MG assay에 있어서 DNA-MG 복합체로부 터 MG의 치환능과 DNArcomplexing 뮬질의 생화학 적 또는 생리활성과의 상호 관련성이 있옴이 알려져 있 다.^* 따라서 본 검색외 결과를 토대로 각종 생약으로부 터 유기용매층으로 이행되는 활성물질을 탐색한다면 DNA를 bioreceptor로 하는 생 리 활성물질의 발견을 기 대할 수 있을 것으로 생각되며, 현재 차전자와 산초의 n-hexane 가용부에 대한 활성물질의 분리가 진행 중에 있다.
결 론
총 117종 생약외 MeOH 추출물에 대하여 DNA 결 합능을 측정하여 2,000 Hg/mZ이하의 ICso처를 나타내 는 육계, 의이인. 황련. 소자. 차전자, 원지. 산초외 7중 외 생약을 1차적으로 선별하였다. 이들을 용매분배법을 이용하여 «-hexane. CHCI 3 및 60% 수성 MeOH 가 용부로 나누고. 각 분획 의 활성을 조사한 결과 차전자와 산초의 2종외 «-hexane 가용부가 각각 588 및 574
^l&/m/의 ICso처틀 나타내는 것으로 확인되어 이들을 활성성분의 분리를 위한 후보생약으로 선별하였다.
감사의 말씀
이 논문은 1997년도 원광대학교의 교비지원에 외해 서 연구되었음을 감사드럽니다.
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J. Pharm. Soc. Korea
148 김윤설 • 정세준 • 신화우 • 김윤철
Table II — — Activity of organic solvent-soluble fractions of the crude drugs in the DNA-methyl green assay ICso (M-g/m/) Value*
Samples
/i-hexane fr. C H C I 3 fr. 60% aq. MeOH fr.
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2.
2.
2.
2.
2, 2.
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