약학회지 제41권 제 5 호 565^570(1997) Yakhak Hoeji Vol. 41, No. 5
천연물로부터 염증성 포스포리파제 A2 저해제 검색
문태철 • 정광원 ■정규찬 • 손건호* ■김현표* ■
영 남 대 학 교 약 학 대 학. ' " 안 동 대 학 식 품 영 양 학 과. • 강 원 대 학 약 학 대 학,
(Received September 24. 1997)
강삼식** • 장현욱**
* • 서 울 대 학 교 천 연 물 과 학 연 구 소
Screening of Inflammatory Phospholipase A2
Inhibitors from Natural Products
Tae Chul Moon, Kwang Won Chung, Kyu Cham Chung, Kun Ho Son*
Hyun Pyo Kim*, Sam Sik Kang** and Hyeun Wook Chang휴 C o lleg e o f P h a r m a c y , Y e u n g n a m U n iv e r s ity , K o rea ,
* D e p a rt. F o o d & N u tr itio n , A n d o n g N a t i o n a l U n iv e r s ity , K o re a ,
*C ollege o f P h a r m a c y , K a n g w a n N a t i o n a l U n iv e r s ity , K o rea ,
* * N a tu r a l P r o d u c ts R e s. I n s t i t u t e . S e o u l N a t i o n a l U n iv e r s ity , K o rea .
Abstract— High levels of extracellular phospholipase A2 (PLase A2) associated with inflammatory pro
cess in m an and animal models have been extensively reported elsewhere. Thus, a logical ap proach to the treatment of inflammatory diseases should involve the inhibitors of PLase A2. To de- velope new PLase A2 inhibitors from natural products, two hundred crude drugs were screened u s ing group 11 PLA2 inhibitory activity. Among them, methanol extract of 5 medicinal plants such as, Raphani Semen, Moutan cortex radicis, Arecae semen, Caryophylli Cortex and Betulae Cortex inhibited more than 90% of PLase Az avtivity at a concentration 2.5 Then. 10 methanol extracts sample were tmasferred into organic solvents. PLase A2 inhibitory effects were found mainly in CHCI3 and EtoAc fractions.
Keywords O Inflammation. Group II Phospholipase A2 inhibitor. Natural products.
Phospholipase A2(PLase A2)는 세균에서부터 고 등동물에 이르기까지 광범위하게, 세포막. 과립. 분비 액 중에 존재하는 효소로서, glyceropholipid외 2번 위 처에 ester결합을 가수분해하여 유러지방산과 lysop- hospholipid룰 생성한다. 과거에는 인지질의 신생과 대사에 관련해서 연구되어 왔으나. 최근에는 여러 생러 현상과 병리현상에 적접적으로 관여함이 알려졌다. 다 양한 생러현상과 질병에 관여하는 eicosanoid외 전구 체인 arachidonic acid는 막 인지질외 2번 위치에 결함 하고 있으므로 PLase A2에 의 한 arachidonic acid 유 러단계 반응은 생러활성 mediator 생성과정의 율속 효
" 본 논문에 관한 문외는 이 저자에 게로 ( 전화) 053-810-2811 ( 팩스) 053-811-3871
소임이 예상되고 있다. 또한 최근 국히 미량으로 혈소판 을 활성화시키며. 다양한 생리활성 및 질병(기관지 천 식 , 염증. allergy, endotoxin schock 등)에도 직. 간 접적으로 관여함이 알려진 PA F(Platelet Activating Factor) 의 생합성 과정에도 PLase A2가 관여함이 밝 혀져소"크* arachidonic acid cascade와 P A F cycle외 관련된 가설이 제기되었다/ ' PLase A2의 생화학적 연 구는 다량의 정제표품을 쉽게 얻을 수 있는 췌장이나 사 득외 효소를 이용한 해석이 주된 것이다. 최근에는 실험 동물을 이용한 염증 model 즉 gram 옴성균에 의한 패 혈증^\ casein 유도 복막염^\ 지연성 과던증. allergic uveitis^^ 등과 사람의 질환 즉 , 류마치스 관절염 환자의 관절액"*. 결핵 환자외 홍막액"\ 건선 피부염 환자외 상 피조직®^과 gram 옴성 균에 의 한 septic schock 환자의
565
문 태 철 ■정 광 원 • 정규찬■손건호■김현표■강삼식• 장현욱
혈장®* 등에서 높은 세포외성 PLase A2의 활성과 ara- chidonic acid 대사산물의 측적이 보고되어 염증반응 에 있어서 PLase A j가 깊이 관여함이 밝혀졌다.
최근 endotoxin shock rat의 조직에서 group II형 PLase A2의 m R N A level이 증가되며****, 토끼외 chondriocyte. R at 신장의 mesangial cell을 TN F나 IL-1 등 염증성 cytokine존재하에 배양했을때 배양액 중에 세포외성 PLase A2가 방출됨이 보고되어**\ 염증 반응에 있어서 PLase Az외 역할은 더욱 중요시 되고 있다. 따라서 세계의 많은 연구자들이 PLase A2의 저 해물질을 찾아서 새로운 항염중제 개발에 힘을 기울이 고 었다. PLase A2 저해제의 개발에는 단백질, 천연물.
유기합성, 미생물. 해양생물 등에서 저해제외 개발이 많 이 진행되고 있다.*오"*무* 그러나 지금까지 PLase Az 저 해제외 검색에 사용된 PLase A2는 예외없이 췌장이나 사득의 group I형 PLase A2를 효소원하여 행해졌기 때문에, 효소원으로서 적절하지 않다는 문제점이 제기 되었다.
한편, 비만세포(m ast cell)에서 탈과립반응에도 PLase A2의 관여가 시사되어 즉시형 allergy 반응에 있어서 PLase A2의 역활에 대해 최근 관심이 모아지고 있 다 , 비 만 세 포 는 세포막 표면상에 고친화성 Ig E 수 용체를 가져서, 항원자극에 응헤서 염증성 mediator 인 histam ine, serotonin 등외 과립내 저장된 내용물 을 방출하는 동시에 prostagrandin D2(P G D2) , leu- cotriene C4 (LTC4) , PA F 등의 지질성 mediator를 생산하여 방출한다. 지질성 mediator 생성은 세포막 인지질에서 arachidonic acid 유러에서 시작되며, 자 극과 coupling하여 PLase A2가 활성화되는 현상으로 해석되고 있다. IgE를 개재한 비만세포의 활성화에는 생체막의 미량성분인 lysophosphatidylserinedyso P S )이 필수적임은 이미 알려져 있기 때문에*®* PS speific 한 PLase A2외 관여가 예상되고 있다. 최근 즉 시 형 allergy반응에 관여하는 PLase A2 저해제를 이용 한 allergy 치료제 개발이 진행되고 있어 금후 그 결과 가 기대되고 있다.
이상에서 기술한 것과 같이 PLase A2는 각종 염증성 질환에 직.간접으로 깊이 관여하고 있기 때문에 본 연구 진은 지금까지 천연물에서 성분외 분리 및 구조걸정에 관한 다년간외 경험을 바탕으로 PLase A2의 저해제를 찾아서 새로운 차원의 항염증제를 개발하는데 필요한 기초적 인 자료를 제공하려고 한다.
실험방법
실험재료 및 시약
실험재료 - 본 연구에 사용한 생약은 한약 도매시장 에서 구입하여 실험재료로 사용하였다.
시약 - T ris(h y d ro x y m e th y l)a m in o m e th a n e , C aC l2 등은 Sigma 사로부터, 1,4-bis [2-(phenyloxa- zolyl) ]-benzene (P O P O P ), 2,5-diphenyloxazole (D PO)는 Dojin사로부터 구입하여 사용하였으며, 이 외 의 모든 시 약은 특급품을 사용하였다.
시료의 조제
건조한 시료 100 g을 m e th a n d 로 3시간 3회 열추출 하고, 이 추출액을 합한후 농측 건조하여 이를 me- thanol 추출물로 사용하였다. 각 methanol 추출물을 물로 현탁시 킨후 «-hexane, C H C I3, ethylacetate 및 n-butanol로 단계적으로 분획하고 마지막 분획을 물분 확으로 하여 저해활성 검색에 사용하였다.
기질의 조제
l-acyl-2-[l-*"*C]linoleoyl-sn-glycero-3-phosphati- dylethanolam ine 는 l-acyl-2-[l-*\D]linoleoyl-s«- glycercr3-phosphatidylcholine로부터 Plase D 에 외 한 base exchange방법**에 의해 제조하였으며, linoleic acid 및 l-acyl-2- ( ] arachidonyl phos- phatidylethanolamine는 Amersham사에서 구업하여 사용하였다.
Phospholipase 활성의 측정
PLase A2 활성 측정은 Ethanol/Toluene(l/1, V/V) 중에 녹아있는 l-acyl-2-[l-*\]]linoleoyl-^5/i-glycero- 3-phosphoethanolamine (1,000 cpm/nmol) 을 시험관 에 분취한 후 , 질소가스로 용매를 휘발시키고 lipid film을 만든 뒤, 일정량의 증류수를 가하여 ultrasonic cleaner(Branson 2200, U SA)로 초음파 처리하여 기 질로 사용하였다. PLase A2활성은 100 m M Tris-HCl (pH 9.0), 6 m M CaCU, 기질 20 nmol 및 효소(lOng) 및 천연물 추출액 25 를 함유한 반응액올 STC로, 지정된 시간 동안 반응한 후 , 생성된 (*"C)유리지방산을 Dole등외 방법^"*에 따라 추출하여 liquid scintillation counter Minaxi Tri-Carb, Packard, USA) 로 즉정하 여 PLase A2 활성으로 환산하였다. 이때, PLase A j 활
Pharm. Soc. Korea
Pulsatille Radix Ampelopsis Radix Imperatae Radix Cynanchi Radix Aconiti Koreani Rhizoma Dictamni Radicis Cortex Thujae Semen
Tribuli Fructus
Atractylodes Rhizoma Alba Dolichoris Semen
Lilii Bulbus Amydae Carapax Strychni Ignatii Semen Hoelen
Hoelen Cum Radix Zedoary
Aconiti Tuber Spirodelae Herba Eriobotryae Folium Tokoro Rhizoma Arecae Semen Belamcandae Rhizoma Adenophorae Radix Torilidis Fructus
Sophorae Subprostratae Radix Curni Fructus
Zizyphi Spimosi Semen Notoginseng Radix Loranthi Ramulus Phytolaccae Radix Vagina Ovorum Mantidis Rehmanniae Radix Dendrobii Herba Acori Graminei Rhizoma Curculiginis Rhizoma Inulae Flos
Asuasari Radix Tritici Semen Caesalpiniae Lignum Perillae Herba Perillae Semen Picrasmae Fructus Foeniculi Fructus Cynomorii Herba
Rehmanniae Radix Preparata Cimicifugae Rhizoma Magnoiiae Flos
Alpiniae Officinarum Rhizoma Artemisiae Asiaticae Herba Hoittiyniae Herba
Ligudtri Fructus Forsythiae Fructus Nelumbinis Semen Polygalae Japonicae Herba Ganoderma
Acanthopanacis Cortex Schizandrae Fructus Galla Rhois
Evodiae Fructus Treminaliae Fructus
Puerariae Radix Puerariae Flos Chrysamthemi Flos Euphorbiae Kansui Radix Euryales Semen
Glycyrrhizae Radix Angelicae Koreanae Radix Curcumae Longae Radix Zingiberis Rhizoma Visci Herba Cassiae Semen
Galli Stomachichum Corium Meliae Cortex
Angelicae Tenuissimae Radix Caraganae Radix
Drynariae Rhizoma Melonis Calyx
Crassirhizomae Rhizoma Trichosanthis Semen Sophorae Fructus Lycii Fructus Dianthi Herba Limbricus
Testudinis Plastrum Citri Unshiu Semen Rosae Laeuigatae Fructus Lonicerae Flos
Platycodi Radix Raphani Semen Aloe
Echinopsis Radix Saviae Radix
Angelicae Gigantis Radix Arecae Pericarpium Hydnocarpi Semen Rhei Rhizoma Benincasae Semen Malvae Semen Eucommiae Cortex Aristolochiae Fructus Ephedrae Radix Viticis Fructus Liriopsis Tuber
Hordei Fructus Germinatus Gossypii Semen
Oystreae Testa Moutan Cortex Radicis Equiseti Herba Akebiae Caulis Myrrha Buddleiae Flos Pinelliae Tuber Bombycis Corpus Sinapis Semen Alba Chelidonii Herba Santali Album Lignum Ammomi Rotuni Fructus
Table I— Continued
Korean PLase A2
Name Pharmaceutical Name Inhibition % Table I—— Inhibitory activity of methanol extract of
_________ crude drugs against group II phospholipase A2
Korean . PLase k i
Name Pharmaceutical Name Inhibition %
Vol. 4L No. 5, 1997
천연물로부터 염증성 포스포리파제 A2 저해제 검색
8 3 9 3 8 7 6 3 0 7 5 8 0 6 8 0 7 0 3 6 2 5 3 7 3 0 8 0 6 0 7 0 0 4 4 9 8 5 1 0 7 9 0 5 7 3 1 8 0 7 9 2 4 7 7 6 4 5 1 3 6 5 3 3 6 8 2
5 2 8 7 8 2 9 5 2 7 4
2 4 2 7 3
0
^ s 6 1 1 8 7 4 6 5 6 1 8 6 7 7 3 3 5
_ K - 4 5 7 2 7 5
황엽자자근유인생초지포
,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
두렴모머부선자질출편합갑두령신출자평파해랑간삼상두수조철기육표건곡창모복신맥목업자태회양지마이강엽성정교자신지가머배수백백백백백백백백백백백별보복복봉부부비버번사사사산산산삼상상상색석석선선세소소소소소소쇄숙승신양애어여연연영영오오오오 응근자퍼인려두화실향황초설육초피자자유
1 4 0 2 4 8 8 0 2 9 3 1 9 8 4 7 2 3 6 9 0 7 0 4 1 4 2 0 0 1 0 1 3 0 9 5 8 7 8 1 9 0 5 4 5 1 5 0 0 0 5 7 2 0 6 1 0 4 2 2 2 2 0 6 8 5 7 6 5 2 5 5 3 1 4 5 4
7 2 4 5 6 1 8
4 9 4 4 3 8 3 8 2 8 5 1 7 6 1 9
5 6 3 2 5
8
^
이그
^
근살자금피초보인자자화자피자자자령근자동자피화잠자채향구자같화국수인초활황강우명내련본담쇄초중루곽기맥인판핵앵은경복회로삼귀복H}o황!류rt층두1창형문아설려단적통약몽하강개댄두 가각갈
7^
0감감감강강건겨결계고고골골과관괄괴구구구구글금금길내노누단당대대대동동두마마만맥맥면목목목몰밀반백백백백백
Taraxaci Herba Piperis Longi Fructus Prunellae Spica
Polygoni Multiflori Radix Glauberite
Rosae Rugosae Root Kalopanacis Cortex Notarchi Eachii Ovum Cyperi Rhizoma Elsholtziae Herba Scrophulariae Radix Geranii Herba Corydalis Tuber Draconis Sorguis Schizonepetae Herba Sesami Semen Picrorrhizae Rhizoma Carthami Flos Carthami Semen Betulae Cortex Scutellariae Radix Astragali Radix Polygonati Rhizoma Pharbitidis Semen
성을 측정하여 90% 이상외 저해를 나타낼때 +4. 89-- 80% 저해일때 +3. 79-70% 저해일때 +2. 69-60%
저해를 나타낼때 +로 . 그이하일때는 -로 표시하였다,
결과 및고찰
한방과 민간에서 사용되고 있는 생약을 무작위로 200종을 선택하여, 유기용매법으로 추출한 후 염증반 응에 직,간접적으로 관여하고 었옴이 알려진 염중성 PLase A2를 효소원으로 사용하여 저해활성을 검색한 결과를 Table I에 요약하였다.
Table I외 결과에 R at platelet로 부터 정제한 group II PLase A2를 효소원으로 저해활성을 검색한 결과는 다옴과 같다.
1) 90% 이상의 저헤활성을 나타내는 생약은 다음과 같다.
노회. 목단피, 번랑자. 정향피. 화퍼 5종류외 생약에 서 강한 저해활성이 있음을 알수 있었다.
2) 89*^80% 의 저해활성을 나타내는 생약은 다옴과 같다.
감수. 감인. 금은화. 대황. 두충, 마황근, 백단향. 백 질려, 복신. 비파엽, 소목, 승마, 연자육. 작약, 천련자.
/. Pharm. Soc. Korea Linderae Radix
Sepiae Os Orostachys Herba Melandrii Herba Fossilia Ossis Mastodi Solanii Herba Longanae Arilus Achyranthis Radix Gleniae Radix Polygalae Radix Clematidis Radix Ulmi Pumilae Cortex Sulfur
Myristicae Semen
Cinnamomi Cortex Spissus Cistanchis Herba
Coicis Semen Leonuri Herba Epimedii Herba
Aitemisiae Capillaris Herba Cnidii Rhizoma
Paeoniae Radix Polyporus
Broussonetiae Fructus Halloysitum Rubrum Buthus
Anthrisci Radix Sorbus Cortex Caryophilli Flos Caryophylli Cortex Gleditsiae Spina
Uncariae Ramulus et Uncus Gleditsiae Fructus
Stalactium
Bambusae Caulis in Taeniam Bambusae Folium
Auranthii Fructus Anemarrhenae Rhizoma Kochiae Fructus Plantaginis Semen Gastrodiae Rhizoma Meliae Fructus Manitis Squama Aconitii Tuber Trichosanthes Root Coptidis Rhizoma Aristolochiae Radix
Aurantii Im m atri Pericarpium Amomi Tsao-ko Fructus Alpiniae Katsumadaii Semen Biotae Orientalis Folium Lycopi Herba
Alismatis Rhizoma Smilacis Rhizoma Cuscutae Semen Psoraleae Semen Morindae Radix Patriniae Radix
Polygoni Avicularis Herba
문 태 철 • 정 광 원 • 정규찬• 손건호• 김현표• 강삼식• 장현욱
Table I — Continued Korean
Name Pharmaceutical Name PLase k i Inhibition %
Table 1 — Continued Korean
Name Pharmaceutical Name PLase A2
Inhibition %
7 2 0 6 5 0 4 2 0 3 3 9 0 6 0 0 8 1 5 1 8 0 0 6 1 3 5 1 6 7
C 6 3
6 8 6 5 1 3 4 2 9 6 1 1
영초오석근피자색인련인 공발고수수당동분부유삼초호같개마황화화피금기정측포필하하한해해해향향현현현혈형호호홍홍화황황황흑
자자자갑분련향구엽령자지 행골OIT육풍선피구용인초곽호궁자지피피자등석자자자갑분련향구엽령5!지
.
^
.
약적송불골규안슬방지령근황두계종이모양진천약령설석층호공향향각구협유여엽각모부전마련산오화황목피과두백란사복사고국장측오오와왕용용용우원원위유유육육육의익옴인일작저저적전전정정정조조조중죽죽지지지차천천천천천천청청초초측택텍토토파파페편
천연물로부터 염증성 포스포러파제 A2 저해제 검색 569
Table II — Inhibitory activity of organic solvent soluble fractions of crude drugsa on group II phospholipase A2
생약
분획 % Inhibition Rate^
Methanol Hexane C H C I3 EtOAc Butanol H2O
Concentration 25 |Xg/m/
"Above 90% ： +4. S9-80% ； +3. 79--70% ： +2. 69-60% ： +. below 60%
"All samples were tested duplicate
초두구. 현삼 17중의 생약이었다.
Table II 결과에는 200종외 생 약 중 활성 이 강한 것 과 약한 것 10중을 선별하여 유기용매법으로 단계적으 로 분획한 후 저해활성을 검색한 것이다.
3) PLA2 저해제 캐발가능성이 높은 생약으로서는 토 복령의 C H C13. E tO A c층 . 금은화의 hexane. C H C I3. EtOAc층 . CHCla. EtOAc층 . 작약의 CH CI3. E- tOAc. B u ta n 이층. 노회외 methanol, hexane.
CH C I3. B u ta n 이층. 포공영외 C H C13. EtOAc층 등이 었다. 황금의 EtOAc. butanol. 애엽의 EtOAc, b u t a n o ls 등이었다.
저자등은 이러한 방법으로 금은화의 EtoAc분획으로 부터 새로운 구조틀 갖는 PLase A2 저해제인 ochna- flavone를 분리하여 보고하였다.오인
금후 계속적으로 PLase A2저해활성이 강한 생약을 선택하여 유기용매분획법으로 분리한 검체를 사용하여 저해제를 검색하면 지금까지 보고된 저해제와는 다른 구조룰 가진 항염증 및 항알러지제의 개발에 필요한 기 초적인 자료가 제공될수 있으리라 기대된다.
감사의 말씀
본 연구는 선경인더스트리 및 보건복지부 신약개발과 제에 의해 수행되었기에 이에 감사를 드럽니다.
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2 3 3 3 3 4 4 4 + + + + + + + +
+
+ 4 +4 + 4 + 4 + 4 + 1 + 4 + 4 + 4 + 3
+4 + 4 + 4 + 3 + 4 + 3 + 1 + 1 + 3 + 3
+ 3 + 4 + 3 + 4 + 3 + 1 + 1
- 2 3 3 3
. - 2 +
+
+
I +
I +
+
+
평령화약회영교금백엽복은공 부토금작노포연황측애
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