갑상선 종양에서 RASSF1A 메틸화와 BRAF 유전자 변이에 관한 연구

ARTICLE

Received October 23, 2018 / Revised November 12, 2018 / Accepted November 12, 2018

Correspondence: Soon Young Kwon, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University Ansan Hospital, 123 Jeokgeum-ro, Danwon-gu, Ansan 15355, Korea

Tel: 82-31-412-5170, Fax: 82-31-412-5174, E-mail: [email protected]

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갑상선 종양에서 RASSF1A 메틸화와 BRAF 유전자 변이에 관한 연구

고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실

오경호, 정광윤, 백승국, 우정수, 조재구, 권순영

Relation between RASSF1A Methylation and BRAF Mutation in Thyroid Tumor

Kyoung Ho Oh, Kwang Yoon Jung, Seung Kuk Baek, Jeong Soo Woo, Jae Gu Cho and Soon Young Kwon Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea

Background and Objectives: Hypermethylation of the tumor suppressor gene RASSF1A and activating mutation of BRAF gene have been recently reported in thyroid cancers. To investigate the role of these two epigenetic and genetic alterations in thyroid tumor progression, methylation of RASSF1A and BRAF mutation were examined in thyroid tumors. Materials and Methods: During 2007 to 2017, 69 papillary carcinomas, 18 nodular hyperplasia, 3 follicular carcinomas, and 13 follicular adenomas were selected. The methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) technique was used in detecting RASSF1A methylation and polymerase chain reaction (PCR)-single-stranded conformation polymorphism and sequencing were used for BRAF gene mutation study.

Results: The hypermethylation of the RASSF1A gene was found in 84.6%, 100% and 57.9% of follicular adenomas, follicular carcinomas, and papillary carcinomas, respectively. Nodular hyperplasia showed a hypermethylation in 33.3%. The BRAF mutation at V600E was found in 60.7% of papillary carcinoma and 27.0% of nodular hyperplasia, but none of follicular neoplasms. The BRAF mutation was correlated with the lymph node metastasis and MACIS clinical stage. There is an inverse correlation between RASSF1A methylation and BRAF mutation in thyroid lesions. Conclusion: Epigenetic inactivation of RASSF1A through aberrant methylation is considered to be an early step in thyroid tumorigenesis, and the BRAF mutation plays an important role in the carcino- genesis of papillary carcinoma, providing a genetic marker.

Key Words: RASSF1A, Methylation, BRAF, Mutation, Thyroid

서 론

갑상선암은 국내에서 2015년 기준으로 전체 암 중에 서 남성에서 5번째, 여성에서는 가장 많이 발생하는 암 이다.¹⁾ 갑상선암종은 조직학적으로 여포성 상피 세포 에서 유래한 유두상 암종, 여포상 암종, 역형성 암종과 부여포세포에서 기원한 수질성 암종으로 크게 분류한

다. 갑상선암의 발생은 RAS 유전자 변이, BRAF 유전 자의 변이, RET/PTC 유전자 재배열과 같은 genetic alteration과 종양 억제 유전자인 RASSF1A의 promoter 부분에 위치하는 CpG island에서 메틸화를 보이는 것 과 같은 epigenetic alteration이 관여한다고 알려져 있 다.^2-5) 유전자 변이는 갑상선암의 종류에 따라 차이가 있는데, 이 중 BRAF (B-type Raf kinase) 유전자는 RAS 와 결합을 조절하며 세포증식과 분화에 중요한 역할을

하는 serine/threonine kinase로서 유두상 암종에서 높은 발생률을 보인다. 특히 V600E 타입에서 변이가 가장 많이 일어나며, RAS 변이와 높은 연관성이 있다고 알 려져 있다.^5-7)

최근 갑상선암에서 RASSF1A 유전자의 동질 접합체 소실 위치인 3p21.3에서의 이형 접합성 소실(loss of heterozygosity, LOH)과 promoter 과메틸화 현상이 관 련이 있음이 보고되었다.⁸⁾ RASSF1A 유전자는 폐암, 유 방암, 췌장암, 신장암, 간암 및 전립선암 등 여러 신체 에 발생하는 암의 발생과 관련이 있는 종양 억제 유전 자로 RAS 관련 domain과 신호전달 및 성장촉진과 관 련된 protein kinase C1 domain을 가지고 있다.^9-11)

본 연구에서는 갑상선 종양에서 MSP (methylation- specific polymerase chain reaction) 방법으로 RASSF1A 유전자의 메틸화를 조사하고, BRAF 유전자의 변이를 polymerase chain reaction (PCR)-single-stranded confor- mation polymorphism (SSCP) 방법으로 조사한 다음 변 이가 있는 경우 sequencing하여 돌연변이 여부를 확인 하였다.

대상 및 방법

대상

2007년부터 2017년까지 고려대학교 의료원 이비인후- 두경부외과에서 갑상선결절로 수술받은 환자 중 파라 핀 고정으로 갑상선 조직의 사용이 가능한 103례를 대 상으로 하였다. 수술 후 보고된 조직학적 진단을 종양 분류의 기준으로 하였고, 각각 유두상 암종 69례, 결절 성 증식증 18례, 여포성 선종 13례, 여포성 암종 3례를 선택하였다. 성별은 남자 11례, 여자 94례였고, 진단 당 시 연령은 24세부터 82세로 평균연령은 50.3세였다.

방법

1) 파라핀 고정 조직에서 DNA추출

파라핀 블록을 각각 10 μm 두께로 4조각씩 박절한 후 eppendorf tube에 넣은 다음 파라핀을 제거하기 위 해 xylene 1 ml을 가한 후 56^oC에서 5분 동안 방치하였 다가 13,000 rpm으로 10분간 24^oC에서 원심 분리하였 다. 이런 과정을 3회 반복하였다. 무수메탄올 1 ml을 각각 가하고 5분간 방치한 후 10,000 rpm에서 8분간 원 심 분리하였다. 이 과정을 3회 반복한 후 알코올을 제 거하기 위해 상온에서 완전히 시료를 건조시켰다.

High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche

Molecular Systems, Inc., California, USA)에서, tissue lysis buffer 200 μl와 proteinase K 40 μl를 가한 후 56^oC에서 24시간 방치하였다. Binding buffer 200 μl를 가한 후 혼합하여 72^oC에서 10분간 방치하고 isopro- panol 100 μl와 혼합하였다. 8000 rpm에서 원심분리를 1분간 가한 후 collection tube를 교체하였다. Inhibitor removal buffer 500 μl를 넣고 8000 rpm에서 1분간 원 심분리 시키고 washing buffer 500 μl를 가한 후 원심 분리한 후 collection tube를 버리고 1.5 ml reaction tube 에 filter tube를 끼웠다. 마지막으로 72^oC elution buffer 200 μl를 filter tube를 가한 후 1분간 원심분리하고 microfuge tube에 DNA를 얻어 −20^oC에서 보관하여 template DNA로 사용하였다.

2) RASSF1A 유전자에 대한 MSP 방법 (1) DNA의 bisulfite 처리

분리한 DNA 48 μl와 5M NaOH 2 μl를 eppendorf tube에 넣어 mixing 혼합한 다음 37^oC water bath에서 10분간 방치하였다가 sodium bisulfite (pH 5), hydro- quinone 550 μl를 넣어 다시 50^oC water bath에서 16시 간 동안 방치하였다. DNA clean up resin (Wizard^Ⓡ DNA clean up system, Promega Corp., Madison, USA) 1 ml를 넣고 혼합한 후 vacuum을 이용하여 용액을 뺀 다음 튜브에 isopropanol 2 ml를 넣고 내렸다. Mini- column을 eppendorf tube에 꽂고 10,000 rpm에서 2분간 원심 분리한 후, 꽂힌 eppendorf tube를 버리고 새로운 eppendorf tube에 minicolumn을 꽂고, 60-70^oC 사이의 DW 50 μl를 넣고 10,000 rpm에서 20초간 원심분리를 시킨 후 minicolumn을 버린다. 5M NaOH 5 μl를 상온 에서 10분 동안 방치한 후 3M NaAc 5 μl, 100% EtOH 150 μl를 넣어 혼합한 후 −20^oC에서 3시간 동안 방치 하였다. 다시 4^oC 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 시 킨 후 DNA pellet에 70% EtOH 1 ml를 넣고 4^oC 10,000 rpm으로 8분간 원심 분리하였다. EtOH을 버리고 남은 DNA pellet를 mini-vacuum에서 15분간 건조시켰다.

DW 50 μl를 넣고 pipetting한 다음 −20^oC에서 보관하 였다.

(2) Methylation-specific PCR (MSP)

RASSF1A에 대한 MSP를 실시하였다. Bisulfite 처리 한 DNA 5 μl (200-400 ng), primer 각각 3 μl, 2 μl dNTP, 2.5 μl buffer, 0.2 μl Taq polymerase를 가하여 20 μl 되게 한 후 PCR thermal cycler (Perkin Elmer 2400)를 사용하여 94^oC에서 60초, 59^oC에서 60초, 72^oC

Table 1. Methylation specific PCR analysis of RASSF1A methylation in thyroid lesions

Histologic diagnosis Methylated/unmethylated bands

Methylated/total (%)

＋/＋ ＋/− −/＋ −/−

Papillary carcinoma 24 16 29 0 40/69 (57.9)

Follicular carcinoma 1 2 0 0 3/3 (100)

Follicular adenoma 9 2 2 0 11/13 (84.6)

Nodular hyperplasia 2 4 12 0 6/18 (33.3)

Fig. 1. The methylation status of the RASSF1A promoter region was analyzed by MSP; Methylation (m) and unme- thylation-specific (u) primers were used. The methylation- specific product (93 bp) and unmethylation-specific product (105 bp) were resolved on 1.8% TBE gel. FA: follicular adenoma, FC: follicular carcinoma, NH: nodular hyperplasia, PC: papillary carcinoma

에서 60초간의 반응을 40회 반복하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel 전기영동으로 확인하였다.

사용한 RASSF1A에 대한 primer는 Forward 5' GCG TTG AAG TCG GGG TTC 3'과 Reverse 5' CCC GTA CTT CGC TAA CTT TAA ACG 3'였고, β actin에 대 한 primer는 Forward 5' TGG TGA TGG AGG AGG TTT AGT AAG T 3'과 Reverse 5' AAC CAA TAA AAC CTA CTC CTC CCT TAA 3'였다.

BRAF 유전자 변이 검사

1) PCR-SSCP

BRAF exon 15에 대해 PCR을 실시하였다. 증폭시킬 각 DNA 2.5 μl (200-400 ng), primer 각각 1 μl, dNTP 2 μl, buffer 2.5 μl, Taq polymerase 0.2 μl를 가하여 20 μl 되게 한 후 PCR thermal cycler (Perkin Elmer, Massachusetts, USA)를 사용하여 94^oC에서 30초, 58^oC 에서 30초, 72^oC에서 30초간의 반응을 40회 반복하였 다. 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel 전기영동으로 확인하였다. 사용한 primer는 Forward 5'TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3', Reverse 5'GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG-3'였다. PCR 산물을 10 μl 취해 끓이면서 변성시킨 후, 얼음으로 급히 냉각 시킨 다음, 5% glycerol을 포함한 12% polyacrylamide gel 에서 250 V로 5시간 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 10% ETOH로 10분간 고정시켰다. 아래 기술한 은 염색법으로 DNA band pattern을 확인하였다. 먼저 gel을 1% nitric acid에서 3분 담근 다음 증류수를 가해 3분간 세척하고 다시 0.2% silver nitrate 용액(0.2% silver nitrate, 300 μl 37% formaldehyde, 200 ml DW)을 30분 간 반응시킨 후 재빨리 증류수로 세척하였다. 발색 용 액(6 g sodium carbonate, 120 μl formaldehyde, 200 ml DW, 100 μl 1% sod. thiosulfate)을 가한 후 band가 뚜 렷이 보일 때까지 반응시키고 10% glacial acetic acid로 고정하였다. 양성 대조로 정상인의 혈구 세포에서 분 리한 DNA를 이용하여 SSCP band 양상을 비교 검토하 였다.

2) BRAF 유전자 염기서열 검사

ABI PRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Kits (ThermoFisher, Massachusetts, USA)를 이용하였 다. PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Minnesota, USA)를 사용하여 PCR 반응을 보고 BRAF primer를 이용하여 sequence를 조사하였다. 반응이 끝 나면 ethanol을 이용하여 반응하지 않은 dNTP와 반응 물을 분리하고, 정제된 PCR product는 3차 증류수에 다시 녹여 ABI PRISM 3730XL Analyzer (ThermoFisher, Massachusetts, USA)로 분석하였다.

통계분석

SPSS for Windows Version 20을 이용하여 분석하였 으며, Chi-Square test와 t-test를 사용하였다.

결 과

RASSF1A 유전자의 메틸화

RASSF1A의 메틸화는 유두상 암종에서 69례 중 40례 (57.9%)에서 관찰되었고, 여포성 암종 3례는 모두 (100%) 메틸화를 보였으며, 여포성 선종은 13례 중 11 례(84.6%)에서 메틸화를 보였다. 반면 비종양성 결절성

Table 2. Correlation between RASSF1A methylation and BRAF mutation in thyroid lesions

Tumor RASSF1A BRAF mutation (＋) BRAF mutation (−) Total No.

Papillary carcinoma (n=69) RASSF1A (＋) 16 (40.0%) 24 (60%) 40

RASSF1A (−) 26 (89.7%) 3 (10.3%) 29

Follicular neoplasm (n=16) RASSF1A (＋) 0 (0%) 14 (100%) 14

RASSF1A (−) 0 (0%) 2 (100%) 2

Nodular hyperplasia (n=18) RASSF1A (＋) 1 (16.7%) 5 (83.3%) 6

RASSF1A (−) 4 (33.3%) 8 (66.7%) 12

Fig. 3. Sequencing of the BRAF gene. Heterozygous missense mutation (T1796A/V600E) in exon 15. (A) Papillary carcinoma tissue and (B) nucleotide sequence in the corresponding normal tissue.

Fig. 2. The example of BRAF (exon 15) mutation was analyzed by PCR-SSCP (single-stranded conformation poly- morphism) in papillary thyroid carcinoma. The arrow indicates the mutation band. M: mutation, N: normal

Fig. 4. The frequency of RASSF1A methylation and BRAF mutation. FA: follicular adenoma, FC: follicular carcinoma, NH:

nodular hyperplasia, PC: papillary carcinoma 증식에서는 18례 중 6례(33.3%)에서 메틸화를 보였다

(Table 1, Fig. 1).

BRAF 유전자 변이

BRAF 유전자의 변이 여부를 확인하기 위해 exon 15 에서 PCR-SSCP을 시행한 결과 유두상 암종은 69례 중 42례(60.8%)에서 유전자 변이가 관찰되었고, 결절성 증 식에서는 18례 중 5례(27.7%)에서 변이가 관찰되었다.

그러나 여포성 암종 3례와 여포성 선종 13례에서는 모 두 유전자 변이를 보이지 않았다(Fig. 2). 염기서열 검 사에서 BRAF 변이를 보였던 42례의 유두상 암종에서 모두 nucleotide 1796에서 T→A (V600E)로 염기 간의 변화를 보였다(Fig. 3).

RASSF1A 메틸화와 BRAF 유전자 변이의 관계 RASSF1A 메틸화와 BRAF 유전자 변이의 관계를 보 면 유두상 암종에서 메틸화를 보였던 40례 중 유전자 변이를 보이지 않은 예는 24례(60.0%)였던 반면 메틸화 를 보이지 않았던 29례 중 24례(89.7%)에서 유전자 변 이를 보였다. 여포성 암종과 여포성 선종은 각각 100%, 84.6%로 높은 메틸화를 보였으나 BRAF 유전자 변이는 관찰되지 않았다(Table 2, Fig. 4).

결론적으로 유두상 암종에서는 BRAF 유전자 변이 와 RASSF1A의 메틸화가 서로 상보적으로 관찰되는 반 면, 여포성 종양에서는 RASSF1A의 메틸화만 관여하고

Table 3. Correlation between BRAF mutation and clinico- pathologic features in papillary thyroid carcinomas

　 BRAF (＋) BRAF (−) p value

Age (years) 52.21 45.67 0.112

Sex (male:female) 39:3 23:4 0.303

Size (cm) 2.34 1.86 0.133

Invasion 24 (57%) 9 (33%) 0.053

Metastatic node 15 (36%) 3 (11%) 0.023

AMES 13:29 4:23 0.133

MACIS 5.59 4.68 0.004

AMES: Lahey Clinic Foundation, 1998, MACIS: Mayo Clinic, 1993

BRAF 유전자 변이는 관련이 없으며, 결정성 증식에는 BRAF 유전자와 RASSF1A의 메틸화가 일부 관여한다 고 할 수 있겠다.

임상 및 조직학적 특징과 RASSF1A의 메틸화 및 BRAF 유전자 변이의 관계

종양에서 피막 외 침습 유무, 종양의 크기, 경부 림프 절 전이 유무, 원격전이 유무, 병기 등과 BRAF 유전자 변이의 차이를 비교한 결과(Table 3), 환자의 연령 (p=0.112), 성별(p=0.303), 종양의 크기(p=0.133), 침습 여부(p=0.053)와는 유의한 차이가 없었으나, 림프절 전이(p=0.023)와는 유의한 차이가 있었으며 임상 병기 중 AMES (Lahey Clinic Foundation, 1998)와 MACIS (Mayo Clinic, 1993)에서 AMES (p=0.133)와는 유의한 차이가 없었으나, MACIS (p=0.004)에서는 두 군 간에 서 통계적으로 유의하게 상관관계가 있었다.

고 찰

갑상선암은 DNA sequence의 변화 없이 유전자의 발 현과 chromatin의 변화를 초래하는 epigenetic alteration 과 DNA 변이나 재배열을 보이는 genetic alteration 등 에 의해 발생한다.¹²⁾ 종양 억제 유전자인 RASSF1A의 promoter 메틸화는 대표적 epigenetic alteration 기전으 로 갑상선암, 폐암, 유방암, 비인강암, 췌장암, 난소암 등 암 발생 초기에 나타나는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 이 렇게 DNA 메틸화의 변화는 여러 암종에서 볼 수 있는 가장 흔한 분자적 변화의 하나로서 CpG dinucleotide 내의 cytosine에 메틸기가 공유결합을 하는 것으로 인 간 게놈에 다양한 영향을 주며 특히 종양 억제유전자 내에 존재하는 CpG site는 암을 야기하는 체세포 돌연 변이의 중요한 장소가 된다.¹⁴⁾ 인간의 유전자 반 이상

의 promoter에 CpG island라고 알려진 CpG가 풍부한 DNA 구조물이 종양 억제유전자의 promoter에서 과메 틸화가 일어나게 되면 그 유전자는 활동하지 않게 되 어 결손이나 돌연변이와 같은 기능 장애를 초래하게 된다. 대표적인 promoter 과메틸화 성장조절 유전자에 는 RASSF1A, p16, TSHR, RAR-beta, S100, DH1, GSTpi, TIMP-3, TGF-beta, CALCA, DAP-Kinase 등이 있다고 알려져 있다.^15-19)

본 연구에서는 이 중 RAS 관련 domain과 신호전달 및 성장촉진에 관련된 protein kinase C1 domain을 가 진 RASSF1A 유전자를 MSP를 통해 암종과 비종양 갑 상선 조직에서 메틸화를 측정하였다. 여포성 선암과 선종 모두에서 높은 메틸화를 보였고, 유두상 암종은 57.9%, 결절성 증식증에서는 33.3%에서 메틸화가 관찰 되어 RASSF1A의 비활성화 기전이 병소 유발의 주요 인자로 간주된다고 할 수 있겠다.

BRAF 유전자의 변이는 RET/PTC 재배열과 함께 갑 상선유두암종의 발생에 중요한 인자로 알려져 있다.⁵⁾ BRAF는 B-type Raf kinase로 RAS와 결합을 조절하며 세포증식과 분화에 중요한 역할을 하는 serine/threonine kinase이다.⁷⁾ BRAF 유전자의 변이에서 가장 흔한 형태 는 V600E 형태인데 특이하게 이 돌연변이는 K-RAS 변 이를 가지고 있다고 한다.²⁰⁾ 이는 BRAF 변이가 RAS 변이와 서로 밀접한 관련이 있음을 보여준다. BRAF 유 전자는 최근에 갑상선암을 포함한 여러 암에서 변이된 다는 사실이 보고되었는데, 흑색종에서 가장 많이 발 견되고, 대장암, 난소암, 폐암에서도 유전자 결함을 보

였다.^20-23) 본 연구결과 BRAF 유전자는 유두상 암종에

서 변이율이 60.8%로 갑상선 종양 중 가장 높았으며, 변이의 유무에 따라 임상적인 차이를 보였다. BRAF 변 이가 관찰되는 유두상 암종 군은 변이를 보이지 않는 군보다 종양의 크기(2.34 cm/1.86 cm)와 연령(52.21세/

45.67세)이 높았으나, 통계학상에서 유의한 차이가 없 었다. 그러나 변이가 있는 유두상 암종에서는 통계학 적으로 유의하게 경부 림프절 전이가 흔하였고, MACIS 점수가 더 높았다. 결절성 과증식에서는 이전 연구와 유사한 RASSF1A 유전자의 메틸화 빈도를 보였 으나 BRAF 유전자 변이는 이전 연구와는 달리 관찰되 었다.²⁴⁾

본 연구에서는 RASSF1A 메틸화와 BRAF 변이는 유 두상 암종과 여포성 암종에서 서로 다른 결과를 보였 다. 즉 여포성 종양에서는 BRAF 유전자 변이가 관찰되 지 않고 RASSF1A 메틸화만이 높은 빈도로 관찰되는 반면 유두상 암종에서는 RASSF1A의 메틸화와 BRAF

유전자 변이는 서로 반대의 관계를 보였다. 이는 아마 도 두 암종의 발생기전이 서로 다르다는 사실을 암시 한다고 생각한다.

갑상선암은 여러 염색체상 위치(1p, 3p, 3q, 10q, 11p, 13q, 22q)에서 이형 접합성 소실(LOH)을 보인다. 특히 3번 염색체 단완에서의 LOH는 갑상선암과 같은 고형 암 발생 과정에서 공통적으로 나타난다고 알려져 있 다.⁷⁾ 최근 동질 접합체 결실 위치인 3p21.3에 RASSF1A 가 위치한다고 밝혀졌다.¹²⁾ 분자생물학적으로 RASSF1A 단백은 세포분열 시 방추사와 중심체에 위치하며 세포 분열 표적 단백이자 cyclin 분해 단백인 Cdc20의 기능 을 억제시키고, cyclin 단백의 안정성을 조절함으로써 정확한 세포분열 진행 과정과 시간을 조절한다.¹²⁾ 따라 서 RASSF1A 유전자가 발현되지 않으면 비정상적인 세 포분열을 유발하고, 세포분열 진행 시간을 촉진시켜 정상 세포가 암세포로 전환되도록 한다. 암 발생 초기 에 RASSF1A 유전자의 발현이 감소하게 되면 염색체의 이상을 초래하고 다른 항암 유전자의 돌연변이를 촉진 시켜 결국 악성 종양으로 발전시키게 된다. 궁극적으 로 암 유발의 중요한 원인이 되는 것은 암 억제 유전자 의 비활성화이다.¹²⁾

본 연구를 통해 promoter 과메틸화 현상으로 인한 종양 억제 유전자인 RASSF1A 유전자가 불활성화됨으 로써, 여포성 종양을 포함한 양성 갑상선질환과 BRAF 변이가 없는 유두상 암종의 발생에 중요한 역할을 한 다는 사실을 알 수 있었다. 갑상선암에서의 RASSF1A 는 critical level에 도달했을 때 메틸화가 축적되고, genetic/epigenetic alteration이 일어나면서 양성 종양에 서 계속 증식하는 세포의 집단이 형성된다고 한다.

결 론

RASSF1A 유전자의 메틸화와 BRAF 유전자의 변이 는 유두상 암종의 57.9%와 60.8%에서 관찰되는 반면, 여포성 암종과 선종에서는 메틸화만 100%와 84.6%에 서 관찰되었고, 결절성 증식증에서는 33.3%와 27.7%에 서 RASSF1A 메틸화와 BRAF 유전자 변이가 관찰되었 다. BRAF 유전자 변이는 V599A였다.

중심 단어: RASSF1A, 메틸화, BRAF, 변이, 갑상선.

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