전립선암에서 조직 내

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Clinical Significance of the Expression of Tubulin α and βII in Prostate Cancer

Tae Heung Kim, Tae Hyung Kim, Shin Young Lee, Young Sun Kim, Mi Kyung Kim¹, Soon Chul Myung

From the Departments of Urology and ¹Pathology, College of Medicine, Chung- Ang University, Seoul, Korea

Purpose: This study examined the significance of tubulin α and βⅡ expression in benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate cancer.

Materials and Methods: A total 103 cases diagnosed with either BPH or prostate cancer were divided into 4 groups: BPH (n=25), localized prostate cancer (n=41), locally advanced prostate cancer (n=18), metastatic prostate cancer (n=18). The tissues were taken through a transurethral resection of the prostate, suprapubic prostatectomy, prostatic needle biopsy or radical retropubic prostatectomy. The expression was measured by immunohisto- chemical staining. The degree of expression was graded on a 4-point scale.

The data was compared in terms of stage, the serum prostatic specific antigen (PSA) level and Gleason score. The statistical comparisons were made using one-way ANOVA test and a Fisher's exact test.

Results: The levels of tubulin α and βII expression were stronger in the patients with prostate cancer than those with BPH (p＜0.001). On the other hand, there was no difference between metastatic prostate cancer and localized prostate cancer (p＞0.05). The level of tubulin α expression was stronger in the patients with a Gleason score ≥8 than in those of Gleason score ≤7 (p＜0.05), but there was no such difference in tubulin βII expression. The level of tubulin α and βII expression was stronger in the patients with a serum PSA level ≥4ng/ml than in those with the serum PSA level ＜4ng/ml (p＜0.001).

Conclusions: The expression of tubulin α and βII may be associated with the development of prostate cancer. These might be used as useful markers for the diagnosis, prognosis and treatment response. (Korean J Urol 2008;

49:709-714)

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Key Words: Tubulin, Prostate, Neoplasms

대한비뇨기과학회지 제 49 권 제 8 호 2008

중앙대학교 의과대학 비뇨기과학교실,

1병리학교실

김태흥ㆍ김태형ㆍ이신영

김영선ㆍ김미경¹ㆍ명순철

접수일자^：2008년 3월 21일 채택일자：2008년 6월 25일

교신저자: 명순철

중앙대학교병원 비뇨기과 서울시 동작구 흑석동 224-1

󰂕 156-755

TEL: 02-6299-1808 FAX: 02-6294-1406 E-mail: uromyung@

yahoo.co.kr 본 연구는 보건복지부 보건의료기술진흥사 업의 지원에 의하여 이루어진 것임 (과제고 유번호: A062254).

서 론

전립선암은 서구에서 가장 높은 발생률을 보이고 암관련 사망의 세 번째 원인이다.¹ 우리나라에서도 전립선암은 1998년에는 남성암 중 발생빈도가 8위였으나 2002년에는 6 위로 발생빈도가 증가하였으며 다른 종양에 비해 빠르게 증가하고 있다.² 전립선암의 발생과 진행의 생체분자학적 기전을 명확하게 하고 조기 발견할 수 있는 표지자를 찾기 위한 노력이 현재까지 이렇다 할 성과를 내지 못하고 있는

실정이다. 따라서 전립선암의 발생과정 중 나타나는 생화 학적 혹은 세포학적 표현형에 대한 이해가 중요하며 이는 향후 전립선암의 조기 진단과 치료를 위한 새로운 방법을 제시할 것으로 생각한다.

미세관 (microtubule)은 필라멘트 단백 중합체로 유사분 열과 감수분열 중 염색체의 분리, 편모와 섬모의 운동, 세 포기관의 운반, 세포형태 유지 등 다양한 기능을 한다.^3-6 Tubulin은 미세관의 주요 구성 단백성분으로 정상 세포, 신 경계 세포, 평활근 세포 등 다양한 세포에서 관찰된다.

Tubulin에는 α와 β 아단위가 있으며 tubulin β에는 6개의

710 대한비뇨기과학회지^：제 49 권 제 8 호 2008

아형이 존재한다.⁶

Tubulin α는 전립선암 세포의 경우, 정상세포와는 다른 분자적 프로파일을 가지기 때문에 진단적 가치를 가질 것 으로 기대되며 새로운 분자생물학적 치료방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.⁷

항암화학요법제 중에서 미세관 기능을 억제하는 제제가 중요한 한 분류를 차지하고 있다. 전립선암치료에 단독제제 의 효과는 제한적이지만 항미세관 제제 복합요법은 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 제제는 대부분 tubulin β와 결합한다.^8-12 Tubulin β는 미세관의 결합, 안정성, 항 미세관 제제에 대한 민감도 등에 영향을 미치며,^13-16 여섯가 지 아형 중에서 tubulin βII가 전립선비대증에 비해 전립선 암에서 더 많이 발현이 된다는 보고가 있다.¹⁷

이에 전립선비대증과 전립선암 조직에서 면역조직화학 염색으로 tubulin α와 βII의 발현도를 관찰하여 전립선암 에서 tubulin α, βII 발현의 임상적 의의에 대하여 알아보 고자 하였다.

재료 및 방법

1. 조직의 선택

전립선비대증과 전립선암으로 진단받은 환자의 조직을 전립선비대증 25례, 국소성 전립선암 41례, 국소진행성 전 립선암 18례, 전이성 전립선암 18례로 네 군으로 구분하였 다. 전립선비대증 환자에서 경요도내시경하전립선절제술과 상치골전립선절제술을 통해서 얻은 조직을 사용하고, 국소 성 전립선암은 전립선생검과 근치적전립선절제술로 조직을 얻고, 국소진행성 전립선암과 타장기로 전이가 확인된 전립 선암 군에서는 전립선생검을 시행한 조직을 사용하였다.

2. 면역조직화학 염색

각 예의 파라핀 포매 조직에서 4-5μm 두께의 절편을 박 절하고 탈파라핀하고, 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 알코 올에서 차례대로 함수과정을 거쳐서 증류수에 5분간 수세 하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.5%

hydrogen peroxide에 10분간 처리 후 증류수로 수세하였다.

항원성 회복을 위하여 10mM citrate (pH 6.0) 완충액에 담가 5분간 2회 극초단파 처리 후 실온에서 냉각시키고 50mM Tris 완충용액 (TBS, pH 7.5)으로 수세하였다. 면역조직화학 염색의 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소혈청으 로 처리하고, 여분의 용액을 제거한 다음 일차항체인 DM- 1A (cat. No.: MU121-UC, mouse monoclonal, dilution 1:100, Applied Biogenex, San Ramon, USA)와 JDR3B8 (cat. No.:

MU176-UC, mouse monoclonal, dilution 1:50, Applied Bio-

genex, San Ramon, USA)을 각각 실온에서 하룻밤 반응시킨 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체 (Applied Zymed Co. Carlsbad, USA)에 20분간 작용 후, streptoavidin과 결합한 과산화 효소 복합체를 가하여 20분간 반응시킨 후 AEC chromogen (3-amino-9-ethylcarbazole) 용액 으로 발색하고 Mayer hematoxylin으로 대조 염색을 실시하 여 광학현미경으로 관찰하였다. 면역조직화학염색반응의 음성 대조군으로는 전립선조직에서 일차 항체를 처리하지 않고 음성대조 시약으로 대체하여 이용하였고 양성 대조군 으로는 소장조직과 폐암조직을 이용하였다.

3. 면역조직화학 염색의 평가

Tubulin에 대한 염색의 판정은 전체세포의 10% 이상에 서, 세포질에 적갈색의 염색상을 보일 때 양성으로 판정하 였고 양성률이 10-30%인 경우를 1＋ (국소성), 30-70%인 경 우를 2＋ (다발성), 70% 이상인 경우를 3＋ (미만성)로 판정 하였다 (Fig. 1).

4. 결과 분석

전립선비대증과 전립선암, 국소성 전립선암과 전이성 전 립선암, Gleason 점수 7점 이하와 8점 이상, 그리고 혈청 prostate-specific antigen (PSA) 4ng/ml 미만과 4ng/ml 이상인 군 사이에 tubulin α와 βII의 발현도를 각각 비교하였다.

통계는 SPSS (version 12.0)를 사용하여 one-way ANOVA test, Fisher's exact test를 이용하여 분석하였으며 p값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 의미가 있다고 판정하였다.

결 과

1. 대상군의 특성

전립선비대증 환자의 연령, 혈청 PSA는 68.5±8.4세, 1.5±

1.0ng/ml였다. 국소성 전립선암에서 연령, 혈청 PSA, Gleason 점수가 8점 이상인 경우는 65.6±8.8세, 13.2±14.9ng/ml, 2례 (4.9%)였다. 국소진행성 전랍선암에서 연령, 혈청 PSA, Gleason 점수가 8점 이상인 경우는 67.7±8.0세, 13.4±10.4ng/

ml, 6례 (33.3%)였다. 전이성 전립선암 환자에서 연령, 혈청 PSA, Gleason 점수가 8점 이상인 경우는 72.4±6.1세, 345.7±

710.6ng/ml, 12례 (66.7%)였다. 각 군 사이에 연령 차이는 없 었으나 혈청 PSA와 Gleason 점수는 암의 진행에 따라 통계 적으로 유의하게 높게 관찰되었다 (p＜0.05) (Table 1).

2. 전립선비대증과 전립선암에서 tubulin α, βII의 발 현도 비교

1) Tubulin α: 전립선비대증에서 미만성 (3＋) 발현은 전

Table 1. Characteristics for benign prostatic hyperplasia and prostate cancer

BPH (n=25) LoCaP (n=41) LACaP (n=18) MetCaP (n=18) p-value

Age (years) PSA (ng/ml) Gleason score ≤7

≥8

68.5±8.4 1.5±1.0

65.6±8.8 13.2±14.9 39 (95.1%) 2 (4.9%)

67.7±8.0 13.4±10.4 12 (66.7%) 6 (33.3%)

72.4±6.1 345.7±710.6

6 (33.3%) 12 (66.7%)

＜0.05*

0.0000017^†

BPH: benign prostatic hyperplasia, LoCaP: localized prostate cancer, LACaP: locally advanced prostate cancer, MetCaP: metastatic prostate cancer, PSA: prostate-specific antigen. *: one-way ANOVA test, ^†: Fisher's exact test

Fig. 1. Grading system in the expression of tubulin α and βII (immunohistochemical stain, x100). The degree of expression was graded on a 4-point scale: 0 (negative stain), 1＋ (focal stain), 2＋ (multifocal stain), 3＋ (diffuse stain). Negative stain for tubulin α in benign prostatic hyperplasia (BPH) tissue (A) and diffuse stain for tubulin α in metastatic prostate cancer (B). Negative stain for tubulin βII in BPH tissue (C) and diffuse stain for tubulin βII (D) in metastatic prostate cancer.

혀 관찰되지 않았으며 전립선암에서 전립선비대증에 비해 강한 발현도를 나타냈다 (p=0.0000034) (Table 2).

2) Tubulin βII: 전립선비대증에서 전혀 발현되지 않았 으나 전립선암에서는 더 많이 발현되어 전립선비대증에 비 해 강한 발현도를 나타냈다 (p=0.000001) (Table 2).

3. 국소성 전립선암과 전이성 전립선암에서 tubulin α, βII의 발현도 비교

1) Tubulin α: 전이성 전립선암에서 국소성 전립선암과 발현도에 차이가 나타나지 않았다 (p=0.115) (Table 3).

712 대한비뇨기과학회지^：제 49 권 제 8 호 2008

Table 5. Expression of tubulin α and βII in the group with serum PSA＜4 and PSA≥4

Grade

Tubulin α

No. (%) p-value

Tubulin βII

No. (%) p-value

0 1＋ 2＋ 3＋ 0 1＋ 2＋ 3＋

PSA＜4 (n=27) PSA≥4 (n=76)

14 (51.9) 16 (21.1)

10 (37.0) 16 (21.1)

3 (11.1) 21 (27.6)

0 (0)

23 (30.1) 0.000067* 25 (92.6) 31 (40.8)

1 (3.7) 17 (22.4)

1 (3.7) 15 (19.7)

0 (0)

13 (17.1) 0.000037*

PSA: prostate-specific antigen, *: Fisher's exact test

Table 4. Expression of tubulin α and βII in the group with Gleason scores≤7 and Gleason score≥8

Grade

Tubulin α

No. (%) p-value

Tubulin βII

No. (%) p-value

0 1＋ 2＋ 3＋ 0 1＋ 2＋ 3＋

GS≤7 (n=55) GS≥8 (n=21)

13 (23.6) 3 (14.2)

15 (27.3) 0 (0)

14 (25.5) 9 (42.9)

13 (23.6)

9 (42.9) 0.011* 26 (47.3) 5 (23.8)

11 (20.0) 6 (28.6)

11 (20.0) 4 (19.0)

7 (12.7)

6 (28.6) 0.177*

GS: Gleason score, *: Fisher's exact test

Table 3. Expression of tubulin α and βII in localized prostate cancer and metastatic prostate cancer

Grade

Tubulin α

No. (%) p-value

Tubulin βⅡ

No. (%) p-value

0 1＋ 2＋ 3＋ 0 1＋ 2＋ 3＋

LCaP (n=59) MetCaP (n=18)

15 (25.4) 1 (5.6)

13 (22.1) 2 (11.2)

15 (25.4) 8 (44.4)

16 (27.1)

7 (38.8) 0.115* 24 (40.7) 7 (38.9)

14 (23.7) 3 (16.6)

9 (15.3) 7 (38.9)

12 (20.3)

1 (5.6) 0.1503*

LCaP: localized prostate cancer (including locally advanced cancer), MetCaP: metastatic prostate cancer. *: Fisher's exact test Table 2. Expression of tubulin α and βII in BPH and prostate cancer

Grade

Tubulin α

No. (%) p-value

Tubulin βII

No. (%) p-value

0 1＋ 2＋ 3＋ 0 1＋ 2＋ 3＋

BPH (n=25) CaP (n=77)

14 (56) 16 (20.7)

10 (40) 15 (19.5)

1 (4) 23 (29.9)

0 (0)

23 (29.9) 0.0000034* 25 (100) 31 (40.2)

0 (0) 17 (22.1)

0 (0) 16 (20.8)

0 (0)

13 (16.9) 0.000001*

BPH: benign prostatic hyperplasia, CaP: prostate cancer. *: Fisher's exact test

2) Tubulin βII: 전이성 전립선암에서 국소성 전립선암과 발현도에 차이가 나타나지 않았다 (p=0.150) (Table 3).

4. Gleason 점수에 따른 tubulin α, βII의 발현도 비교 1) Tubulin α: Gleason 점수 8 이상인 군에서 Gleason 점 수가 7 이하인 군보다 더 강하게 발현되어 Gleason 점수가 높은 경우 더 강한 발현도를 나타냈다 (p=0.011) (Table 4).

2) Tubulin βII: Gleason 점수 8 이상인 군과 Gleason 점 수가 7 이하인 군 사이에 발현도의 차이를 보이지 않았다

(p=0.177) (Table 4).

5. 혈청 PSA 농도에 따른 tubulin α, βII의 발현도 비교 1) Tubulin α: 혈청 PSA 4ng/ml 미만인 군에서 미만성 (3＋) 발현은 관찰되지 않았으며 혈청 PSA 4ng/ml 이상인 군에서 더 강하게 발현되어, 혈청 PSA가 높은 경우 더 강한 발현도를 나타냈다 (p=0.000067) (Table 5).

2) Tubulin βII: 혈청 PSA 4ng/ml 이상인 군에서 혈청 PSA 4ng/ml 미만인 군보다 강하게 발현되어 혈청 PSA가 높

은 경우 더 강한 발현도를 나타냈다 (p=0.000037) (Table 5).

고 찰

Tubulin α는 전립선암 세포에서 정상세포와는 다른 분자 적 프로파일을 갖는다고 보고되고 있어 새로운 분자생물학 적 치료방법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 Tu- bulin α 아세틸레이션의 감소는 안드로겐 수용체 소실의 지표로서 진단적 가치를 가질 것으로 기대된다.⁷

Tubulin이 보통 αβ이량체 (heterodimer)로 존재하고 있으 며 면역형광염색에서 tubulin α, βII가 같은 패턴으로 관찰 되어 tubulin α의 발현이 tubulin βII의 발현과 연관이 있다 는 보고가 있으며^18,19 본 연구에서도 실제로 tubulin α는 전 립선암에서 더 강한 발현도를 나타냈으며 tubulin α와 βII 의 발현도는 비슷한 양상으로 관찰되었다. 따라서 tubulin α와 βII 모두 전립선암의 발생과 연관이 있을 것으로 생 각한다.

Ranganathan 등¹⁷은 전립선비대증에 비해서 전립선암에 서 tubulin βII가 더 많이 발현된다고 보고하였다. 정상 세 포의 세포질에만 존재하는 tubulin βII는 전립선암 세포의 핵내에서 관찰된다. 정상세포의 핵에서 tubulin βII가 관찰 되지 않는 점은 핵 내 tubulin βII가 암과 관련있을 것으로 생각된다.¹⁷

최근 hormone refractory prostate cancer (HRPC)에 taxol 계 열의 제제 사용이 효과가 있다고 보고되고 있다. Taxol은 다른 tubulin β 아형보다 tubulin βII에 더 특이적으로 작용 하는 것으로 알려져 있다.²⁰ Taxol은 두 가지 효과를 나타내 는데 세포고사뿐만 아니라 tubulin βII를 재배열시키고 더 높은 농도에서는 tubulin βII를 고갈시킨다.¹⁹ Tubulin βII의 발현이 이러한 항미세관 제제에 대한 저항성을 나타낸다는 보고가 있다.^21,22 따라서 전립선암 환자에서 tubulin βII의 발현 정도에 따라 항암화학요법에 대한 반응 예측 및 치료 효과 판정에 이용할 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구에서 는 전립선암으로 새롭게 진단된 환자에서만 tubulin βII의 발현도를 조사한 한계가 있다. 따라서 항암화학요법 등 치 료 전후 발현도에 대한 조사가 필요하다.

16례의 전립선암에서 모두 핵 내 tubulin βII의 발현이 관 찰되나 발현되는 위치나 정도는 병기 또는 분화도 사이에 연관성이 없다는 보고가 있으며, 전립선비대증에서는 19례 중 단 1례를 제외한 모든 예에서 핵 내 tubulin βII 발현이 있었다는 보고가 있으나 핵 내와 세포질 내의 전체 tubulin βII의 발현은 전립선비대증보다 전립선암에서 높게 발현 된다.²³ 본 연구에서도 마찬가지로 전립선비대증보다 전립 선암에서 통계적으로 유의하게 강한 발현도를 나타냈으나

전립선비대증에서는 25례 모두에서 발현되지 않았다. 전립 선비대증에서 전혀 발현되지 않은 점은 Yeh 등²³의 보고와 는 상이한 결과로 그 이유는 명확하지 않다. 병기에 따른 비교에서 국소성 전립선암과 전이성 전립선암 사이에는 발 현도에 차이가 나타나지 않았다. 분화도에 따른 비교에서 는 Gleason 점수 8 이상인 군에서 더 강한 발현도를 나타냈 다. 따라서 병기보다는 분화도에 따라 더 강한 발현도를 나 타낸 것으로 생각한다. 다만 병기에 따른 비교의 경우보다 많은 증례에 대해 실험한다면 같은 결과가 나올 것으로 생 각한다.

혈청 PSA에 따른 tubulin α와 βII의 발현도에 대한 이전 의 보고는 없었으나 tubulin α와 βII 모두 혈청 PSA 4ng/ml 이상인 경우 더 강한 발현도를 나타냈다. 따라서 tubulin α 와 βII가 전립선암의 진단, 예후, 치료에 대한 반응의 표지 자가 될 수 있을 것으로 생각한다. 따라서 전립선암의 치료 후 재발률, 생존율 등과 tubulin α와 βII의 발현 정도의 변 화와의 상관성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.

결 론

Tubulin α와 βII가 전립선비대증 조직에 비해 전립선암 에서 더 많이 발현되는 것은 Tubulin α와 βII의 발현이 전 립선암의 발생과 연관이 있을 것으로 생각한다. 또한 tubulin α와 βII가 Gleason 점수, 혈청 PSA 농도 증가에 따라 더 강한 발현도를 나타내고 항미세관 항암화학요법 제제의 주 요 표적이 되고 있어 전립선암의 진단, 예후, 치료 및 치료 의 평가에 이용할 수 있을 것으로 생각한다.

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