192 서 론
세포사멸 (apoptosis)은 손상된, 또는 그 기능이 필요가 없어진 세포와 조직들을 제거하는 수단으로서, 다세포 생물체의 발생 과정에서 또는 성체가 된 다음에도 일어 난다. 화상과 타박 등의 외부 자극에 의해서 일어나는
세포 괴사(necrosis)와는 달리, growth factor, 호르몬 recep- tor-ligand의 interaction, cytotoxic T cell에 의해서 일어나는 것이 특징이다.1∼5) 이러한 세포사멸이 적절한 시기에 일 어나지 못하면 비정상적인 발생이 생기며 노인성 치매, 뇌졸중, 암등 각종 질병의 발병원인이 된다. 따라서 생체 내 세포사멸 과정의 복잡한 신호전달 복합체의 기능과 세포 내 작용 기작을 밝히는 것은 생명의 신비를 알 수
과산화수소에 의해 유도되는 세포사멸을 저해하는 Bax Inhibitorꠂ1
건국대학교 동물생명공학과
김수정․김정현․정효순․이응룡․조쌍구
Bax Inhibitor-1 Suppresses Hydrogen Peroxide-induced Apoptosis by Regulating Intracellular ROS Level
Su-Jeong Kim, Jung-Hyun Kim, Hyo-Soon Jeong, Eung-Ryoung Lee and Ssang-Goo Cho Department of Animal Biotechnology and RCTCP, Konkuk University, Seoul 143-701, Korea
Bax Inhibitor-1 (BI-1) is an anti-apoptotic transmembrane protein that is related with Bcl-2 family proteins, but it does not belong to any known gene family of vertebrates. BI-1 seemed to be an ancient regulatory protein, as homologues of BI-1 exist in not only most eukaryotes but prokaryotes. Recent studies showed that overexpression of BI-1 were observed in several kinds of cancers and led to suppression of the apoptotic cell death. BI-1 was found to have anti-apoptotic and oncogenic effects, but the exact molecular mechanism for the effects was not completely understood. Here, in order to investigate the relationship between the anti-apoptotic functions of BI-1 and reactive oxygen species (ROS) production, we studied the effect of BI-1 overexpression on the hydrogen peroxide-induced apoptosis. Cell death was induced by hydrogen peroxide treatment in a dose-dependent manner and found to be suppressed by stable expression of human BI-1. From DAPI-staining nuclear fragmentation analysis, stable expression of human BI-1 was assessed to protect the cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis. Moreover, BI-1 expression had effect on decreasing the intracellular ROS level induced by hydrogen peroxide-caused oxidative stress. These results indicate that BI-1 could suppress hydrogen peroxide-induced apoptosis by regulating intracellular ROS level. (Cancer Prev Res 11, 192-198, 2006) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Bax Inhibitor-1, Apoptosis, Reactive oxygen species, Hydrogen peroxide
책임저자：조쌍구, ꂕ 143-701, 서울시 광진구 화양동 1 건국대학교 동물생명공학과
Tel: 02-450-4207, Fax: 02-455-1044 E-mail: [email protected]
접수일：2006년 8월 28일, 게재승인일：2006년 9월 19일
Correspondence to：Ssang-Goo Cho
Department of Animal Biotechnology and RCTCP, Konkuk University, 1, Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seoul 134-701, Korea
Tel: +82-2-450-4207, Fax: +82-2-455-1044 E-mail: [email protected]
있는 중요한 단서일 뿐만 아니라, 인간의 여러 질병들의 발병 원인들을 분자생물학적으로 이해하는데 매우 중요 한 분야가 되고 있다.
이러한 이유로 최근 많은 연구자들에 의해 세포사멸 의 생화학적 및 분자생물학적 조절 기작 연구가 활발히 진행되고 있고, 여러 가지 세포내 조절 단백질들이 제시 되었다. 하지만, 아직까지도 정확한 신호전달 기전은 충 분히 규명되고 있지 못한 실정이며, 보다 체계적인 기전 규명을 위해서는 새로운 세포사멸 조절 인자의 발견이 필요하다. 세포사멸에는 다양한 단백질들이 관여하는 데, 대표적으로 Bcl-2 family가 잘 알려져 있다. 세포사멸 저해 단백질(Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w)과, 세포사멸 유도 단백 질(Bax, Bak, Bok, Bid)의 두 가지 그룹으로 구성이 되며, 이들의 상호작용은 세포사멸을 조절하는데 중요한 역할 을 한다.3∼5)
세포사멸을 조절하는 새로운 유전자 발굴 연구를 통 해, 1998년도 J. C. Reed에 의해서 Bax의 과발현에 의한 세포사멸을 저해하는 단백질인 “Bax Inhibitor-1 (BI-1)”이 최초로 밝혀졌다.6) BI-1은 Bax의 과발현에 의한 세포사 멸 외에도 세포사멸을 유도하는 물질인 etoposide, sta- urosporine 그리고 serum deprivation에 의한 세포사멸도 억 제한다고 보고되어 졌다.7) 특이한 점은, 여러 종에서 BI-1의 유사단백질(homolog)이 있다고 밝혀지고 있으며, 서로 간의 아미노산 유사성이 매우 높고, 기능상의 연관 성도 높은 것으로 조사되고 있다.4,8) 즉, 다양한 종에서 발견된 BI-1은 동물과 식물에서 세포사멸을 저해한다는 연구 결과가 있으며,9) yeast에 여러 종의 BI-1을 넣고 발 현시켰을 때도 세포사멸을 억제하였다. 또한, 식물 BI-1 은 식물세포나 yeast에서 H2O2 (hydrogen peroxide)에 의한 세포사멸을 저해하는 효과가 있다고 연구되었다.10) 세포사멸을 조절하는 요인 중, 한 가지인 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS)은 hydroxyl (.OH), alkoxy (RO.) 또는 peroxyl (ROO.) radicals과 같이 짧은 반감기를 갖는 것과 superoxide (O2.) 또는 nitroxyl radical (NO.)을 일컫는 용어로 hydrogen peroxide (H2O2), organic hydroperoxides (ROOH) 그리고 hypochlorous acid (HOCl)도 ROS에 속한 다. ROS는 세포 안에서 여러 경로를 통해서 발생하게 되 는데, 다양한 stress에 노출되었을 때뿐만 아니라 정상적 인 호기성 대사 과정 중에도 생성될 수 있으며, 지방산의 beta-oxidation 동안, 그리고 radiation, 빛, 금속, redox drug 에 노출되었을 때 생성될 수 있다. 이러한 활성 산소종은 많은 degenerative disease의 원인이 된다고 알려져 있고, 또한 세포사멸을 유도한다.11) 이러한 ROS에 대한 BI-1의 역할에 대한 실험은 식물에서 주로 되어 있고, 동물세포
에서는 확인된 바가 없기 때문에 동물세포에서의 H2O2
에 대한 BI-1의 역할을 확인해 보았다.
재료 및 방법 1. BI-1 발현 벡터 제작
BI-1을 클로닝하기 위해서 human fetal brain cDNA을 이용하여 BI-1 cDNA을 PCR로 증폭하였다. PCR primer로 는 5’-GGGAAGAATTCATGAACATATTTG ATCGA-3’과 5’-GGGAACTCGAGTCATTTCTTCTCTTTCTT-3’을 사용하 였다. PCR로 증폭된 DNA를 클로닝하여, 염기서열 분석 으로 BI-1인 것을 확인한 뒤, HA tagging 발현벡터에 서 브클로닝하였다.
2. 세포 배양과 transfection
HEK293 세포주는 10% fetal bovine serum과 항생제(50 μg/ml streptomycin 및 50 U/ml penicillin)가 첨가된 DMEM 으로 37oC, 5% CO2 배양기에서 100 mm 배양조에 배양하 였고 2일에서 3일에 한번씩 분주함과 동시에 배양액을 갈아주었다. hBI-1 발현벡터를 사람의 신장 세포인 HEK- 293 세포에 calcium phosphate 방법으로 transfection 하여서 안정적으로 BI-1이 발현되는 HEK293/hBI-1 세포주를 만 들었다.
3. DAPI 염색
세포를 PBS로 세 번 수세한 후, 세포를 acetone/methanol (50：50, vol/vol)로 5분간 고정시킨 후 PBS로 3번 정도 수 세하였으며, 형광을 띠며 DNA에 결합하는 염색액인 4, 6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI, 2μg/ml) 용액으로 5분 간 염색하였다. 그리고 PBS로 2∼3번 정도 수세 후 염색 된 핵의 모양은 형광현미경(Carl zeiss, 서울특별시 마포구 상수동 141-1 BR 엘리텔 2층) 하에서 ultraviolet excitation filter (300∼500 nm)를 통해 관찰하였다.
4. MTT assay
H2O2에 의한 세포독성을 알아보기 위해 세포를(1×
106 cells/ml) 37oC, 5% CO2에서 24 시간 배양하였다. 배양 된 세포는 5×104 cells/ml으로 96 well에 100μl씩 분주한 후 24시간 배양 후 각 시료들을 처리해 주었다. 시료 처 리 24시간 후 MTT (2 mg/ml) 시약을 50μl 가하고 4시간 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 제거하고 DMSO를 150 μl씩 넣어 주었다. microplate (ELISA) reader로 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
5. 형광 현미경을 이용한 활성산소종의 측정 세포 내 활성산소종의 농도는 oxidant-sensitive fluores- cent probe인 DCFHDA를 이용해서 역상 현미경으로 측정 하였다. 세포는(1×106 cells/ml) 35 mm 배양조에서 배양 액과 함께 24시간 배양하였다. 그 후 세포에 시료를 24시 간 처리 후 5 mM DCFHDA를 37oC에서 30분간 처리하였 다. 그 후 PBS로 4번 수세하고 cover glass를 덮은 다음 역 상 형광 현미경(excitation, 488 nm; emission, 520 nm)을 이 용하여 확인하였다.
6. 형광세기를 이용한 활성산소종 생성량의 정량화 세포 내 활성산소종의 생성 정도를 정량화하기 위하여 DCFHDA를 사용하여 excitation 파장은 504 nm, emission 파장은 524 nm에서 peroxide에 의해 DCFHDA가 산화되 어 생성되는 DCF의 형광을 측정하였다. 측정하기 30분 전에 DCFHDA를 5 mM 되도록 처리하고 30oC에서 배양 한 후 세포를 모은 후 sonication buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 5 mM NaCl, 5% glycerol, 1 mM so- dium orthovanadate, 50 mM sodium fluoride, 1 mM p-ni- trophenol phosphate, 1 mM PMSF)를 첨가하여 초음파 파쇄 기로 4 초씩 7회 파쇄한 후 12,000×g에서 15분간 원심분 리하여 얻은 상등액의 단백질을 BSA를 표준 물질로 하 여 BSA 단백질 정량 kit을 이용해 562 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후 동일한 양의 단백질을 이용하여 Shimadzu RF5301 PC spectrofluorometer로 excitation 504 nm, emission 524 nm 파장에서 세포 내 활성산소의 형광세기 를 측정하였다.
결 과 1. hBI-1의 클로닝과 발현 확인
hBI-1에 대한 연구를 하기 위해서 human fetal brain cDNA library을 이용하여 hBI-1 유전자를 증폭하여서 클 로닝하였다. 또한, hBI-1의 발현을 확인하기 위해서 HA 가 tagging된 발현벡터에 클로닝하였다. 이렇게 만들어 진 hBI-1 발현 플라스미드를 HEK293T 세포에 transfection 하였고, 안정하게 hBI-1이 발현되는 HEK293T/hBI-1 세포 를 확립하였다. hBI-1의 발현은 RT-PCR과 western blotting 으로 확인하였다(Fig. 1).
2. H2O2에 의한 cell death에서 BI-1의 역할 H2O2 (Hydrogen peroxide)에 의해서 cell death가 일어난 다는 기존의 연구를 바탕으로, H2O2가 세포에 어떤 영향
을 주어 cell death를 유도하는지와 H2O2에 의한 cell death 에서 BI-1이 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 실험 을 진행하였다. HEK293 세포와 HEK293/hBI-1 세포에 H2O2를 0.1, 0.3. 0.5 mM로 처리한 후 24시간 뒤에 MTT assay를 수행 해보았다. 그 결과 HEK293 세포에서 H2O2
의 농도에 의존적으로 cell death가 유도되는 것을 확인하 였고, 그와는 다르게 HEK293/hBI-1은 H2O2에 의한 cell death를 억제하였다. 이에 hBI-1 과발현이 세포에서 H2O2
에 의한 cell death를 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2).
Fig. 1. Expression of human BI-1 in HEK293 cells. The cDNAs encoding human BI-1 was subcloned into pEF-HA mammalian expression vector. Expression of the hBI-1 is demonstrated by RT-PCR using HA/ hBI-1 primers and western blot analysis using HA antibody.
RT-PCR
A
Western blot
HEK293
HEK293/hBI-1 hBI-1 GAPDH
hBI-1 (HA) Actin
B
Fig. 2. Cell viability of H2O2-treated HEK293 or HEK293/hBI-1 cells. HEK293 and HEK293/hBI-1 cells (1×105) were treated with various concentrations of H2O2 (0.1, 0.3, 0.5 uM) for 24 hrs.
After 24 hrs, cell viability was determined by MTT assay. The percentage of cell viability was normalized to the control cells.
Data are expressed as the means±S.E. of values obtained in three separate experiments.
3. H2O2에 의한 cell death에서 세포내 ROS의 생성 확인
H2O2를 세포에 처리하면 세포 내에 ROS가 생성되며, 그것에 의해서 cell death가 유도된다는 보고가 되어져 있 다. 본 연구에서도 H2O2를 세포에 처리 한 후 cell death가 ROS에 의한 cell death인지를 확인하기 위해 ROS생성 억 제 물질인 N-acetyl-L-cysteine (NAC)를 처리하여 cell death 를 살펴보았다. 그 결과, NAC를 처리함으로써 HEK293 세포와 HEK293/hBI-1 세포에서 H2O2에 의한 cell death가 억제되는 것을 볼 수 있었다. 이것으로 H2O2가 유도하는 cell death에는 ROS가 중요하게 작용함을 알 수 있었다 (Fig. 3).
4. H2O2에 의한 세포내 ROS 생성에서 BI-1의 ROS 억제 효과
Fig. 3의 결과에서 H2O2에 의한 cell death가 세포내 ROS 의 생성에 의한 것임을 확인 하였고, 그 생성 정도를 알 아보고자 ROS를 측정하는 형광시약인 DCFHDA를 사용 하여 실험을 진행하였다. HEK293 세포와 HEK293/hBI-1 세포에 H2O2를 농도별로(0.1, 0.3, 0.5 mM)로 처리한 후, 형광 현미경을 이용하여 확인 한 결과 두 세포 모두 농
도에 의존적으로 ROS가 생성이 되었다 그러나, HEK293 세포보다 HEK293/hBI-1 세포에서 H2O2에 의한 세포내 ROS 생성이 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4A).
또한, 전 실험 결과에서 H2O2와 NAC를 같이 처리하였을
Fig. 4. Stable expression of human BI-1 suppressed intracellular ROS production in HEK293 and HEK293/hBI-1 cells. A) HEK293 and HEK293/hBI-1 cells were treated with various concentrations of H2O2 (0.1, 0.3, 0.5 mM) for 24 hrs. After 24 hrs, intracellular ROS levels were evaluated by fluorescence microscopy with an oxidant-sensitive probe, DCFHDA. DCF fluorescence was then determined with a spectrofluorometer (excitation, 504 nm; emission, 524 nm). B) Cells were pretreated with NAC (1 mM) for 1 hour, and then exposed to H2O2 (0.3 mM) for 24 hrs. The results were expressed as the means±S.D. of three separate experiments.
Relative fluorescence (%)
0 20 40 60 80 100
Control 0.1 0.3 0.5 mM
HEK293
HEK293 /hBI-1
Relative fluorescence (%)
0 20 40 60
- + + -
H O (0.3 mM)2 2
- - + +
NAC (1 mM)
Control 0.1 0.3 0.5 mM
Hydrogen peroxide (H O )2 2 HEK293
HEK293/hBI-1
HEK293 HEK293/hBI-1
A
B
Fig. 3. NAC inhibits H2O2 - induced cell death in HEK293 and HEK293/hBI-1 cells. HEK293 and HEK293/hBI-1 cells (1×105) were pretreated with 1 mM NAC (N-acetylcysteine) for 1 hr and then treated with 0.3 mM H2O2 for 24 hrs. MTT assay was performed and the cell viability was determined by relative absorbance normalized to the control cells. Data are expressed as the means±
S.E. of values obtained in three separate experiments.
때 cell death가 감소하였다. 이것이 ROS 생성 감소에 의 한 것인지 알아보기 위해 NAC를 전 처리하고 H2O2 를 처리하였을 때 세포 내 ROS를 측정해 보았다. 그 결과 HEK293 세포와 HEK293/hBI-1 세포에서 H2O2에 의한 ROS생성을 NAC가 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 4B).
이 결과로 hBI-1은 H2O2에 의한 세포내의 ROS 생성을 억제하여 cell death를 억제함을 알 수 있었다.
5. H2O2에 의한 세포사멸에서 BI-1의 세포사멸 억제 효과
H2O2에 의한 cell death가 세포사멸인지 확인하기 위해 핵의 염색질을 염색하는 DAPI 시약을 이용하여 염색하 였다. 그 결과로 H2O2의 농도에 의존적으로 핵의 단편화 로 보이는 세포가 증가되는 것을 확인하였으며, Fig. 4A 의 결과와 마찬가지로 HEK293 세포보다 HEK293/hBI-1 세포에서 H2O2에 의한 핵의 단편화가 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 또한 NAC의 전 처리에 의한 H2O2에 의한 세포사멸을 확인해 본 결과 HEK293 세포와 HEK293/hBI-1 세포 모두 핵의 단편화가 현저히 감소함을 확인하였다(Fig. 5B). 이 결과를 통해 H2O2에 의 한 Cell death가 세포사멸에 의한 것임을 확인할 수 있었 고, hBI-1의 H2O2에 의한 세포사멸은 세포 내 ROS의 생
성 억제에 의한 세포사멸 억제 효과임을 확인하였다.
고 찰
세포사멸은 많은 질병과 연관이 높은 만큼 중요하게 다루어지고 있는 분야이며, 이러한 이유로 많은 과학자 들이 세포사멸의 조절을 연구하고 있다. 세포사멸을 조 절하는 정확한 기작을 연구하여 밝혀내게 된다면 AIDS 나 암 등 현재 인간에게 많은 위협을 가하고 있는 많은 질병을 치료하거나 예방할 수 있을 것으로 보인다. 세포 사멸을 조절하는 여러 가지 단백질과 신호전달과정이 연구되고 있지만, 자세한 작용기작 규명을 위해서는 보 다 광범위한 연구가 필요하다. 이번 연구에 사용된 BI-1 은 Bax에 의한 세포사멸을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 여러 자극에 의한 세포사멸로부터도 세포를 보호하는 것으로 나타났다. 또한, 동물, 식물을 비롯해서 미생물에 도 유사 단백질이 존재하는 것으로 밝혀지고 있으며, 각 각의 작용과 그 기작이 비슷하다고 알려져 있다. 하지만, 어떻게 세포사멸을 막는지에 대해서는 그 기작과 관련 단백질이 아직 정확하게 밝혀져 있지 않다. 특히, ROS와 관련된 실험은 주로 식물에서만 되어 있는 것을 착안하 여, 동물세포에서 BI-1과 ROS와의 관계를 알아보기 위해 Fig. 5. Stable expression of human BI-1 protect H2O2-induced apoptosis in HEK293 cells. (A) HEK293 and HEK293/hBI-1 cells were treated with various concentrations of H2O2 (0.1, 0.3, 0.5 mM) for 24 hrs. Cells were fixed and permeablized with methanol/acetic acid (1：1, vol/vol) and then loaded with 0.8μg/ml DAPI for 5 min. Fluorescence images were obtained under fluorescence microscope.
B) Cells were pretreated with NAC (1 mM) for 1 hr, and then exposed to H2O2 (0.3 mM) for 24 hrs. The results were expressed as the means±S.D. of three separate experiments.
0 20 40 60 80 100
Apoptotic cell rate (%)
0 20 60 80
- + + -
H O (0.3 mM)2 2
- - + +
NAC (1 mM)
Control 0.1 0.3 0.5 mM
Hydrogen peroxide (H O )2 2 HEK293
HEK293/hBI-1
HEK293 HEK293/hBI-1
B
Control 0.1 0.3 0.5 mM
HEK293
HEK293 /hBI-1
A
40
서 실험을 하여 보았다. ROS는 세포사멸을 조절하는 요 소 중 하나로서 세포 안에서 여러 경로를 통해서 생성되 는데, 많은 degenerative disease의 원인이 된다고 알려져 있고 세포사멸을 유도한다고 밝혀져 있다. 본 연구에서 는 여러 ROS 생성 요소 중 하나인 H2O2를 세포에 처리하 여 BI-1의 역할에 대한 실험을 실시하였다. 그 결과 H2O2
에 의해서 세포사멸이 유도되었고, 그것은 ROS 생성 증 가에 의한 것이라고 밝혔다. 이 과정에서 BI-1은 H2O2에 의해 생성되는 ROS를 억제하여 세포사멸을 억제하는 것 으로 나타났다(Fig. 6). 하지만 아직까지 human BI-1이 어 떠한 경로를 통해 H2O2에 의한 ROS 생성을 억제하여 세 포사멸을 막는지에 대해서는 알려진 바가 없다. ROS의 생성에는 NAD(P)H oxidase와 같은 다양한 단백질이 관여 를 하는 것으로 밝혀져 있다.12) 따라서 BI-1이 이와 같은 단백질과 어떠한 관련이 있는지에 관한 연구가 필요할 것이다. 또한, 세포 내에 ROS가 생성되면 다양한 세포신 호전달과정에 영향을 주며, 그로 인해서 세포사멸이 일 어난다고 밝혀져 있다. 그중 세포내의 칼슘과 연관이 있 다는 연구도 있다.13,14) 칼슘의 조절 역시 세포사멸과 밀 접한 연관이 있고, BI-1에 대한 최근 연구에서 BI-1이 칼 슘조절에도 관련이 있다고 보고되고 있다.15,16) 따라서, ROS 생성 조절, 칼슘과의 관계 등 많은 후속연구가 이 루어지면 BI-1의 세포사멸 조절 과정을 더 명확하게 알 수 있으며, 나아가 비정상적인 세포사멸에 의해 생기는 암, 퇴행성 신경질환에 대한 치료도 가능할 것으로 보 인다.
결 론
Human BI-1은 H2O2에 의한 인간 신장 세포인 HEK293 cell의 세포사멸을 저해하였고 그 기작은 H2O2에 생성되 는 세포내 ROS의 감소에 의한 것임을 확인하였다. 따라 서 인간 신장 세포인 HEK293 cell의 H2O2에 대한 세포 방어 기작에 관여하는 것으로 생각된다.
감사의 글
This work was supported by the Korea Research Foundation Grant funded by the Korean Government (MOEHRD) (KRF-2005-070-C00095) and by the Research Project on the Production of Bio-organs (No. 200503030204), Ministry of Agriculture and Forestry, Republic of Korea.
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