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이학 석사학위 논문

정렬된 나노섬유를 이용한 내피 세포배양

Endothelial cell culture using aligned nanofibers

아 주 대 학 교 대 학 원

의학과/융합의생명전공

김 용 수

정렬된 나노섬유를 이용한 내피 세포배양

지도교수 곽 종 영

이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.

2021 년 8 월

아 주 대 학 교 대 학 원

의학과

김 용 수

감사의 글

많은 시간이 지나 석사 과정을 통하여 여러 가지를 배운 값진 시간이었습니다.

처음으로 해본 연구실 생활은 실험에 대한 단순한 흥미를 느낀 저에게 연구 란 어떤 것인지 교수님의 지도를 받아 다방면으로 생각할 수 있게 지도해 주셨습니다. 가장 기본적인 실험하는 사람의 마음가짐과 하나를 연구하더라도 제대로 하는 방법을 저에게 세세히 지도해 주셨습니다. 그저 실험에 대한 흥미만 있는 채로 입학하였던 저를 교수님께서 옆에서 신경 써 주신 덕분에 조금 더 발전한 제가 있다고 생각합니다. 물론 지금도 많이 부족하고 어리숙하지만, 석사과정에서 교수님의 그동안의 가르침을 항상 상기하고 마음에 새기며 그것을 바탕으로 앞으로 나갈 수 있는 밑거름의 바탕으로 나아가겠습니다. 그리고 함께 실험실에서 지내온 실험실 식구들에게도 감사드립니다. 적응이 필요한 저에게 많이 도움을 주어 좀 더 빨리 여러 사람과 함께 융화돼서 잘 지낼 수 있었습니다. 항상 웃음으로 가득했던 이유는 실험실 가족들이 있었기에 가능했다고 생각합니다. 전혜영 선생님, 민호, 상원, 정인, 지현, Perry, 규민, 연주까지 모두 긴 시간 동안 함께해 주어서 감사하고 부족한 저를 좋게 봐주셔서 감사합니다.

마지막으로 항상 뒤에서 격려와 응원을 해 주신 가족들과 언제나 옆에서 힘이 되어준 사람들에게 감사드립니다. 더욱더 나은 사람이 되도록 노력하여 발전하는 모습을 보여드릴 것으로 다짐하고 멈추지 않고 계속 성장해가는 사람이 되도록 하겠습니다. 다시 한번 저를 위해서 힘써 주신 분들에게 감사드립니다.

김용수 드림

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요약

세포배양은 일반적으로 2차원 환경에서 진행을 하게 되지만 실제 임상실험 에서 나타날 수 있는 결과는 차이가 나기 때문에 임상실험과 비슷한 조건에 3 차원 구조를 같고 있는 배양환경을 조성하여 실제와 비슷한 결과를 확인할 수 있다. 이를 위해 사용한 3차원 환경으로 구축한 나노 섬유를 제작하였으며 이 것을 관찰하였을 때 나타나는 특징으로 실처럼 방사되며 무작위적 상태를 보여 주었다. 이와 같은 방법으로 정렬된 나노섬유를 제작하였고 이는 체내 혈관과 유사한 모습을 나타낸다. 제작한 나노섬유에 내피세포를 배양하여 두 가지 나 노섬유에 차이와 배양된 세포의 모습을 관찰할 수 있다. 나노섬유는 chloroform을 용매로 사용하여 Poly ε-caprolactone(PCL)을 전기방사로 진 행하여 제작되며(C-PCL), 정렬된 Poly ε-caprolactone(Aligned-C-PCL) 과 함께 제작하여 3차원 나노섬유를 구축하였다. 세포 성장에 대한 차이를 비 교하기 위해 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor)를 적당 한 농도로 처리하였다. 완성된 C-PCL에 배양한 내피세포는 무작위적 특징의 나노섬유를 따라 넓게 퍼져 자란 형태가 나타났으며 Aligned-C-PCL(이하 AC-PCL)에 배양한 내피세포는 정렬된 형태의 나노섬유를 따라 한 방향으로 자라는 모습을 나타나게 되었다. 혈관 내피 성장인자(이하 VEGF)를 처리한 세포배양 군이 VEGF를 처리하지 않은 세포배양 군 보다 많은 성장을 하였다.

실험 모델로 3차원 배양의 특징을 살려 세포배양을 확인할 수 있다.

핵심어: 나노섬유, 전기방사, 정렬된 나노섬유, 3차원 세포배양, 내피세포, 혈 관 내피세포 성장인자

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차 례

요약•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅰ 차례•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅱ 그림차례•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••ⅳ 제 1 장 서론•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1 제 2 장 실험재료 및 방법•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3 2.1 실험 재료•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3 2.2 PCL 나노섬유 전기방사 및 제작••••••••••••••••••••••••••••••••••3 2.3 세포 배양 방법 (bEnd.3, HUVEC) ••••••••••••••••••••••••••••••4 2.4 PCL 나노섬유에 세포 배양 방법 ••••••••••••••••••••••••••••••••5 2.5 주사전자현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) ••••••••••••5 2.6 세포 면역 화학 염색법 (Immunocytochemistry) ••••••••••••••••••6 2.7 공초점 레이저 현미경 (Confocal laser microscopy) •••••••••••••••6 2.8 세포 증식 분석 (Cell proliferation assay) ••••••••••••••••••••••••7 2.9 통계 분석 (Statistical analysis) ••••••••••••••••••••••••••••••••••7 제 3 장 결과•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.1 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유의 형태와 차이•••••••••••••••••••••••8 3.2 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포 배양 •••••••••••••••••10 3.3 C-PCL 나노섬유에서 내피세포 관찰••••••••••••••••••••••••••••••12

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3.4 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포 관찰•••••••••••••••••••••••••••••14 3.5 내피 세포 배양 후 VEGF 처리••••••••••••••••••••••••••••••••••••16 제 4 장 고찰••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21 제 5 장 결론••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22 참고문헌••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23 ABSTRACT••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••27

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그림 차례

그림. 1 제작한 C-PCL과 AC-PCL의 형태 ••••••••••••••••••••••••••••••9

그림. 2 C-PCL과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 내피세포••••••••••••••11

그림. 3 C-PCL 나노섬유에서 내피세포의 성장•••••••••••••••••••••••••••13 그림. 4 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포의 성장 ••••••••••••••••••••••••15 그림. 5 공초점 현미경을 사용한 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양된 내피세포에 VEGF 첨가 후 세포 성장 관찰••••••••••••••••••••••••17 그림. 6 SEM을 이용한 C-PCL과 AC-PCL 나노섬유에서 배양된 내피세포에 VEGF 첨가 후 세포 성장 관찰•••••••••••••••••••••••••••••••••••19 그림. 7 C-PCL과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 내피세포에 VEGF 첨가 전

과 VEGF 첨가 후 세포 수 비교 •••••••••••••••••••••••••••••••20

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Ⅰ. 서 론

세포 배양의 기술은 모든 실험에 대한 기본적인 기술이다. 대부분 세포를 부 착시키는 코팅제를 이용하여 세포를 배양시킨다. 이는 누구나 쉽게 따라 할 수 있을 정도로 실험이 간단하고 편리하게 실험을 진행할 수 있다 [1].

일반적 2차원적 세포배양 환경은 3차원적 세포배양 환경에 비하여 생체에 대 한 대응성이 낮아져 정확한 생리학적 조건이 다른 단점이 있으며 자연환경보다 높은 증식률과 대사 관찰이 용이하지 않고 세포 독소에 민감한 반응을 보인다 [2]. 이러한 단점을 보안하기 위해 3차원적 세포배양을 통하여 2차원 세포배 양에 비해 높은 분화력과 세포와 세포 연결이 모든 세포 면에서 이루어져 있어 세포 간 정보교환이 가능하게 되며 생체 대응성과 보다 정확한 생체 정보를 줄 수 있는 장점 있어 생체 내에 나타나는 비슷한 세포의 형태를 관찰할 수 있다 [3,4]. 나노섬유에 사용 가능한 적합한 세포 모델은 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 사용하였다. 각각 마우스에서 유래한 내피세포와 인간 혈관 내피세포이 다. 이를 사용한 이유는 bEnd.3 세포는 빠른 성장과 특성을 유지하고 무난한 적응성으로 인하여 선택을 하였으며 HUVEC 세포는 인간 세포에서 쉽게 배양 이 가능하고 마우스 세포와 비교하여 관찰이 용이 하기에 사용하였다 [5,6].

3차원 세포 배양을 위하여 전기방사에 의해 다양한 나노섬유를 제조하였다 [7]. 나노섬유를 제작하는 방법으로 전기방사를 통해 poly ε-caprolactone을 사용하여 나노섬유를 만들 수 있다 [8]. 제작한 나노섬유인 C-PCL은 섬유 가 닥의 직경, 공극 등의 차이와 분포와 크기에 따라 다르다 [9,10]. 나노섬유는 형태가 다양하고 세포 배양과 세포 부착에 매우 유리한 하며 세포 증식과 분화 에 적합한 나노섬유를 개발하고 실험에 이용하였다 [11,12]. Chloroform을 용 매로 전기방사로 제작한 C-PCL 나노섬유는 다양한 세포에 대해 생체 적합성 이 높기 때문에 세포의 부착, 성장, 분화 및 증식을 위해 사용되어 왔다. 또한

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3차원 세포 배양을 위한 나노섬유인 C-PCL과 비교하여 정렬된 형태의 AC- PCL을 제조하여 사용하였다 [13][14]. 이것으로 서로 비교하여 세포배양의 형태를 비교할 수 있다. 정렬된 형태의 PCL은 기존의 PCL과 다르게 무작위적 모양의 나노섬유가 아닌 일직선으로 나열된 모습을 나타내고 있음으로 생체 내 에 혈관의 모습과 비슷한 역할을 하게 된다. 이것은 기존의 PCL 나노섬유 보 다 내피세포배양에 있어서 나은 성장을 비교하여 확인할 수 있다 [15]. 이로 인하여 세포배양을 다양하고 훨씬 생체적인 특징을 나타낼 수 있다.

나노섬유에 내피세포를 배양하여 성장을 하는 것을 확실하게 보기 위해서 혈관 VEGF를 첨가하였다. VEGF를 첨가함으로써 혈관 신생을 일으켜 세포를 배양 했을 때 성장 모습이 두드러지게 나타나는 것을 직관적으로 확인하였다 [16,17]. 이 연구에서는 기존의 세포배양을 더욱더 발전시키는 것을 목표로 하 였다. 기존의 C-PCL과 AC-PCL의 차이를 확인하였다. bEnd.3 세포와 HUVEC 세포의 부착과 증식을 보았다. 각각 형태가 다른 나노섬유를 이용하여 배양시킨 세포가 나노섬유에 따라 다르게 성장하는 것을 비교하여 분석하였다.

VEGF를 첨가하여 배양한 세포가 혈관 신생이 일어나고 자라는 것을 조사하고 첨가 전 후의 차이를 비교하였다.

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제2 장 실험재료 및 방법

2.1 실험 재료

PCL (Mn = 700,000-900,000), Chloroform(SAMCHUN), Dimethyl Sulfoxide, Dimethylformamide (DMF), EBM-2 medium (Lonza), DMEM high medium (ATCC) , 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), 3% Glutaraldehyde (Merck), OsO4 (Sigma), Fetal Bovine Serum (Merck), penicillin/streptomycin (Gibco), Trypsin- EDTA soiution ethylenediaminetetraacetic acid(Welgene), anti-ZO-1 antibody (Invitrozen), Phalloidin-FITC (Sigma), Antibody Diluent OP Quanto (Thermo), Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rabbit IgG (Invitrogen), Polydimethylsiloxane (PDMS)(Corning), Recombinant Mouse VEGF 164(R&D), Human VEGF (jw CreaGene), D-Plus™ CCK cell viability assay kit (동인 LS)를 사용하였다.

2.2 PCL 나노섬유 전기방사 및 제작

다공성 나노섬유는 이전에 발표된 논문의 방법에 따라 제작하였다 [18].

전기 방사용 중합체인 PCL 을 99.5% pure chloroform 에 15%로 용해시켰다.

이후 5 시간 동안 교반 하여 균일한 용액을 얻었다. 나노섬유는 전기방사 (NanoNC, Seoul, Korea)를 통해 생성하였다. C-PCL 의 경우, 2 개의 주사기에 교반 하여 용액을 넣고 27G 노즐을 사용하였고 노즐과 나노섬유가 생성되는 롤러의 사이의 거리(TCD)를 20cm 만큼 설정하고 약 17.5 kV 의

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전위와 대략 8 ㎕/min 의 평균 유속과 100 RPM 의 속도로 X 축을 움직이면서 교차되는 형태로 전기 방사하였다. AC-PCL 의 경우, 1 개의 주사기의 교반 하여 얻은 용액을 넣고 27G 노즐을 사용하여 노즐과 나노섬유가 생성되는 롤러의 사이의 거리(TCD)를 16cm 만큼 설정하고 약 17.5 kv 의 전위와 대략 8 ㎕/min 의 평균 유속과 3000 RPM 의 속도로 X 축을 고정시킨 채 전기방사하였다. 주사 전자 현미경(SEM) SEM4500 모델 (Sec, Suwon, Korea)을 사용하여 전기 방사된 섬유의 형태를 비교하여 관찰하였다. 전기 방사로 제조된 나노 섬유를 70% 에탄올 용액을 처리하였으며 12 시간 동안 UV 노출시켜 건조, 멸균하였다.

2.3 세포 배양방법 (bEnd.3, HUVEC)

bEnd.3 세포는 혈관 내피세포로 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. bEnd.3 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(ATCC)에 `10% FBS 와 1% penicillin/streptomycin 을 첨가한 배지에서 배양하였다. HUVEC 세포는 인간 탯줄 정맥 내피세포로 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구매하였다. HUVEC 세포는 EBM-2 Medium (Lonza)에 10% FBS 와 1% penicillin/streptomycin 을 첨가한 배지에서 배양하였다. bEnd.3 세포와 HUVEC 세포는 2~3 일마다 계대 배양하였으며 모든 세포는 37 ℃의 온도와 5% CO2 농도로 조성된 세포배양기에서 배양하였다.

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2.4 PCL 나노섬유에 세포 배양 방법

1 cm x 1.2 cm 의 크기로 자른 PCL 나노섬유를 준비하였다. 8 well plate 위에 얇게 부착하여 PDMS 를 접착력이 있는 상태까지 굳혀 주었다. 이 위에 자른 PCL 나노섬유를 부착시켜주었고, 각각 DMEM 과 EBM-2 에 6 시간 동안 세포 배양 환경을 안정화하기 위해서 37 ℃에서 침지시켰다. 이후 세포를 10000 cell/wall 로 분주하였으며 분주한 세포는 5 일 동안 배양하였다.

2.5 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)

제작된 PCL 나노섬유의 형태 및 나노섬유에 부착된 세포의 형태를 SEM 을 통하여 비교 관찰하여 촬영하였다. SEM 을 이용하여 비교 관찰하여 촬영하기 위해서 전처리를 하였다. 전처리 과정은 배양된 세포를 1X PBS 로 2 회 세척하고 3% glutaraldehyde 가 포함된 0.1 M phosphate buffer 로 18 시간 동안 4 ℃에서 보관하여 고정하였다. 18 시간 후 고정된 나노섬유 및 부착된 세포를 0.1 M phosphate buffer 로 10 분씩 3 번 반복하여 세척하고 2% OsO4 (Sigma)가 포함된 0.1 M phosphate buffer 로 1 시간 동안 실온에 보관하여 2 차 고정을 하였다. 샘플의 탈수를 위해서 에탄올의 농도를 저 농도에서 고농도로 증가시키고 (30%, 50%, 7 70%, 90%, 95%, 100%) 실온에서 10 분 동안 순차적으로 진행하였다. 탈수한 후 완벽하게 건조해 주었다. 알루미늄 마운트에 양면 탄소 테이프를 붙이고 건조한 시킨 나노섬유를 부착시켰다.

이후 알루미늄 마운트를 금속 코팅하였다. 금으로 코팅된 나노섬유와 나노섬유에 부착된 세포의 형태는 SEM (SNE-4500M, Sec, Korea)을 사용하여 분석하였다.

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2.6 세포 면역 화학 염색법(Immunocytochemistry)

세포를 배양한 8 well plate 에 4% paraformaldehyde 를 넣고 실온에서 10 분 동안 고정하였다. 1X PBS 로 10 분 동안 세척하고 3 번 반복하였다. 5%

goat serum 과 0.2% Triton X-100 이 포함되어 있는 1X PBS 로 1 시간 동안 block 하였다. Antibody diluent OP Quanto (Thermo)에 1 차 항체를 희석 배수에 맞게 희석하고 18 시간 동안 4℃에서 보관하였다. 1 차 항체로는 anti-ZO-1 antibody (1:100 희석) (Invitrogen, CA, USA)를 사용하였다.

고정한 세포를 18 시간 후 1X PBS 로 10 분씩 세척하고 3 번 반복하여 antibody diluent OP Quanto (Thermo)에 2 차 항체를 희석 배수에 맞게 희석하여 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 2 차 항체로는 Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rabbit Ig G (1:200 희석) (Invitrogen)와 Alexa Fluor 488- conjugated Phalloidin (1:400 희석) (Sigma)을 희석하여 사용하였다. 1X PBS 로 10 분 동안 1 번 세척하고 DAPI (1:500 희석)를 희석시킨 1X PBS 에 10 분간 반응시킨 후 1X PBS 로 10 분 동안 1 번 세척하고 남아있는 1X PBS 를 전부 제거한 후 mounting gel 과 cover slide 를 이용하여 샘플을 봉입하였다.

2.7 공초점 레이저 현미경(Confocal laser microscopy)

8 well plate 에 부착시킨 나노섬유 위에 배양한 세포를 세포 면역 화학 염색법을 통해 부착한 특정 형광을 K1 공초점 현미경(Nanoscope, Korea)을 사용하여 비교 관찰하고 촬영을 하였다. 이후의 촬영한 세포들은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다.

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2.8 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)

Water-soluble tetrazolium salt-1 (WST1) assay 의 원리를 이용하여 세포 증식 분석을 하였다. 세포 내에 존재하는 미토콘드리아 탈 수소 효소에 WST-1 assay 는 수용성인 high sensitive water soluble tetrazolium salts 가 반응하여 형성되는 오렌지색의 발색 물질인 formazan 을 이용해 측정하는 방법이다. cell counting kit (Cell Counting kit-8 [CCK-8];

Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 세포 성장을 측정하였다. 세포를 배양하여 나노섬유를 부착한 8 well plate 에서 상층액을 제거하고 CCK-8 solution 을 포함한 용액을 well 당 300 ㎕ 첨가하였다. 37 ℃에 5% CO2 를 포함하는 배양기에서 1 시간 동안 세포를 배양하였다. 1 시간 후 상층액을 수집하고 원심 분리하여 96 well plate 로 옮겨주었으며 Microplate reader Synergy H1 (Biotek, Seoul, Korea)을 사용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

2.9 통계 분석(Statistical analysis)

값이 나온 결과는 평균 ± 표준 편차(SD) 값으로 표시하였으며 실험 결과는 Student t-test 로 검정하였으며, P-value 값이 <0.05 인 경우에만 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

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제3 장 결 과

3.1 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유의 형태와 차이

5 시간 동안 Chloroform 에 15%로 용해시킨 PCL 을 균일한 용액으로 교반 시킨 후 전기방사를 통해 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유를 제작하였다. 각각의 PCL 의 평균적인 두께는 57.0 ± 10.2 μm (n = 15)로 나타났다. 나노섬유의 구조는 SEM 을 통하여 분석하였다. 무작위로 배열된 C-PCL 의 경우 섬유의 직경이 평균 1.5 µm 으로 구성되어 있으며 AC-PCL 은 섬유의 평균 직경이 평균 1.3 µm 으로 구성되어 있다 (그림. 1). 전기 방사된 C-PCL 의 경우 무작위적 형태를 가지고 있으며 AC-PCL 의 경우 일정한 일직선의 형태를 가지고 있게 된다. 전기 방사된 나노섬유 모두 3 차원적 형태이며 C-PCL 의 경우 체내 유사 환경을 조성하였으며 AC-PCL 의 경우 3 차원적 형태는 물론 나란히 정렬된 나노섬유의 모습을 하고 있어 혈관을 연상시키게 된다. 각각의 나노섬유는 소수성의 성징을 가지며 수용액 처리 시 젖지 않는 성질을 이용하여 70% 에탄올 용액을 처리하였고 12 시간 동안 UV 를 이용하여 건조와 멸균시켜주어 사용하였다.

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그림. 1 제작한 C-PCL 과 AC-PCL 의 형태. 전기 방사하여 제작한 나노섬유이다. C- PCL 의 경우 무작위적 형태로 교차되어 제작되었고 AC-PCL 의 경우 나란한 형태에 일정한 방향으로 제작했다. 주사 전자 현미경의 배율은 2K 로 촬영(size bar=10μm).

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3.2 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포 배양

C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 배양하였다 (그림.

2). 두 세포를 C-PCL 과 AC-PCL 에 분주하고 1 일, 3 일, 5 일 동안 나눠 배양한 후 주사 전자 현미경을 통하여 세포가 부착해서 성장하고 생존하는 모습을 관찰하였다.

C-PCL 나노섬유에 배양한 세포는 무작위적 형태의 가닥을 따라 배양되는 것을 관찰하였다. AC-PCL 나노섬유에 배양한 세포는 일정하게 나열된 형태의 모습을 따라서 배양되는 것을 관찰하였다.

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그림. 2 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 내피세포. (A) C-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포. (B) AC-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포. 주사 현미경을 통해서 세포의 모양을 관찰. 주사 현미경의 배율은 2K 로 촬영(size bar=10μm).

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3.3 C-PCL 나노섬유에서 내피세포 관찰

C-PCL 나노섬유에 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 배양하여 1 일, 3 일, 5 일 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 그 후 세포 면역 화학 염색 후 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다(그림.3). C-PCL 에 배양한 세포는 나노섬유의 형태에 따라 무작위적 형태로 자라나는 모습을 보여주었다. bEnd.3 세포는 5 일 차로 갈수록 세포의 수와 성장이 증가하였다. HUVEC 세포는 세포 숫자가 5 일 차부터 감소하는 모습을 보이고 있지만 세포가 완전히 떨어지지 않고 유지하고 있는 추세를 확인할 수 있다.

13 그림. 3 C-PCL 나노섬유에서 내피세포의 성장.

C-PCL 에서 5 일까지 배양한 내피세포. (A) C-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포, (B) C-PCL 에서 배양한 HUVEC 세포이며 공초점 현미경을 통해서 세포의 모양을 관찰.

주사 현미경의 배율은 100 배와 400 배로 촬영 (size bar=50 μm). DAPI (blue), Phalloidin (green), ZO-1 (red).

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3.4 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포 관찰

AC-PCL 나노섬유에 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 배양하여 1 일, 3 일, 5 일 동안 세포 배양기에서 배양하였다. 그 후 세포 면역 화학 염색 후 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다(그림. 4) 그 결과 일직선의 일정한 형태를 따라가는 모습을 띠면서 세포가 자라는 모습을 보였다. 또한 자라면서 나노섬유 위를 덮어 퍼지는 형태의 모습도 같이 관찰할 수 있었다. bEnd.3 세포는 5 일 차로 갈 수 록 세포의 수와 성장이 증가하였다. HUVEC 세포는 세포의 숫자가 5 일 차부터 감소하는 추세를 보였지만 넓게 퍼져 자라는 모습은 보이고 있어 세포의 성장은 진행했다는 것을 확인할 수 있다.

15 그림. 4 AC-PCL 나노섬유에서 내피세포의 성장.

AC-PCL 에서 5 일까지 배양한 내피세포. (A) AC-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포, (B) AC-PCL 에서 배양한 HUVEC 세포이며 공초점 현미경을 통해서 세포의 모양을 관찰. 주사 현미경의 배율은 100 배와 400 배로 촬영 (size bar=50 μm). DAPI (blue), Phalloidin (green), ZO-1 (red).

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3.5 내피세포 배양 후 VEGF 처리

나노섬유에 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 배양한 후 C-PCL 에서 자라는 세포와 AC-PCL 에서 자라라는 세포를 비교하였다. 또한 확실한 차이를 비교하기 위해서 마우스와 인간에 맞는 VEGF 를 처리하였다. bEnd.3 세포와 HUVEC 세포에 20 ng/ml 씩 VEGF 를 첨가하였다. VEGF 를 처리한 세포는 처리 전 세포와 마찬가지로 1 일, 3 일 5 일 동안 세포 배양기에서 배양 후 주사 전자 현미경과 공초점 레이저 현미경과 사용하여 관찰하였다 (그림. 5, 6) (그림. 6). C-PCL 에 비해서 AC-PCL 에서 배양된 세포가 VEGF 를

첨가하였을 때 세포 연접을 관찰하였다. C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 bEnd.3 세포는 VEGF 를 처리하기 전보다 처리한 후에 많은 세포 양과 성장이 많이 된 모습을 보였으며, 1 일, 3 일 5, 일 동안 계속 증가한 모습을 보이고 있다. C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 HUVEC 세포의 경우 VEGF 를 처리하기 전보다 처리한 후에 세포의 성장이 많이 증가한 모습을 관찰할 수 있다. 하지만 1 일, 3 일, 5 일을 비교하였을 때 3 일 차까지 세포가 증가하고 세포가 나노섬유를 덮어 넓게 퍼져 자라는 모습을 보였지만, 5 일 차부터 세포수가 감소하였다(그림. 7).

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그림. 5 공초점 현미경을 사용한 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양된 내피세포에 VEGF 첨가 후 세포 성장 관찰. (A)(B) C-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포, (C)(D) AC-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포이며 M-VEGF (20 ng/ml), H-VEGF(20 ng/ml) 첨가 후 공초점 현미경을 통해서 세포의 성장을 관찰. 주사 현미경의 배율은 100 배와 400 배로 촬영 (size bar=50 μm). DAPI (blue), Phalloidin (green), ZO-1 (red).

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그림. 6 SEM 을 이용한 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양된 내피세포에 VEGF 첨가 후 세포 성장 관찰. (A) C-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포, (B) AC-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포이며 M-VEGF (20 ng/ml), H- VEGF(20 ng/ml) 첨가 후 주사 현미경을 통해서 세포의 성장을 관찰. 주사 현미경의 배율은 2K 로 촬영 (size bar=10μm).

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그림. 7 C-PCL 과 AC-PCL 나노섬유에서 배양한 내피세포에 VEGF 첨가 전과 VEGF 첨가 후 세포 수 비교. (A) C-PCL 과 AC-PCL 에서 배양한 bEnd.3 세포의 수를 M-VEGF (20 ng/ml) 첨가 전과 후를 비교하여 측정.(B) C-PCL 과 AC- PCL 에서 배양한 HUVEC 세포의 수를 H-VEGF (20 ng/ml) 첨가 전과 후를 비교하여 측정. 측정 결과는 mean ± SD values 로 표시하였다(n = 3). *p < 0.05, NS, not significant

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제 4 장 고찰

전기방사를 통하여 제작한 C-PCL 과 AC-PCL 에 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포를 배양하고 관찰하였을 때 원하는 3 차원 모습을 확인할 수 있었다.

bEnd.3 세포는 C-PCL 과 AC-PCL 모두에서 안정적으로 자라 세포가 부착력과 성장할 수 있는 환경을 조성하였다. HUVEC 세포는 C-PCL 과 AC- PCL 에서 어느 정도 안정성을 보이는 것 같지만 5 일 차에부터 세포의 수가 감소하는 것으로 보아 bEnd.3 세포에 비해 HUVEC 세포가 부착력이 떨어지는 것으로 확인되었다. 이를 통해 제작한 나노섬유에서 HUVEC 세포가 bEnd.3 세포보다 배양 환경이 완벽하지 못하여 세포의 수 가 감소된 것으로 보인다. 하지만, 세포가 성장하여 넓게 퍼지는 모습을 관찰할 수 있음으로 성장에 대한 기대치는 확인할 수 있었다. VEGF 를 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포에 첨가하였을 때 VEGF 를 첨가하였을 때 세포의 뚜렷한 성장을 확인하였다. bEnd.3 세포에 VEGF 를 첨가하여 5 일까지 배양하였을 때 VEGF 를 첨가하기 전보다 높은 성장과 세포 수의 증가를 확인할 수 있었다.

HUVEC 세포에 VEGF 를 첨가하였을 때 bEnd.3 와 마찬가지로 세포의 성장과 수의 증가를 확인할 수 있었다. 하지만 VEGF 를 첨가하기 전에 비해서 뚜렷한 성장과 세포 수의 증가를 확인할 수 있었지만 VEGF 를 첨가하지 전과 마찬가지로 5 일 차에부터 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 나노섬유에 안정성과 부착력을 높이는 장치가 필요할 것으로 보이며 인간 세포를 배양하여 5 일 차까지 안정적으로 자랄 수 있게 하는 체내 유사 환경 조성이 있어야 하며 동일한 조건으로 배양하는 추가적인 실험이 필요할 것으로 보인다. 이 연구로 세포배양을 간단하고 쉽게 배양하며 다양한 방법을 사용할 수 있으며 앞으로 더 나아갈 수 있는 연구로 도움이 될 것이라고 생각된다.

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제 5 장 결론

본 연구를 함으로써 제작된 3 차원 환경을 구성한 나노섬유의 형태에 따라 배양되는 세포의 모습을 관찰하는 연구를 하였다. C-PCL 의 경우 랜덤 한 형태를 나타나는 나노섬유이다. AC-PCL 의 경우 일정한 모양의 형태가 나타나는 나노섬유이다. 제작한 나노섬유에 bEnd.3 세포와 HUVE 세포를 배양하였다. 랜덤 한 형태를 나타내는 C-PCL 에 배양한 세포의 경우 무작위적 형태에 따라 자라는 모습이 나타났다. 일정한 형태를 나타내는 AC- PCL 에 배양한 세포의 경우 나란히 생성된 형태를 따라 자라는 세포의 모습을 관찰하였다. C-PCL 과 AC-PCL 의 자라는 세포의 성장과 세포의 수를 비교하였다. AC-PCL 에서 자라는 세포의 수와 성장이 C-PCL 에서 자라는 세포의 수보다 더 높게 나타났다. 제작한 나노섬유에 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포의 경우 bEnd.3 세포가 HUVEC 세포보다 유지되는 세포수가 더 높았다. VEGF 에 첨가 후 나타나는 세포의 성장을 VEGF 첨가 전과 비교를 확인하였다. 배양한 bEnd.3 세포와 HUVEC 세포의 경우 VEGF 첨가를 하였을 때 큰 증가를 보여 VEGF 첨가 전 후에 두드러진 비교를 할 수 있었다.

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ABSTRACT

Cell culture is generally carried out in a two-dimensional environment, but the results of actual clinical trials differ, so the results can be similar to that of a three-dimensional environment under similar conditions to clinical trials. To this end, nanofibers, built from the three-dimensional environment used, were produced, characterized by their observations, which radiated like threads and showed random conditions. In this way, ordered nanofibers are produced, which are similar to blood vessels in the body. Endothelial cells can be cultivated in manufactured nanofibers to observe differences in two nanofibers and the appearance of cultured cells.

Nanofibers are made using chloroform as a solvent by electrospiration of Polyε-caprolactone (PCL) (C-PCL) and in conjunction with aligned Poly ε-caprolactone (Aligned-C-PCL) to build three-dimensional nanofibers.

To compare differences in cell growth, the Vascular endothelial growth factor was treated at a moderate concentration. Endothelial cells cultured in the finished C-PCL were found to have grown extensively along random features of nanofibers, and endothelial cells cultured in Aligned- C-PCL (hereinafter referred to as AC-PCL) were shown to grow in one direction along aligned forms of nanofibers. The cell culture group that processed the endothelial growth factor (VEGF) grew more than the cell culture group that did not process VEGF. It can check cell culture by utilizing the characteristics of 3D culture as an experimental model.

Key words: nanofibre, electroradiation, aligned nanofibre, three-

dimensional cell culture, endothelial cells, vascular endothelial cell growth factors