에 감염된 생쥐에서 위염에 대한 위산의 역할

대한소화기학회지 2007;50:363-369

접수: 2007년 7월 23일, 승인: 2007년 10월 1일 연락처: 김성수, 480-821, 경기도 의정부시 금오동 65-1

가톨릭대학교 의정부성모병원 내과 Tel: (031) 820-3000, Fax: (031) 847-2719 E-mail: [email protected]

Correspondence to: Sung Soo Kim, M.D.

Department of Internal Medicine, Uijongbu St. Mary Hospi- tal, The Catholic University of Korea College of Medicine, 65-1, Geumo-dong, Uijeongbu 480-821, Korea

Tel: +82-31-820-3000, Fax: +82-31-847-2719 E-mail: [email protected]

Helicobacter pylori 에 감염된 생쥐에서 위염에 대한 위산의 역할

가톨릭대학교 의과대학 내과학교실

김성수ㆍ이여민ㆍ김형근ㆍ김진일ㆍ채현석ㆍ정인식ㆍ박두호

The Role of Gastric Acid in the H. pylori-induced Gastritis in Mouse

Sung Soo Kim, M.D., Yeo Min Lee, M.D., Hyung Keun Kim, M.D., Jin Il Kim, M.D., Hiun Suk Chae, M.D., In Sik Chung, M.D., and Doo Ho Park, M.D.

Department of Internal Medicine, The Catholic University of Korea College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: This study was designed to investigate the role of gastric acid in the extent of H. pylori-in- duced gastritis. Methods: Twenty eight mice were innoculated with live H. pylori. They were allocated into four groups. Mice in group I received no treatment, group II mice were treated with sham injection, group III received 125μg/kg body weight of pentagastrin, while group IV received 250μg/kg body weight of pentagastrin subcuta- neously three times a week. After 7 months, the mucosal pH, H. pylori density, neutrophils and monocytes in- filtration, and the degree of atrophy were assessed in the stomach. Results: In the gastric body, the densities of H. pylori were not different among groups. The degree of neutrophil infiltration was significantly lower in group IV compared to other groups (p＜0.05). The degree of monocyte infiltration was also significantly lower in group IV than group III (p＜0.05). In the gastric antrum, there was no significant difference of the H. pylori density, neutrophil and monocyte infiltration, and degree of atrophy among the groups. The mice with the gastric mucosal pH lower than mean of 3.2 had significant lower level of H. pylori density (1.4 vs. 2.4, p=0.04), and infiltration of neutrophils (0.9 vs. 2.3, p=0.018), and monocytes (1.2 vs. 1.8; p=0.011) than the those with mucosal pH above 3.2 in the body of stomach. Conclusions: Gastric acid plays a role in suppressing the proximal prop- agation of H. pylori-induced gastritis to the body of stomach. (Korean J Gastroenterol 2007;50:363-369)

Key Words: Helicobacter pylori; Gastric acid; Gastritis

서 론

Helicobacter pylori (H. pylori)는 위염, 위, 십이지장궤양을 유발하며, 위선암종 및 위림프종의 발생과도 관련 있는 것 으로 알려져 있다. H. pylori 감염은 전체 인구의 약 40-80%, 십이지장궤양 환자의 90-100%에서 감염되어 있고, 감염된 사람들의 대부분은 위염을 동반한다.¹ 그러나 위염의 양상

은 질환에 따라 서로 달라서, 위산분비량이 많은 십이지장 궤양 환자는 위 전정부에 국한되어 위염이 있으나 십이지장 궤양이 없는 환자들은 체부까지 위염이 넓게 퍼져 있으며 이들은 위산분비량이 감소되고 위축위염 및 장상피화생이 심하고 위선암종이 잘 발생하는 것으로 알려져 있다.^2,3 이 러한 H. pylori 감염에 따른 위염 범위의 차이가 위산분비량 의 차이에 기인하는지는 명확하지 않다.

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Fig. 1. Immunohistochemical stain of H. pylori, strain SS1, which infected the gastric mucosa of an C57BL/6 mouse shows large numbers of bacteria (arrow) on the epithelium (×200).

H. pylori는 강산의 위내 환경에서 생존하기 위해 요소분 해효소인 유레아제(urease)를 분비하여 산을 중화하여 적정 산도를 유지한다.⁴ 장기간 산분비억제제를 투여 받은 실험 동물이나 혹은 사람에서 H. pylori 집락은 전정부에서 체부 로 이동되고, 이로 인해 체부의 염증이 확산되는 것으로 보 고되었다.^5,6 또한 H. pylori에 감염된 위식도역류질환 환자에 서 장기간 omeprazole을 사용한 환자는 위축위염의 발생이 현저히 많은 것으로 보고되어, 위산 분비를 억제하면 H.

pylori에 감염된 환자에서 위염이 확산된다는 보고를 뒷받침 하고 있다.⁷ 그러나 위축위염의 빈도에 차이가 없다는 상반 된 보고도 있고, omeprazole은 H. pylori 이동에 영향을 주지 못하며 전정부와 체부 모두 H. pylori의 수가 감소한다는 보 고도 있다.^8,9 이들 연구에서는 산분비억제제인 omeprazole 을 이용하였는데 omeprazole은 H. pylori에 대해 제균 효과가 있기 때문에 H. pylori의 분포에 영향을 줄 수 있다. 따라서 H. pylori의 분포와 위염의 진행에 대한 위산의 역할을 관찰 하기 위해서는 위산 부하 후에 이를 관찰하는 것이 필요하다.

이에 저자 등은 H. pylori에 감염된 생쥐에 인위적으로 펜 타가스트린을 투여하여 위산 분비를 증가시킨 후 위산이 H.

pylori 감염에 따른 위염의 범위에 미치는 영향을 조사하였다.

대상 및 방법

1. H. pylori 배양 및 동물 감염

Adrian Lee (School of Microbiology and Immunology, The University of New South Wales, Sydney, Australia)로부터 공 여 받은 H. pylori (SS1 균주¹⁰)를 horse serum (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), amphotericin B (Dong-A Pharm. Co., Ltd., Korea), polymixin B (Sigma chemical co, St. Louis, MO, USA), vancomycin (Dong-A Pharm. Co., Ltd.), trimethoprim (Sigma chemical Co.)이 포함된 brucella agar (Difco Inc, Detroit, MI, USA)에 도말 후 10% CO2, 37^oC에서 1주일간 배 양 후, 동물에 감염시키기 전에 5% horse serum 및 Skirrow's supplement가 포함된 brain heart infusion broth에서 2일간 배양 한 후(37^oC, shaking), 0.1 mL (1×10⁹ organisms/mL)를 zonde (0.9×70 mm, Da Jong Instrument Co.)를 이용해 생쥐 위에 접 종하고 이를 2일 간격으로 3회 반복하였다.

2. 생쥐의 위산 부하

무균상태로 분양받은 4 주령, 같은 혈통의 암컷 C57BL/6 생쥐(Japan SLC Inc, Hamamatsu, Japan)를 깨끗한 환경에서 물과 상품화된 설치류 식이로 1주간 사육후, 5마리(대조군) 는 H. pylori 감염 및 위산 자극 없이 관찰하며, 28마리는 H.

pylori를 감염시킨 후 7마리는 위산 자극 없이 관찰하고(I

군), 7마리는 2주일 후부터 올리브유 0.1 ml을 2일에 1회 위 투여(sham injection)하였으며(II군), 7마리는 감염 후 2주일부 터 펜타가스트린(RBI P198, Boston, USA) 125μg/kg을 0.1 mL의 올리브유에 녹여 2일에 1회 피하 주사하였으며(III군), 7마리는 감염 후 2주일부터 펜타가스트린 250μg/kg을 0.1 mL의 올리브유에 녹여 2일에 1회씩 7개월간 피하 주사하였 다(IV군). 모든 실험동물은 7개월간 사육 후 관찰하였다. 이 번 실험은 동물실험윤리위원회의 허가를 받았다.

3. 위 산도(pH) 측정

각 군의 생쥐에 마지막 주사를 투여 2시간 뒤 에테르 마 취 후 위 대만을 따라 절개한 후 Digitrapper MKIII 및 mono- crystalline antimony electrode (CYMED Co, Stockholm, Swe- den)를 이용하여 기준 전극을 복강에 대고, 활동 전극을 위 점막에 대어 pH를 측정하였다.

4. 위 점막의 염증 정도 및 H. pylori 군집도 관찰

위를 적출하여 10% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 포매 후 5μm 두께로 잘라 hematoxylin & eosin 염색 및 토 끼 항 H. pylori 항체(DAKO, Denmark)를 이용한 면역조직화 학염색(Fig. 1)을 하여 위 체부와 전정부에서 각각 Updated Sydney system¹¹ 등급체계에 따라 H. pylori 군집도, 다핵중성 구 활성도, 만성 염증, 위선 위축을 관찰하였다.

5. 면역조직화학염색

조직 내 H. pylori 감염을 보기 위해 면역조직화학염색을 하였다. 전정부 조직을 4-5μm 두께로 조직절편을 만들어

김성수 외 6인. H. pylori 위염에 대한 위산의 역할 365

Fig. 2. (A) The mucosa of gas- tric body from uninfected mouse shows the normal appearance. (B, C) The gastric body from the mouse infected for 7 months with H. pylori shows the extensive in- filtration of inflammatory cells in the mucosa and submucosa. (D) Gastric antral mucosa from the mouse, which is infected with H.

pylori and treated with pentagas- trin 250 μg/kg, shows a erosion (H&E, A, B, D: ×40, C: ×100).

파라핀을 제거한 후 과산화효소(peroxidase)의 활성을 억제 하기 위해 0.3% 과산화수소에 30분간 처리하였다. 항원을 회복시키기 위해 다시 절편을 pH 6.1의 구연산(citrate) 완충 액에서 20분간 마이크로파로 치리하고 비특이적인 결합은 5% 정상말혈청(normal horse serum)으로 차단시켰다. 4^oC에 서 토끼 항 H. pylori 항체(DAKO, Denmark)로 5% 정상말혈 청에서 밤새 유지시켰다. 대조로는 슬라이드를 5% 정상말혈 청만으로 처리하여 만들었으며, ABC 법(Vectastain Elite ABC kit; Vector Labs)으로 발색시켰다. 대조염색으로 Mayer's he- matoxylin을 5분간 첨가하여 시행하였다.

5. 통계

각 군의 부위에 따른 H. pylori의 군집도, 다핵중성구 활성 도, 만성 염증, 위선 위축의 차이는 Wilcoxon rank sums 법을 이용하였으며, H. pylori의 군집도와 다핵중성구 활성도, 만 성 염증, 위선 위축의 상관관계는 Spearman correlation 법을 이용하였다. 유의 수준은 p＜0.05로 하였다.

결 과

1. H. pylori 감염 및 위염

모든 생쥐는 7개월 동안 생존하였다. H. pylori를 접종하 지 않은 대조군의 위 점막은 육안 또는 조직학적으로 특이 한 염증 소견이 없었다(Fig. 2A). H. pylori에 감염된 생쥐는 조직학적으로 다양한 정도의 염증 소견이 있었다(Fig. 2B, C), IV군 생쥐 두 마리에서 조직학적으로 전정부에 미란이 관찰되었다(Fig. 2D).

H. pylori를 감염시킨 I-IV군에서 H. pylori 군집도 및 염증 정도를 비교해 보면, H. pylori 군집도는 체부와 전정부 모두 군 간에 차이가 없었다. 다핵중성구 활성도는 체부에서 타 군에 비해 IV군이 현저히 낮았으며(I군, 1.71; II군, 1.0; III군, 2.71; IV군, 0.29, p＜0.05), 전정부에서는 군 간에 차이가 없 었다. 만성 염증 세포의 침윤정도는 체부에서 III군에 비해 IV군이 현저히 낮았으나(1.86 vs. 1.0, p＜0.05), 전정부에서 는 군 간에 차이가 없었다. 위축 정도는 체부에서 II, III군이 타군에 비해 높은 경향을 보였으며, 전정부에서 타군에 비 해 I군이 높았으나 모두 통계적인 차이는 없었다(Fig. 3).

366 The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 50, No. 6, 2007

Fig. 3. The H. pylori density and the degree of inflammation of the body mucosa in each group. The degree of infiltration of poly- morphonuclear neutrophils is significantly lower in group IV compared to other groups. The degree of monocyte infiltration is also sig- nificantly lower in group IV than group III.

* p＜0.05.

2. 고위산분비군과 저위산분비군의 H. pylori 군집도 및 염증 반응 비교

H. pylori를 감염시킨 28마리를 위 점막의 평균 위산도(pH) 3.2를 기준으로 고위산분비군과 저위산분비군으로 나누어 비교하면, 고위산분비군과 저위산분비군의 평균 pH는 각각 1.85±0.58와 5.29±1.26이었다. H. pylori 군집도는 체부에서 고위산분비군이 저위산분비군에 비해 현저히 낮았으며(1.4 vs. 2.4, p＜0.05), 전정부에서는 차이가 없었다. 다핵중성구 활성도(0.9 vs. 2.3, p=0.018)와 만성 염증 세포의 침윤정도 (1.2 vs. 1.8, p=0.011)도 체부에서 고위산분비군이 저위산분 비군에 비해 현저히 낮았으며, 전정부에서는 차이가 없었 다. 위축 정도는 양군에서 차이가 없었다(Fig. 4).

3. H. pylori 군집도와 다핵중성구 활성도, 만성 염증의 상관관계

H. pylori를 감염시킨 28마리의 체부와 전정부에서 H.

pylori 군집도와 다핵중성구 활성도(r=0.37, p＜0.001) 및 만 성 염증(r=0.48, p＜0.001)은 유의한 상관관계를 보여 H.

pylori 감염이 많을수록 위 점막 염증은 유의하게 증가하였 다(Fig. 5).

고 찰

위내 H. pylori의 분포와 위염의 범위에 대한 위산의 영향 을 알아보고자 H. pylori에 감염된 생쥐에서 인위적으로 펜 타가스트린을 이용해 위산분비를 증가시킨 결과, 위산 분비 가 적을수록 H. pylori에 의한 위염이 체부로 확산되는 것을 알 수 있었다.

이는 그동안 보고되었던 논문에서 위산 억제는 H. pylori 위염의 범위를 확산시킨다는 내용과 일치하는 결과이며, omeprazole 등 산분비 억제제를 장기간 사용해야 하는 환자 에서 H. pylori 제균치료가 필요하다는 것을 시사해 준다.

H. felis에 감염된 BALB/c 생쥐에 omeprazole을 투여하여

Kim SS, et al. The Role of Acid in H. pylori-induced Gastritis 367

Fig. 4. The comparison of H. pylori density and the degree of inflammation in high (white) and low acidity (black) group. In the body, the high acidity group represents lower H. pylori density, polymorphonuclear neutrophils activity, and chronic inflammation compared with those of low acidity group.

* p＜0.05.

Fig. 5. The density of H. pylori significantly correlates with the degree of polymorphonuclear neutrophils and chronic inflammatory cells infiltration in the H. pylori-infected mice.

위산 분비를 억제한 후 위내 H. felis의 분포를 조사한 결과 omeprazole 투여 전에 비해 투여 후 전정부의 H. felis는 감 소하고 산분비 영역인 체부의 H. felis는 증가하였다.⁵ 십이

지장궤양 및 역류식도염 환자에서 omeprazole을 투여한 후 전정부와 체부의 H. pylori는 감소하였고, 저부의 H. pylori는 증가하였으며, 염증 정도도 H. pylori 밀도 변화와 같이 변하

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였다.⁶

또한 H. pylori에 감염된 위식도역류질환 환자 중 5년간 omeprazole을 투여한 환자의 30%에서 위축위염이 발생한 반면, 위저추벽성형술을 받은 환자는 같은 기간 동안 위축 위염이 발생하지 않아 H. pylori에 감염된 환자에서 omepra- zole을 장기간 투여하면 위염이 확산되었다.⁷ 그러나 다른 보고에서 H. pylori에 감염된 위식도역류식도질환 환자에서 3년간 omeprazole을 투여한 환자와 단지 역류억제술(anti- reflux surgery)을 받은 환자에서 위축위염의 빈도는 차이가 없었다.⁸ 상반되는 결과를 보인 두 논문에서 대상 환자의 나 이 및 사회경제적인 여건, 그리고 관찰 기간에 차이가 있을 것으로 생각한다. 십이지장궤양 환자에 omeprazole을 투여 한 결과 omeprazole은 H. pylori 이동에 영향을 주지 못하며 전정부와 체부 모두 H. pylori 수가 감소하였다.¹²

저자 등은 omeprazole의 H. pylori 제균 효과 때문에 이 약 제를 이용하여 산분비를 억제한 후 위산 분비량과 H. pylori 분포 및 위염 범위의 변화를 관찰하는 것은 문제가 있다고 생각하였으며, H. pylori에 대한 위산의 영향을 보다 정확히 관찰하기 위해서는 위산 분비를 증가시킨 후 관찰하는 것이 적절하다고 보았다.

이번 연구에서 H. pylori 밀도와 위 염증정도는 유의한 상 관관계를 보였으며, 위산부하가 많았던 IV군이 타 군에 비 해 위체부 위염이 현저하게 낮았으나, 각 군 간의 H. pylori 밀도의 차이는 없었다. 이는 펜타가스트린에 대한 반응차이 혹은 위산 분비능의 개체 차이로 생각되나 명확하지 않다.

그러나 대상 생쥐의 위 산도(pH)를 기준으로 나누어 비교해 보면 위점막의 pH가 낮을수록 위체부의 H. pylori 밀도는 유 의하게 낮았으며 급, 만성 염증정도도 현저히 낮았다.

펜타가스트린은 위산 분비를 증가시키는 대표적인 물질 로서 위산분비의 유도에 많이 이용한다. 흰쥐에서 펜타가스 트린은 용량이 많을수록 위산분비를 증가시키는 것으로 알 려져 있다.¹³ 이번 연구에서 위산분비량을 측정하지는 않았 지만 250μg/kg의 펜타가스트린을 투여한 IV군은 타군에 비 해 위 점막의 pH가 현저히 낮았다. 그러나 125μg/kg을 투 여한 III 군은 위산 자극을 하지 않은 I군과 위투여(sham injection) II군에 비해 pH가 높았으며, H. pylori에 의한 위염 의 정도도 타군에 비해 높게 나타났다. 이는 약을 조작하고 저장하는 과정에서 불활성화 되었을 가능성이 있으며, 펜타 가스티린 125μg/kg을 투여한 경우 H. pylori의 생존에 적절 한 환경이 되었을 가능성도 생각할 수 있으나 명확하지 않 다. 올리브유를 용매로 사용한 이유는 피하 주사 후 펜타가 스트린이 서서히 흡수되어 오랫동안 작용하기 위한 것이었 다.¹⁴

소화성 궤양은 위산분비량에 따라 일정한 위염 양상을 보 인다. 십이지장 궤양 환자는 정상인에 비해 많은 양의 위산

을 분비하며 이들은 전정부에 국한된 위염을 보이며, 반면 에 위궤양 환자는 위산분비량이 적고 위산분비영역인 체부 까지 전반적인 위축위염을 보인다.^2,3 위산분비량과 위염 양 상의 인과 관계는 명확하지 않지만 저자 등은 H. pylori 감 염과 관련하여 위산은 위내 H. pylori에 의한 위염 확산을 억제하는데 중요한 역할을 할 것으로 생각한다.

요 약

목적: 위산이 H. pylori 감염에 의한 위염 진행을 억제할 수 있는지 알아보고자 대상 및 방법: C57BL/6 생쥐 28마리 에 H. pylori (SS1 균주)를 감염시켰다. 7마리씩 4군으로 나 누어 I군은 처치 없이 관찰하고, II군은 위투여(sham injec- tion), III군은 펜타가스트린 125μg/kg, IV군은 펜타가스트린 250μg/kg을 일주일에 3회 피하 주사하여, 7개월 후 위 점막 pH를 측정하고, 위 점막의 H. pylori 군집도, 호중구 활성도, 만성 염증, 위선 위축의 변화를 관찰하였다. 결과: H. pylori 군집도는 체부와 전정부 모두 군 간에 차이가 없었다. 호중 구 활성도는 체부에서 타군에 비해 IV군이 현저히 낮았으 며(I군, 1.71; II군, 1.0; III군, 2.71; IV군, 0.29, p＜0.05), 전정 부에서는 군 간에 차이가 없었다. 만성 염증 세포의 침윤정 도는 체부에서 III군에 비해 IV군이 현저히 낮았으나(1.86 vs. 1.0, p＜0.05), 전정부에서는 군 간에 차이가 없었다. 위축 정도는 군 간에 통계적인 차이가 없었다. 대상 위 점막의 평 균산도 3.2를 기준으로 고위산분비군과 저위산분비군으로 나누어 비교했을 때 체부에서 고위산분비군은 저위산분비 군에 비해 H. pylori 군집도(1.4 vs. 2.4; P=0.04), 호중구 활성 도(0.9 vs. 2.3; p=0.018) 및 만성 염증 세포의 침윤 정도(1.2 vs. 1.8; p=0.011) 모두 유의하게 낮았다. 결론: 위산은 위내 H. pylori에 의한 위염 확산을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각한다.

색인단어: Helicobacter pylori, 위산, 위염

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