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J Health Tech Assess 2014;2(1):64-67 ISSN 2288-5811 Copyright © 2014 The Korean Association for Health Technology Assessment
서 론
폐암은 전세계적으로도 여전히 암 관련 사망률 통계에서 상위권을 차지하고 있는 치료가 힘든 암들 중 하나이다. 5년 이상 생존율도 13% 정도 밖에 되지 않을 뿐더러 조기발견 또한 힘들다. 국내에서의 통계를 보면 신규 암 발생환자 중 1위 를 차지한 위암에 이어 2위의 자리를 지키고 있으며, 2011년 암으로 사망한 사람 중 폐암으로 인한 사망자 수는 전체 암 관련 사망자의 22.2%인 15867명으로 암으로 인한 사망원인 중 1위를 차지하고 있을 뿐만 아니라, 1996년 대비 사망률이 가장 많이 증가한 암이기도 하다.1,2) 2011년에 발표된 중앙암 등록본부 자료에 의하면 2009년에 우리나라에서는 연 192561 건의 암이 발생되었는데, 그 중 비소세포폐암의 발생건수가 연 14300건으로 전체 폐암 발생 건의 72.6%를 차지하였다.
남녀의 성비는 2.5:1로 남자에게서 더 많이 발생하였으며 발 생건수는 남자가 연 10179건, 여자가 연 4121건이었다. 연령 대별로는 60대가 33.7%로 가장 많았으며 70대가 33.4%, 50대 가 17.0%로 주로 노인 인구에서의 발병률이 높게 나타났다.1)
임상적으로 폐암은 현미경적으로 암세포의 크기와 형태에 따라 소세포성 폐암(small cell lung cancer)과 비소세포성 폐 암(non-small cell lung cancer, 이하 NSCLC)으로 나누어지 며, 폐암의 약 75~80% 정도가 비소세포성 폐암의 경우에 속 하는 것으로 보고되고 있다. 또한 이 비소세포성 폐암은 다시 adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carci- noma로 세분되며,1) 이러한 구분에 따라 병리학적 특징뿐만 아니라 치료방법이나 예후 등도 달라지는 것으로 학계에 보 고되고 있다.2)
지금까지 이루어진 폐암의 진단과 예후에 관한 연구들을 살펴볼 때 조기진단이 폐암 환자의 예후에 가장 큰 영향을 끼치는 것으로 확인되고 있으며2) 분자병리학과 치료방법의 발달로 환자개인별 맞춤형 치료제의 개발이 본격화 되면서 치료방법의 선택을 위한 진단검사(companion diagnostics) 의 중요성이 높아지고 있다. 특히 항암요법과 관련하여 새로 운 표적항암치료제의 개발은 새로운 진단방법의 개발 또는 도입과 깊은 연관성을 가질 수 밖에 없다. 그럼에도 불구하고 일부에서는 현존하는 진단방법의 높은 비용과 진단정확도에
Diagnostic Tests for Anaplastic Lymphoma Kinase Gene Rearrangement in Non-Small-Cell Lung Cancer
HyunJoo Oh, PhD1 and Dawoon Kim2
1Department of Health Policy & Administration, Inje University, Gimhae, Korea
2Medical School, Chonnam University, Gwangju, Korea
비소세포성 환자에서 Anaplastic Lymphoma Kinase 유전자 변이 진단검사
인제대학교1, 전남대학교2
오 현 주1·김 다 운2
Address for Correspondence:
HyunJoo Oh, PhD
Department of Health Policy &
Administration, Inje University, 197 Inje-ro, Gimhae 621-749, Korea Tel: +82-55-320-3282
Fax: +82-55-335-8253 E-mail: prohyeon@hanmail.net
Accurate determination of anaplastic lymphoma kinase (ALK) rearrangement is important in lung cancer patients, especially in determining their eligibility for crizotinib therapy. Basically immuno- histochemistry (IHC) mothod and fluorescence in situ hybridization (FISH) has been used to detect ALK gene rearrangement. IHC mothod has been used for primary test and FISH has been regarded as the gold standard method for detecting ALK rearrangement in determining their eligibility for crizotinib therapy. However FISH requires a fluorescence microscope, and the signals are labile and rapidly fade over time. In this study, we reviewed current diagnostic tests for ALK gene rearrange- ment in non-small-cell lung cancer in Korea and potentiality of the new improved test for new al- ternative test to FISH.
Key Words Anaplastic lymphoma kinase · ALK · Non small cell lung cancer · NSCLC.
Review Article
JoHTA
online©MLCommHJ Oh, et al.
http://www.kahta.or.kr 65 대한 문제가 지속적으로 제기되고 있는 것 또한 사실이다.3)
본 고에서는 비세포성폐암 환자 중 crizotinib 제제의 치료 대상을 선정하기 위해 실시되는 anaplastic lymphoma kinase (이하 ALK) 유전자 변이 확인을 위한 검사에 대해 고찰하고 비용적인 측면과 진단정확성 측면에서 개선된 새로운 방법 에 대해 간단히 살펴보고자 한다.
Crizotinib 제제 투여를 위한 진단 대상
폐암 표적치료제 crizotinib은 특정 유전이상에 의한 후기 폐암 치료제이다. 이는 ALK, microtubule-associated pro- tein-like 4(이하 EML4)라는 두 가지 유전자의 변이로 인하 여 암 유발 유전자(cancer-causing gene)가 생성되면, 세포가 이상 증식하면서 폐암으로 진행되는데, crizotinib은 암 유발 유전자가 기능을 하지 못하도록 변이를 차단한다. 식품의약 품안전처(이하 식약처)의 품목허가 내용에 따르면 crizoti- nib 제제는 역형성 림프종 인산화효소(ALK) 양성 국소 진행 성 또는 전이성 비소세포폐암의 목적으로 허가되었다. 또한 이 약제를 투여하고자 하는 경우, 치료 시작 전에 충분히 검증 된 flourescence in situ hybridization(이하 FISH)법을 이용 하여 ALK 유전자 변이(rearrangement) 상태를 평가하도록 규정하고 있다.
ALK 유전자 변이(Gene Rearrangement)와 진단방법
EML4와 ALK의 융합 유전자는 NSCLC 표본에서 2007년도 에 Soda 등5)에 의하여 처음 발견되었다. 융합유전자는 EML4 유전자의 N-말단 부분과 ALK 유전자의 인산화효소 영역의 융합을 초래하는 염색체 2p의 반전에 의해 만들어진다.4) 그 이후로부터, EML4-ALK g 유전자의 여러 가지 변종이 규명 되어 왔다. 이러한 모든 융합은 그것의 인산화효소 영역을 포 함하면서, ALK 유전자의 세포질 부분을 포함한다. ALK와 EML4 유전자의 융합은 EML4 단백질 영역과 함께 ALK 단 백질의 세포 밖과 세포막통과영역의 대체를 초래하며, 세포 표면에 위치해 있는 일반적인 ALK 단백질과는 다르게 EML4-ALK에 의하여 생산되는 비 정상 ALK 단백질은 세 포질에 위치해 있다. EML4의 coiled coil 영역은 융합단백질 이 리간드 결합 없이 본질적으로 활성화 될 수 있도록 하며, 이러한 비 정상적인 시그널이 세포 사이클, 생존, 확산 그리 고 전이에 영향을 미침에 따라 암이 진행된다.
이러한 ALK 유전자의 변이는 NSCLC에서 약 2~7% 정도 로 나타나며 최근 ALK inhibitor인 crizotinib의 평가를 위
한 임상 시험에서 ALK 변이 양성 환자에게서 뛰어난 효과를 보여주었다.
현재 임상현장에서 crizotinib 투여 대상선정을 위한 ALK 변이 유무 확인 방법은 크게 2가지로 구분할 수 있다.
면역조직(세포)화학검사[Immunohisto(Cyto) chemistry]
면역조직(세포)화학검사[immunohisto(cyto) chemistry(이 하 IHC)/ICC]는 세포나 조직 내 특정 항원(단백질, 다당류, 핵산 등)에 대한 특이 항체를 만들어 이를 조직과 반응시켜 그 조직 내 특정 항원의 존재유무를 현미경으로 확인하는 검 사법으로, 미분화 세포의 기원을 확인하거나 효소, 호르몬, 종양표지자 및 예후 인자의 존재유무 그리고 암종의 구별 및 양성종양의 감별 등에 효율적으로 이용되는 검사법이다.1) 현재 비소세포성 폐암 환자에서 FISH 방법에 의한 ALK 유전자 변이 여부 확인에 앞서 환자를 1차 선별 하는 목적으로 ALK IHC 검사법이 이용되고 있다. 면역조직화학적 검사방법은 직 접법(direct method)과 간접법(indirect method)으로 크게 구분할 수 있으며 간접법은 표지물질을 결합시킨 항체를 사 용하는 표지항체법(lable conjugate antibody method)과 비 표지 항체법(unlabeled antibody method)으로 구분된다. 간 접법 가운데 가장 간단한 표지항체법은 일차항체에는 효소 를 부착하지 않고 일차항체의 Fc부분에 특성을 갖는 이차항 체에 효소를 부착하여 사용하는 방법이지만, 일차 혹은 이차 항체에 표지물질을 부착 시키지 않는 비표지항체법이 민감 성이 높은 것으로 알려져 있다.
그러나 악성 종피종에만 유일한 항원이 따로 존재하지는 않기 때문에, 한 가지 항원에 대한 검사를 하는 것이 아니고 대개 여러 항원에 대해 동시에 검사를 실시한다. 일반적으로 는 민감도와 특이도가 모두 80% 이상 되는 검사를 시행하는 것이 권고되고 있다.1)
면역조직화학적 염색 결과를 판정할 경우에 위양성과 위 음성에 대한 주의가 필요하다. 생검조직의 부적절한 고정에 의한 항원성의 소실이나 파라핀 절편에 사용된 일차항체, 항 체의 농도, 일차항체와 결합능이 없는 이차항체의 사용, 항원 복원을 위한 전처리 과정 등 검사 수행과 관련된 다양한 요 소들에 의해 검사결과가 영향을 받을 수 있다.
형광제자리부합법(Flourescence in situ hybridization) 형광제자리부합법(FISH)은 분자세포유전학(molecular cytogenetic) 검사기법으로 염색체의 특정 DNA 염기서열 (DNA sequence)의 존재 유무를 규명하기 위한 목적으로 이 용한다. 따라서 교합 또는 교잡반응(hybridization)이라 함은 염색체에 탐색자(probe)를 결합시키는 검사과정을 의미 하고,
Dx for ALK
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염색체에 결합하는 유전자 탐색자(DNA probe)는 자외선을 받으면 형광을 내면서 대응하는 DNA 염기서열의 유무 및 위치를 보여주게 된다.
FISH 기법은 형광 현미경상에서 유전자 탐색자의 형광 신 호를 관찰하여 이상 소견을 판독한다. 일반적으로 200개의 세포에서 염색체 변화를 분석하여 정량화한다. 이러한 FISH 기법은 유전자의 위치를 확인하는 Gene mapping이나 유전 질환 혹은 염색체 이상질환에서 염색체의 수적 혹은 구조적 이상 규명, 산전진단, 공수골수이식후의 생착여부, DNA 복 제시기 판정, 암유전자(oncogene) 및 억제유전자(suppressor gene)의 변화측정 등의 임상세포유전학(clinical cytogenetics) 부문에서 다양하게 활용되고 있다.
국내에 허가되어 있는 crizotinib 제제의 경우 임상시험에 서 환자선별을 위한 진단방법으로 FISH ALK 검사를 사용 하였으며, 이를 근거로 현재 해당 약제의 투여를 위해서는 FISH 기법을 이용하여 ALK 유전자의 변이여부를 확인하도 록 하고 있다.
일반적으로 검사에 소요되는 시간은 환자의 질환 및 검체 종류에 따라 세포배양 여부가 다르기 때문에 차이가 있고 슬라이드가 제작된 후 판독 과정에 따라서 많은 시간이 필요 할 수도 있다. 일반적으로 고전적인 염색체 검사의 경우 7~
10일이지만, FISH의 경우 3~5일이 소요된다.
고찰 및 결론
최근의 연구들을 통해 ALK 유전자 변이가 비소세포성 폐
암의 종양형성과 관련하여 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀 졌으며,5,6) 폐선암(lung adenocarcinoma) 환자의 4~6%에서 검출되는 것으로 보고되고 있다.6) 검사결과 ALK 양성인 환 자의 경우 이 ALK 억제자(inhibitors)를 이용하여 성공적으 로 치료가 되는 것으로 나타났다.6,7) 예를 들어 ALK 양성인 비소세포성 폐암 환자에서 crizotinib의 효과가 월등히 높게 나타난 것으로 확인되었다. 이 연구에 따르면 ALK 양성인 비소세포성 폐암 환자에 crizotinib을 투여한 결과 약물반응 률이 60.8%였으며, 이러한 객관적인 반응을 보이기까지의 소요시간은 약 7.9주(median time)였다.4,6,8)
유사한 예로, 파종혈관내응고(disseminated intravascular coagulation)로 인해 위독했던 환자에서 crizotinib이 5번째 로 선택된 요법이었음에도 불구하고 빠른 임상적/방사선학 적 개선을 보인 사례가 있다.6,8) 이러한 사례들을 통해 비소 세포성 폐암 환자의 경우 molecular-targeted therapy가 고려 되어야 한다는 것을 경험적으로 알 수 있다.
본문에서 언급하였듯이 현재 비소세포성 폐암 환자 중 crizotinib의 치료효과를 높이고 치료대상을 정하기 위해 사 용될 수 있는 ALK 유전자 변이 검사로는 크게 면역조직(세 포)화학검사(IHC)와 형광제자리부합법(FISH)이 사용되고 있으며, IHC법은 ALK 유전자 변이확인을 위한 1차 검사로, FISH법은 crizotinib의 투여 대상선정을 위한 최종 진단검 사로 선택되고 있다.
그러나 현재의 FISH법은 약제 선택을 위한 중요한 검사 임에도 불구하고 임상에서 사용시 여러 가지 제한점이 제기 되고 있는 것도 사실이다.
Fig. 1. 새로운 IHC 기법의 구성도. ALK: anaplastic lymphoma kinase, IHC: immunohisto chemistry.
HJ Oh, et al.
http://www.kahta.or.kr 67 FISH법의 경우 일반적으로 hybridization에만 24시간 정
도의 시간이 필요하기 때문에 검사 시작 후 염색 결과가 나오 는 데까지 약 2~3일 정도의 turnaround time이 필요하며, 기 본적으로 샘플 내에 50개 이상의 암세포가 있어야 하기 때문 에 특히, biopsy와 같은 적은 양의 샘플로는 검사 자체가 불 가능한 경우가 있다는 것, 그리고 이런 이유로 인해 전체 샘 플 중 약 10~30% FISH 검사들에서 결과를 얻지 못하는 경우 들이 발생함으로써 경험적으로 FISH법은 샘플 조건에 따른 위음성의 가능성을 내제하고 있는 것으로 해석된다.
그리고, FISH법을 이용한 ALK 유전자 변이 검사는 검사 건수가 적은 반면에 결과 판독을 위해서 암실이라는 별도의 공간과 더불어 형광현미경과 형광필터가 별도로 필요하며 매뉴얼로 검사하기 때문에 시설적인 제한과 숙련된 인력의 확보가 필요하다. 더욱이 대상 유전자(target gene)의 증폭을 보는 것이 아니라 유전자의 전위상태(translocation)를 보는 것으로 증폭결과를 확인하는 일반적인 FISH 검사에 비해 결과 해석이 쉽지 않다라는 제한점들이 제기되고 있다.
현재 국내에서 ALK 유전자 변이확인을 위해 사용되고 있 는 FISH 기법과 IHC 기법은 앞에서 살펴본 다양한 시각에 서의 장단점을 가지고 있으며, 동일한 임상적 목적을 가진 검 사임에도 불구하고 IHC 검사가 갖고 있는 제한적인 측면 때 문에 약물투여를 위한 검사는 FISH 기법으로 한정하고 있 다. 이렇기에 진단시약의 품목허가 및 임상에서의 사용목적 또한 뚜렷이 구분되어 있다. 그러나 최근 이러한 기존 IHC 기 법이 갖는 제한점을 검사 과정의 개선을 통해 진단 정확성을 획기적으로 개선한 장비와 시약이 개발되어 기존에 IHC가 조직 내 항원-항체 반응의 확인뿐만 아니라 crizotinib 투여 를 위한 진단검사로써 활용이 기대되고 있다. 새롭게 개선된 이 검사법은 IHC 기법을 기반으로 하고 있으나 진단정확성 을 개선시키기 위해 외국에서는 새로운 항체, 디텍션 키트, 증폭 키트 그리고 음성 대조 항체 등을 추가하였다(그림 1).
뿐만 아니라 검체의 탈 파라핀에서부터 대조 염색에 이르기 까지의 전 과정이 자동화 장비를 통해 이루어지므로 검사자 간에 따른 데이터 차이를 최소화 하였고, 조직내 암세포의 세포막에 DAB 발색이 있는 경우 양성으로 간주하는 binary scoring algorithm(양성 또는 음성으로 ALK 상태 확인)을 제공하여 결과 판독이 용이한 기술이 도입되어 사용되고 있
으며, 상당히 높은 민감도와 특이도를 보고 하고 있으며,8) 현 재 사용되고 있는 FISH 기법과의 결과 비교에서도 96.9%의 상당히 높은 일치도를 보이는 것으로 나타났다.9)
FISH 기법은 오랜 시간동안 분자세포유전학 분야에서 중 요한 검사기법으로 사용되어 왔으며, 현재에도 다양한 목적 으로 질병의 진단과 환자관리에 이용되고 있다. 일부 진료현 장에서 제기되고 있는 검사진행 및 검사결과, 운영비용 등과 관련된 전반적인 문제의 해결을 위해 새로운 대체 방안을 모색할 필요가 있을 것이다.
새롭게 개선된 IHC 검사법에서 FISH 검사법에 비해 상 대적으로 짧은 검사시간과 낮은 운영 비용, 그리고 검체관리 에서 유래되는 오류문제 등을 보완할 수 있다면 비소세포성 간암 환자에서 crizotinib 제제의 투여를 위해 필요로 하는 환자관리에 있어서 새로운 ALK 유전자 검사를 통해 진단검 사의 다양성을 제공할 수 있는 새로운 방안이 될 수 있기를 기대해 본다.
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