지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 세포군별 분리

대한화상학회지 제 14 권 제 2 호

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Vol. 14, No. 2, 93-96, 2011

책임저자：이수만, 경기도 성남시 분당구 야탑동 222

󰂕 463-836, 차의과학대학교 의생명학과 Tel: 031-725-8372, Fax: 031-725-8398 E-mail: suman@cha.ac.kr

본 연구는 한국연구재단 Basic Science Research Program 기초 과 학 연구비에 의하여 지원되었음(2009-0076696).

지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 세포군별 분리

박수정

ㆍ이교원

ㆍ임대석

ㆍ이수만

차의과학대학교 ¹의생명학과, ³바이오산업학과, ²성균관대학교 의과대학 강북삼성병원 산부인과

The Rapid Establishment of Human Clonal Adipose Derived Stem Cell (hADSC) Lines with Aspirated Adipose Tissue

Soo-jeong Park, Ph.D.

, Kyo-won Lee, M.D., Ph.D.

, Dae-Seog Lim, Ph.D.

and Suman Lee, Ph.D.

Departments of ¹Biomedical Science, ³Applied Bioscience, CHA University, Seongnam, ²Department of Obstetrics and Gynecology, Kangbuk Samsung Hospital, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea

Purpose: This study aims to establish a new strategy that

Methods: Human adipose tissue-derived stem cells (hAD-

Results: We confirmed the difference in growth rate, how-

Conclusion: It is necessary to establish cell lines via single

Key Words: Human adipose-derived stem cells, Human

서 론

중간엽 줄기세포는 조직의 재생에 중요한 역할을 하는, 인체 조직세포로 분화되기 직전의 원시세포를 말한다. 이 세포는 이름 그대로 중간엽, 즉 뼈, 연골, 지방, 혈관, 간 등 으로 분화가 가능한 세포이다

. 중간엽 줄기세포는 세포 수가 적고 증식이 어려운 단점이 있지만, 획득이 용이하고 배아 줄기세포와 달리 이미 성장한 인체조직에서 추출하기 때문에 윤리논쟁에서 자유롭다. 중간엽 줄기세포를 추출할 수 있는 많은 조직 중, 가장 대표적인 조직은 골수와 제대 혈, 지방, 태아 조직

등이 있다. 그 중, 지방조직 유래 중간 엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포에 비해 분리·획 득이 용이하고 다량의 세포 확보가 가능하다는 장점을 가 지고 있다

.

줄기세포는 증식과 분열을 거듭하면서 비대칭(asymmet- ric)적인 세포구성을 이룬다

. 즉 줄기세포성을 유지하며 증식하는 세포군과 계열 특이적 분화 양상을 나타내며 특 정 조직으로의 분화가 진행되는 세포군, 일부 비정상적 증 식을 하는 암줄기세포군 등으로 발전하며 증식한다

. 따라 서 본 연구에서는 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 치료 목적에 맞는 세포군의 선별적 분리를 위한 세포군별 분리 방법을 확립하고자 한다.

본 연구에서 지방 조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 하고, 이 세포를 세포군별로 재분리하여 1차적으로 성장능 을 비교하였다. 이렇게 분리된 세포는 세포군별로 성장능 에 상당한 차이를 나타냈다. 이렇게 성장능에 차이를 나타 내는 세포군을 골, 지방, 근육 및 신경세포 등의 계열로 분 화를 유도하여 2차로 분화능을 비교 하였다.

대상 및 방법

1. 재료

본 연구에 사용된 실험재료는 동의서를 얻은 지방조직으

로부터 분리하였다. 배지로는 Dulbecco’s Modified Eagle’s

Medium (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)과

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Table 1. Media Supplementation of Differentiation

Lineage Media Serum Supplement

Osteogenesis LG-DMEM 10% FBS 0.1μM Dexamethasone

10 mM B-glycerophosphate 0.05 mM Ascobate

Adipogenesis LG-DMEM 10% FBS 1μM Dexamethasone

0.5 mM IBMX 10μg/ml insuline 0.2 mM Indomethacin

Myogenesis MCDB131 1% FBS 100 unit/ml Heparin

Neurogenesis Pre-induction DMEM 20% FBS 1 mM β-mercaptoethanol

Induction DMEM · 5 mM β-mercaptoethanol

Table 2. Polymerase Chain Reaction (PCR) Primers Used for

5’-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3’

PPAR-γ 5’-GCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3’

5’-TCGCAGGCTCTTTAGAAACTC-3’

α-SMA 5’-CCCCATCTATGAGGGCTATGC-3’

5’-CGGCCAGCCAGATCC-3’

NSE 5’-CATGAGAATTGAGGAAGAGC-3’

5’-TATCACAGATCAGGACAGCA-3’

GAPDH 5’-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3’

5’-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3’

Table 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) Primers Used for

5’-TCAGCGTGTAAAGGCATCTG-3’

REX1 5’-ATGGCTATGTGTGCTATGAGC-3’

5’-CCTCAACTTCTAGTGCATCC-3’

OCT4 5’-CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG-3’

5’-CAAGGGCCGCAGCTCACACATGTTC-3’

10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL), 1% (v/v) penicillin/streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 배지를 기 본 배양 배지로 사용하였다.

2. 방법

1) 사람 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 세포 군별 분리

지방 흡입을 통해 채취한 지방 조직은 PBS로 수 차례 washing하고, RBP lysis buffer를 이용하여 적혈구를 제거 한다. 0.075% 제 1형 collagenase를 37

C에서 30분간 처리 하여 cellular fraction을 풀어주고, collagenase와 동량의 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가한다. 1200 xg에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 반복한다. 수획된 pellet은 100μm strainer를 통과하여 불순물을 제거한다.

분리된 세포는 기본 배양 배지에 넣은 후 37

C/5% CO

조 건의 세포배양기에서 배양한다. 2시간 배양 후, 부착되지 않은 세포를 분리하기 위해 상층액을 다른 배양 용기로 옮 겨 2시간 배양하고, 같은 과정을 반복하여 3일간 배양하여 각각의 배양용기에서 CFU를 분리하여 각각 15개의 세포 군을 계대 배양하였다.

2) 분화 조건

지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포를 지방, 근육, 신 경 그리고 골세포의 계열로 분화시키기 위해 5∼6 passage 까지 배양 후 Table 1과 같은 조성의 분화유도 배양액에서 각각의 계열로 분화를 유도한다.

3) 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)

각각의 계열로의 분화 유도배양액 배지에서 배양한 세포 로부터 QIAGEN RNA Minikit를 사용하여 RNA를 추출하 였다. 추출한 RNA는 cDNA합성을 위해 reverse-transcrip- tase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. 역전 사로 합성된 cDNA 100 ng, 10 xPCR 완충액 2.5μl, 10 pm sense-anti sense primer 각각 1μl, 2.5 mM dNTP 2μl, Tag polymerase 1 U을 포함한 25μl의 혼합물을 만들어 PCR을 진행하였다. 각 계열로의 분화확인을 위한 마커 유전자와 줄기세포성을 나타내는 유전자의 sense-anti sense primer 서열은 Table 2, Table 3과 같다. 증폭된 PCR 산물은 2%

agarose gel에 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 자외선 하에서 확인한다.

결 과

1. 사람의 지방조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포 의 세포군별 분리

먼저, 기존 지방 조직유래 줄기세포 분리방법대로 콜라

박수정 등：지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 세포군별 분리

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Fig. 1. Growth curve of clonal isolated ADSCs. The growth

Fig. 2. RT-PCR analysis of clonal isolated ADSCs using lineage

The RT-PCR assay using osteogenic (RUNX2), adipogenic (PPAR-γ), myogenic (α-SMA) or neurogenesis (NSE) markers were conducted. GAPDH was used as a control.

Fig. 3. (A) OCT4 methylation of clonal isolated ADSC lines. (B)

게네이즈(Collagenase)를 처리하여 지방 조직으로부터 세 포집합을 분리하고, 각각의 배양 용기에 부착된 세포를 집 락형성단위(Colony Forming Unit; CFU) 별로 총 15개 세 포군을 선별하였다. 각각의 세포군별로 성장능을 확인한 결과 각각의 세포군별로 상장 속도에 큰 차이를 나타냈다 (Fig. 1). #1, 3, 5 군의 경우는 빠른 성장능을 보인 반면, #8, 12, 15는 성장속도가 느린 것을 확인하였다. 이러한 성장능 을 기준으로 세포군을 나누어 분화 및 줄기세포성을 확인 하였다.

2. 세포군별 분화능

지방조직으로부터 분리한 세포의 성장능에 따라 빠른 성 장을 하는 군(fast)과 느린 성장을 하는 군(late)으로 나누어 각각의 분화능을 비교하였다. 지방, 근육 신경 및 골세포 등 각각의 계열로분화를 유도하여 각 계열 특이적 유전자의 발현을 관찰하였으나 세포의 성장속도 차이에 따라 분류한 세포군에서의 발현 차이는 관찰 할 수 없었다(Fig. 2). 따라 서 세포군별 분화능은 세포의 성장 속도와 무관함을 확인 했다(#8의 경우 성장 속도가 느리고 거듭된 계대 후에도 각 각의 계열로의 분화를 유도할 만큼의 세포수를 충족시키지

못해 분화 실험에서 제외하였다).

3. 줄기세포성(Stemness)

세포군의 성장능과 분화능을 각각 확인하고 줄기세포성 을 나타내는 대표적인 유전자인 OCT4의 methylation 양상 을 확인하고(Fig. 3A), 줄기세포성을 확인할 수 있는 마커 유전자의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다(Fig. 3B). 각 세포군별로 OCT4의 methylation에 차이를 보였으나 세포 의 성장능과 무관한 양상을 나타냈고, CATA4, REX1, OCT4등의 줄기세포성 마커 유전자의 발현 양상도 세포군 에 따라 다소 차이를 나타냈으나 methylation 양상과 성장 능과 무관함을 확인했다.

고 찰

줄기세포는 손상된 조직이나 장기에 주입하여 조직의 재

생 및 치료에 적용이 가능하여 조직공학및 재생의학 분야

에서 각광을 받고 있다

. 특히, 지방 조직으로부터 분리한

중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 유사한 세

포표면 단백질이 발현되며, 연골, 근육, 신경 및 골세포 등

으로 분화능을 갖는다고 널리 알려져 있다

.

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현재까지 줄기세포의 세포군별 분리 방법에 대한 연구는 세포의 기원, 표현형, 세포면역학적 특징, 계열별 초기분화 등의 차이를 관찰하는 수준에 그치고 있다

. 본 연구에서 는 지방 흡입술 이후 버려지는 조직으로부터 많은 양을 쉽 게 얻을 수 있고 분리가 용이한 중간엽 줄기세포의 부착시 간에 따른 세포군별 분리 방법을 통해 확립된 세포의 성장 능 및 분화능, 줄기세포성의 차이를 관찰함으로써 조직특 이적이고 치료 목적에 적합한 세포군별 분리 방법의 지표 로 삼고자 했다.

먼저, 기존 지방 조직유래 줄기세포 분리방법대로 콜라 게네이즈(Collagenase)를 처리하여 지방 조직으로부터 세 포집합을 분리하고, 분리한 세포를 일정시간 배양한 후 상 층액을 재 분주하여 부착되지 않은 세포를 다른 배양 용기 에 옮겨 배양하는 방법으로 세포를 집락형성단위(Colony Forming Unit; CFU) 별로 세포군을 선별하였다.

각각 분리된 세포군은 성장 속도에 큰 차이를 나타냈다.

그러나 성장 속도에 따른 분류가 분화능이나 줄기세포성 (stemness)을 나타내는 기준이 되지는 않는 것을 확인했다.

이미 골수유래 중간엽 줄기세포에서 세포군별 분리방법

을 확립한 결과에서 볼 수 있었던 분화능의 차이는 관찰할 수 없었다. 따라서 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포 의 분리에서도 CFU단위가 아닌 단일 세포(single cell) 단위 에서의 연구가 이루어져야 할 것이다.

기존의 세포 치료제 시장의 규모가 점차 거대해지고, 맞 춤형 치료에 대한 기대와 관심이 증가하고 있다. 분리 배양 이 용이하고 계대배양을 통해 대량의 세포를 수확 할 수 있는 지방 줄기세포의 세포군별 분리방법의 구축으로 목적 에 맞는 세포를 선별적으로 분리 배양하여 특정 질환에 선 별적으로 세포를 적용하여 치료효과를 높이고 비용 및 시 간을 절감하는 효과를 기대할 수 있다.

결 론

사람의 지방조직에서 분리한 중간엽 줄기세포의 세포군 별 분리 방법은 세포의 성장 속도가 다양한 세포군을 확립 할 수 있으나 계열 특이적 분화를 관찰 할 수 없었다. 따라 서 조직 특이적 세포의 적용을 위해서는 단일 세포 단위로 분리를 하여 재생 또는 치료를 목적으로 하는 조직으로의 분화능이 뛰어난 세포를 이식하는 연구가 필요하다고 사료 된다.

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