대사

2005, Vol. 49, No. 4

Printed in the Republic of Korea

381

대사 추적용 P-32 표지시약의 화학적 합성에 관한 연구

최강혁·안병제·박울재^†·한현수^†·유국현*

동국대학교화학과

†한국원자력연구소동위원소이용연구부

(2005. 3. 24 접수)

Study on the Novel Synthesis of P-32 Labeled Agents for Tracing Metabolism

Kang-Hyuk Choi, Byung-Jae Ahn, Ul-Jae Park^†, Hyon-Soo Han^†, and Kook-Hyun Yu*

Department of Chemistry, Dongguk University, Seoul 100-715, Korea

†Radioisotope Production and Application Division, Korea Atomic Energy Institute, Daejun 305-353, Korea (Received March 24, 2005)

요 약. [³²P] γ-ATP와 [³²P] α-dCTP는대표적 P-32 표지화합물이며, 인산화시약또는여러 RNA나 DNA의

P-32 표지기질로사용된다. 이화합물들은주로생화학적합성법에의해합성이된다. 본연구실에서는 P-32

표지화합물의대량생산에맞는화학적합성방법으로, 짝지움시약인 O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate

을이용하였다. O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate의총합성수율은 42%이었다. 이를이용한 [³²P]

γ-ATP와 [³²P] α-dCTP의합성표지수율은각각 95%, 40%였다.

주제어: [³²P]H³PO⁴, [³²P] γ-ATP, [³²P] α-dCTP, 화학적합성법, O-8-(5-Chloroquinolyl)-S-Phenyl Phosphorothiate

ABSTRACT. [³²P] γ-ATP (adenosine 5'-[γ-³²P]triphosphate) and [³²P] α-dCTP (deocycytidine 5'-[α-³²P]triphosphate) are representatives of P-32 labeled compounds and used as phosphorylating agents or labeled substrates for several RNA and DNA polymerase reactions. These are usually produced by enzymatic processing. Our studies have been focused mainly on preparing these compounds by chemical processing for mass production. O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate, a coupling agent, is proper for the systhesis of [³²P] γ-ATP and [³²P] α-dCTP. Coupling agent has been prepared in a yield of 42%. [³²P] γ-ATP and [³²P] α-dCTP were prepared in radiochemical yields of 95% and 40%;

respectively.

Keywords: [³²P] H³PO⁴, [³²P] γ-ATP, [³²P] α-dCTP, Chemical Method, O-8-(5-Chloroquinolyl)-S-Phenyl Phosphorothiate

P-32 동위원소를이용한표지화합물은생명과학및

물질대사의활동을알기위한 추적자로 이용되며 주 로핵산형태로제작되어 사용되고있다. 가장많이 이용되는표지화합물은 [³²P] γ-ATP(adenosine 5'-[-³²P]- triphosphate)와 [³²P] α-dCTP(deocycytidine 5'-[α-³²P]- triphosphate)가 있으며, 이러한표지화합물은 인산표 지와 DNA와 RNA의표지기질로이용된다. 국내사 용되는 P-32 표지화합물의양은 2002 년도기준 3526

mCi¹이며, 전량 해외수입에 의존하고있다. 최근에 들어한국원자력연구소에서는대량고품질의 P-32

가 [³²P] H³PO⁴의 형태로생산(30 Ci/batch)되고있으 며표지화합물에대한연구가진행되고있다.

핵산형태의 P-32 표지화합물은동위원소를핵산의

α와γ위치에선택적표지하는것으로대부분생화학 적 방법^2-6에 의해 생산된다. [³²P] γ-ATP의 생화학적 합성은 Johnson/walseth 방법⁷⁾과 Maxam/gilbert 방법⁸

group)는누클레오티드(nucleotide)의인산기를보호할 수도있으며선택적이탈기로작용하기도한다. 또한

8-인산퀴놀릴(8-quinolyl phosphate)에 페닐설파이드 기(phenylsulfide)를도입하면두개의이탈기를포함 하는짝지움시약(coupling agnet)이된다. 이 짝지움 시약은Fig. 1과같이인산을중심으로 2개의화합물 이결합될수있으며, 선택적치환이가능하다. 페닐 설파이드기는 Ag⁺이온에의해활성화되어쉽게 치 환되며, 퀴놀릴기는 Cu²⁺에 의해 활성화시켜치환반

Scheme 1과 같이 2 단계 과정으로짝지움시약(3)

을 합성하였다. 화합물 (2)의합성은 0, 질소조건에 서실험을하였다. 반응진행시 Cl⁻과피리딘이반응 한피리딘염(현탁침전물)이생성된다. 이피리딘염을 분리하지않고재결정할경우용매와생성물사이의 계면활성작용으로화합물 (2)을얻지못하였다. 합성 된 화합물 (2)는 연한노란색의 분말형태이며메탄올

에약간용해되고 HMPA와 DMSO에쉽게용해되었

다. 화합물 (3)은 Tsujiaki Hata의연구¹⁹를참고하였으 며 10 당량에해당하는페닐다이설파이드(phenyldisulfide)

를이용한결과 화합물 (3)의 수율이 10% 미만으로 불순물도많았다. 피리딘과아세토나이트릴(acetonitrile)

혼합용매조건하에 2.5 당량의 페닐다이설파이드로

화합물 (3)을합성하였으며 TLC 결과정량적반응진 행을확인하였다. 사용용매의양을최소조건으로하 여페닐다이설파이드를첨가하였으며, 반응물(화합물

(2))이용매에완전히용해되는것을확인하고트리부

틸포스핀(tributylphosphine)을 첨가하여야 60% 이상 의높은수율의화합물 (3)을얻을수있었다.

비교물질 ATP 의 합성

[³²P] γ-ATP(5)의합성은Scheme 2와같으며 P-32 표 Fig. 1. O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate which

contains two leaving group is use as coupling agent.

Scheme 1. Reaction step in the preparation of O-8-(5-chloroquinolyl)-S-phenyl phosphorothiate.

지화합물의합성조건을 알아보기위해 안정한원소

(³¹P)로 ATP를합성하였다. ATP의합성은 2단계반응 을 한 용기반응(One-spot Reaction)으로 진행하였다.

화합물 (4)의확인은 Ag⁺이페닐설파이드기와반응하

여생성되는 AgSPh의침전물로간접확인이가능하

며 TLC로반응을확인하였다. 침전물은카트리지필 터(Nylon, pore size 0.45µl)를 이용해서제거하였다.

화합물 (4)의퀴놀릴기를제거하기위해 Cu²⁺를사용

했으며크기가비슷한 Zn²⁺을사용하여도같은결과 를얻었다. 합성한 ATP는시판하는 ATP와 TLC 비교 를하여확인하였다. 최적분리확인조건은n-BuOH : EtOH : H²O : NH³(1 : 1 : 1 : 1)의전개용매를사용했 을경우이며, ATP는 0.53, AMP는 0.70, 화합물 (3)은

0.85의 전개율을나타내었다. Scheme 2와같은 방법

의합성을통해 P-32 표지화합물을합성할수있음을

확인하였다.

Scheme 2. Reaction step in the preparation of [³²P] ^γ-ATP using chemical processing.

Scheme 3. Reaction step in the preparation of [³²P] α-dCTP using chemical processing.

시여러부반응 이 일어날수있다. 이와같은부반 응으로수득율저하가일어나므로부분적보호기도 입과정이필요하였다. 이를해결하기위해트리에틸 아민(triethylamine)을이용한부분적보호기를도입하 였다. H³PO⁴의 pKa¹, pKa², pKa³는 각각 2.12, 7.21, 12.67로서트리에틸아민(pKa = 11.1)을첨가하면 H³PO⁴

의두작용기를염상태로보호를할수있다. 보호된

H³PO⁴는 Fig. 2의상태이며, 무수반응조건에서선택 적인산화반응이가능하였다. 한편, 피리딘의 pKa는

5.25로서 H³PO⁴의 pKa¹과 pKa²의 중간값을 가지며,

선택적으로한작용기를보호 할수 있었다. 합성된

dCMP는여러용매조건에서확인하였으며최적분리 확인조건은 C³H⁷OH : H²O : NH⁴OH(11 : 4 : 5)를사 용할경우이며 dCMP는 0.55의전개율을나타내었다. dCTP의 합성은 ATP의 합성과정과유사한방법으 로 짝지움시약을 이용하였다. TLC를 확인한 결과

C³H⁷OH : H²O : NH⁴OH(55 : 20 : 25) 용매조건에서전 개율은 0.35이었으며, n-BuOH : H²O : MeOH : NH⁴OH (1 : 1 : 1 : 1)의용매조건에서전개율은 0.50이었다. 이

두전개용매조건에서 dCMP와 dCTP의합성여부를

명확히알수있었다.

[³²P] H3PO4 용액 분석

원자력연구소에서생산된 [³²P] H³PO⁴의생산과정 에서존재할수있는다른이온들은주로생산에이 용되는표적물질, 표적용기및첨가된화학물질에의 해나타날수있으며, 표지화합물을제작하는과정에 서방해요인으로 작용할수있다. 따라서표지화합 물의합성시 [³²P] H³PO⁴의화학적순도를확인하였 다. 완전히감퇴된 [³²P] H³PO⁴를사용했으며습식분

석에의한음이온분석과 ICP-AES를이용한양이온

분석하였다. 음이온분석결과 Cl⁻, CN⁻, ClO⁴²⁻가 존 재하였으며가장많이포함하는이온은 Cl⁻이온임이 확인되었다. 양이온의확인은방사성붕괴가검출되 지 않은 [³²P] H³PO⁴ 용액 1 ml을 20 배로묽혀서분 석을하였다. 그결과 Na이약 10 ppm, Ca이 4 ppm, Al이 4 ppm 그리고 Si 4 ppm으로나타났다. 분석결 과 나타난 용액 속에 주로 존재하는 이온은 Cl⁻ 이 온및 Na⁺이온이며 Cl⁻이온은친핵치환반응을방 해하지않는이탈기로작용하므로표지화합물합성 시문제가되지않는다. 원자력연구소에서생산되는

[³²P] H³PO⁴는정제없이사용이가능하다는것이확 인되었다.

표지화합물 [³²P] γ-ATP(5)의 합성

사용한 [³²P] H³PO⁴는 2 mCi/1 ml로 HCl 수용액상 태였으며, Scheme 2와같은과정으로실험조건에따 르는합성수율의변화는다음Table 2에나타내었다.

3 차증류수를이용하여 5 배로묽힌후실험을한결

과로수득율이약 40%이었으며 [³²P] H³PO⁴을묽히지 않고반응진행시약 [³²P] γ-ATP의수율은 60%이었 다. 감압증류하여수분과 HCl을제거하여합성한결

과 수득율은 95% 이상이었다. 위 결과를 종합하면

[³²P] H³PO⁴순도및시약의사용량에따라합성수율 의변화가나타났으며수분의함유량에따른수율의 변화는가장중요한요소라고할 수있다. 최적조건 의 합성방법은건조시킨 [³²P] H³PO⁴를 이용하고같 은당량의전구체와 ATP, 2 당량의질산은, 5 당량의 이염화구리를사용한실험 4 조건이었다. 합성된 [³²P]

γ-ATP의 라디오크로마토그램은 Fig. 3와같으며표 지수율은 97%로재연성이있는결과를얻었다.

표지화합물 [³²P] α-dCTP(8)의 합성

Scheme 3과같은과정의 [³²P] α-dCTP의합성은 [³²P]

dCMP의 합성과짝지움시약을이용한인산화로 진

행된다. 사용한 [³²P] H³PO⁴는 3 mCi/1 ml의 HCl 수

용액 상태였으며합성에 필요한 반응용기는 14/20 joint가붙은시험관을제작하여사용하였다. [³²P] dCMP

의합성은수분에큰영향을받는다. [³²P] H³PO⁴의수 용액의 수분을 1회 제거 시 10~30%, 3회 제거 시

40~55%의 [³²P] dCMP의수득율이나타났다(Table 3.

Fig. 4). 특히, 과량의트리에틸아민을사용할경우수 득율이낮은것을확인하였다. 최적합성조건은 3회 건조시킨 [³²P] H³PO⁴를 사용하고반응에참여 하지 않은트리에틸아민을 제거할경우이다. 합성한 [³²P]

Table 2. Preparative conditions of [³²P] ^γ-ATP and its yield. [³²P] ^γ-ATP is identified by Radio TLC scanning Exp. Precursor

Cpds (3) (mg) AMP

(mg) Solvent

MPD/HMPA AgNO3 [³²P]-H3PO4 CuCl2 Yield Exp. 1 13 mg 10 mg 0.9 ml /0.3 ml 1.1 eq 5-fold Dilution 250µl 5 eq 40%

Exp. 2 13 mg 10 mg 0.9 ml /0.3 ml 1.1 eq 100µl 5 eq 60%

Exp. 3 13 mg 11 mg 0.9 ml /0.3 ml 1.5 eq 100µl 5 eq 73%

Exp. 4 13 mg 11 mg 0.9 ml /0.3 ml 2 eq 100µl 5 eq 95%

Exp. 5 13 mg 11 mg 0.9 ml /0.3 m 5 eq 100µl 5 eq 88%

Fig. 3. Radio TLC Scanning chromatogram of [³²P] ^γ-ATP with n-BuOH : EtOH : H2O : NH3 (1:1:1:1) as eluents Free Phosphoric acid([³²P]H³PO⁴) and [³²P] ^γ-ATP are identified in Rf= 0.1 and 0.54.

Table 3. Preparative conditions of [³²P] ^α-dCMP and its yield. [³²P] ^α-dCMP is identified by Radio TLC scanning

Exp. Deoxycytidine CCl³CN DMSO [³²P]H³PO⁴ Yield 비고

Exp. 1 20mg 8.2^µl 0.2ml 0.1ml(3mCi) -

Exp. 2 20mg 8.2^µl 0.2ml 10^µl(0.03mCi) -

Exp. 3 20mg 8.2^µl 0.2ml 0.1ml(0.25mCi) 30% dried [³²P] H³PO⁴ Exp. 4 20mg 8.2^µl 0.2ml 0.1ml(0.3mCi) 11% dried [³²P] H³PO⁴ Exp. 5 20mg 3.0^µl 0.5ml 0.1ml(0.3mCi) 42% dried [³²P] H³PO⁴ Exp. 6 20mg 3.0^µl 0.2ml 0.1ml(0.3mCi) 55% dried [³²P] H³PO⁴

Fig. 4. TLC Scanning chromatogram of prepared [³²P] dCMP.

(Distance from solvent front : 80 mm, Eluents; C³H⁷OH : H²O : NH⁴OH=55 : 20 : 25, Radio chemical yield: 55%) : Free Phosphoric acid([³²P]H3PO4) and [³²P] dCMP are iden- tified in R^f= 0.1 and 0.55.

dCMP는 sep-pak 카트리지를이용하여분리하였으며 짝지움시약을이용한 [³²P] α-dCTP의합성은 ATP 합 성조건과동일하게진행하였다. 라디오크로마토그램 으로확인한결과 [³²P] α-dCTP(8)의표지수율이 65%

이었으며(Fig. 5), 전합성과정에따르는표지수율은 약 40% 이었다. [³²P] α-dCTP(8)의합성은 [³²P] dCMP

합성과정이가장큰영향을주고있음을확인하였다.

실 험

시약 및 기기

방사성동위원소 P-32는한국원자력연구소에서생산

된 [³²P] H³PO⁴를이용하였으며, 1-chloro-8-hydroxyquinoline, phenyl disulfide와 adenosine 5'-monophosphate은 Acrose사 의제품을, 질산은, 이염화구리(CuCl²), H³PO⁴는 Aldrich

사의제품을, 그밖의반응용매들은 Aldrich 및 Merck

사의특급시약을이용하였다. 방사성동위원소를이 용한실험을위해반응초자기구는 Aldrich사의 KONTES

MICROSCALE GLASSWARE KIT를이용하여간이

반자동합성장치를제작하여사용하였다. 합성확인에 사용한 TLC는 Merck사의 Silica gel 60 F²⁵⁴를이용하 였으며발색기구및시약으로는 UV-램프및 I²를이 용하였다. IR은 Bomen 100 FT-IR Spectrophotometer

를, NMR은 Varian사의 Gemini 200을 이용하였으며

한후용액을감압증류하고피리딘과물(1 : 1) 혼합

용액 10 ml를 0^oC에서천천히첨가한다. 용매를감 압증류한후아세토나이트릴과물(1 : 1) 혼합용액을 이용하여 1차 침전물을 얻었으며 아세토나이트릴을 이용하여 2차 재결정하여수득율이 63%(1.8 g)인화 합물 (2)(5-chloro-8-quinolyl phosphate)를얻었다.

TLC (n-BuOH : MeOH : H²O : NH⁴OH=1 : 1: 1 : 0.5):

R^f= 0.25. mp=127. ¹H NMR (DMSO): δ=9.02(dd; 1 H, Ar-H), 8.55(dd; 1 H, Ar-H), 7.73(m; 3 H, 3Ar-H), 5.32 (broad; 2 H, 2 P-OH) MS(FAB, M⁺+1): C⁹H⁷ClNO⁴P cald. for 259.98 found 260.07.

O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate (3)의 합성

질소분위기에서 1 g(3.86 mmol)의화합물 (2)를 3

ml의피리딘과 15 ml의아세토나이트릴용매에첨가

한다. 실온에서 2.1 g(9.65 mmol)의 페닐다이설파이 드(phenyldisulfide)를넣고 4.8 ml(19.30 mmol)의삼부 틸포스핀(tributylphosphine)을 천천히 가한다. 1시간 반응뒤용매를제거한후클로로포름용액을이용하 여 유기물을추출한다. 생성혼합물을다이클로로메 탄에녹인후아세토나이트릴과 0.88 ml (7.72 mmol)

의 사이클로헥실아민을첨가하여 -20^oC에서재결정 시켜연한노란빛을띠는백색결정의생성물을합성 하였으며, 수득율은 68%(1.18 g)이었다.

TLC(MC : MeOH, 7: 3): R^f=0.65. ¹H NMR(CD³OD):

δ=8.86(dd; 1 H, quinoline-H), 8.67(dd; 1 H, quinoline- H), 7.89(dd; 1 H, quinoline-H), 7.69(q; 1 H, quinoline- H), 7.65(d; 1 H, quinoline-H), 7.40(m; 2 H, 2Ar-H), 7.20(m; 1 H, Ar-H), 7.13(m; 1 2H, 2Ar-H), 5.32(broad;

(Distance from solvent front : 90 mm, Eluents; n-BuOH : H²O : MeOH : NH⁴OH=1:1:1:1, Radio chemical yield: 65%) : [³²P] α-dCTP was prepared using sep-pak filtered [³²P]

dCMP. Free Phosphoric acid([³²P]H³PO⁴) and [³²P] ^α-dCTP are identified in Rf= 0.1 and 0.50.

2 H, 2 P-OH). MS(FAB, M⁺+1): C²¹H²⁴ClN²O³PS cald.

for 451.09 found 451.20.

비교물질 ATP(5) 의 합성

동량의 1-메틸피롤리돈(MPD)과헥사메틸포스포아 마이드(HMPA) 혼합용매 6 ml에 100 mg(0.22 mmol)

의화합물 (3)과 77 mg(0.22 mmol)의 AMP(Adenosine monophosphate)를첨가하여 10분간교반한후 45 mg (0.26 mmol)의질산은을넣어 30분간반응을진행한 다. 합성된화합물(4)는분리하지않고연속하여 38µl (0.66 mmol)의인산과 150 mg(1.1 mmol)의이염화구 리(CuCl²)를첨가후 12시간동안반응을진행시켰다.

합성된 ATP는 TLC를이용하여확인하였다. TLC (n-BuOH : MeOH : H²O : NH⁴OH = 1 : 1 : 1 : 1):

R^f =0.54.

비교물질 dCMP 및 dCTP 의 합성

질소분위기하에서 30(0.5 mmol)의인산에아세토 나이트릴을첨가하고감압증류를 2회진행한다. 1 ml

(7 mmol)의트리에틸아민을첨가하여감압증류한뒤

200µl의아세토나이트릴을첨가한다. 다른반응용기 에 20 mg(0.08 mmol)의 데옥시시티딘(deoxycytidine

monohydrate)을넣은후 아세토나이트릴을이용하여

수분을제거한다. 200µl의 DMSO와 100µl(1 mmol)

의삼염화아세토나이트릴(CCl³CN)를 첨가하고교반 후인산이들어있는반응용기에옮겨 40^oC에서 30분 간방치한다. 합성된화합물 (6)은시판하는 dCMP와

TLC로비교하였다. 생성혼합물 (6)을감압증류하여 한뒤 1-메틸피롤리돈과헥사메틸포스포아마이드의

1 : 1 혼합용매 4 ml 를첨가한후 45 mg(0.26 mmol)

의질산은과 100 mg(0.22 mmol)의화합물 (3)을첨가 하고 30분간교반시킨다. 계속하여 30µl(0.5 mmol)의

인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를첨가한

후상온에서 12시간반응을진행한다. 합성된 dCTP

는시제품과 TLC비교를하여확인하였다.

TLC (C³H⁷OH:H²O:NH⁴OH=11:4:5): dCMP (R^f=0.55), dCTP (R^f =0.35)

TLC (n-BuOH : MeOH : H²O : NH⁴OH=1:1:1:1):

dCTP (R^f =0.50)

표지화합물 [³²P] γ-ATP(5) 의 합성

β선차폐제로서 10 mm 아크릴판을이용하였으며

제작된 Microscale vial를 이용하여 합성을진행하였 다. 0.9 ml의 1-MPD와 0.3 ml의 HMPA 의용매에 13 mg(0.029 mmol)의화합물 (3)과 10 mg(0.029 mmol)

의 AMP 을첨가하고 10분간교반시킨후 10 mg(0.058

mmol)의 질산은을 첨가하여 30분간 교반시킨다. 아

세토나이트릴을이용한불변혼합증류를통해 2회건 조시킨 0.2 mCi의 [³²P] H³PO⁴에위혼합용액을섞은 후 19 mg(0.14 mmol)의이염화구리를첨가하고 3 시 간 교반하여 [³²P] γ-ATP(5)를 합성하였다. 합성확인 및표지수율은라디오크로마토그램을이용하였다.

TLC (n-BuOH : MeOH : H²O : NH⁴OH=1 : 1 : 1 : 1):

R^f =0.54. Radiochemical yield: 95%.

표지화합물 [³²P] dCMP(6)의 합성

10 mm 아크릴판으로β선차폐한조건에서 14/20

연결고리가달린시험관에 0.3 mCi (100µl) [³²P] H³PO⁴

를취한다. 100µl의 트리에틸아민을첨가하고 1 ml

의 아세토나이트릴을 이용하여 30^oC 조건에서 3회 감압증류하고고무마개로밀봉시킨다. 다른반응용 기에 20 mg(0.08 mmol)의데옥시시티딘(deoxycytidine monohydrate)을넣은후 100µl의 DMSO와 3µl의삼 염화아세토나이트릴(CCl³CN)를첨가하고교반후밀 봉된인산용기에옮겨 40µl 조건에 30분간방치한다.

합성확인 및 표지수율은 라디오크로마토그램을이 용하였다.

TLC (C³H⁷OH : H²O : NH⁴OH=11 : 4 : 5): R^f= 0.55.

Radiochemical yield: 55%.

표지화합물 [³²P] α-dCTP(8)의 합성

화합물 (6)를 sep-pak 분리후동량의 1-메틸피롤리 돈과헥사메틸포스포아마이드 4 ml를첨가한다. 13 mg

의 화합물 (3)을 첨가한후 10 mg의 질산은을 첨가 후 30분간 교반시킨다. 계속하여 30µl(0.5 mmol)의

인산과 100 mg(0.73 mmol)의 이염화구리를첨가한

후 3시간동안반응하여 [³²P] α-dCTP를합성하였다. TLC (n-BuOH : MeOH : H²O : NH⁴OH=1 : 1 : 1 : 1):

dCTP (R^f= 0.50). Radiochemical yield: 65%.

결 론

O-8-(5-chloroquinolyl) S-phenyl phosphorothiate의총 합성수율은 42%이었으며합성확인은 NMR, IR, TLC

본연구는원자력연구개발과제중하나로이용연 구지원사업의지원에의해수행되었으며, 연구수행 에도움을준원자력의학원싸이크로트론응용연구실 에감사의글을드립니다.

인 용 문 헌

1.한국원자력산업회의, 2003 Nuclear Energy Yearbook, Korea, 2003, 242.

2. Fumio Hayashi, Osamu Hatano and Takao Shinozawa, Radioisotopes, 1987, 36, 347.

3. Barai, V.N.; Zinchenko, A.I.; Zalashko, L.M.; Ero- shevskaya, L.A. and Mikhailopulo, I.A. Biotechnology letters, 1995, 17(6), 599.

4. Inwon Park and Tae-Neung Johng, Purification of Home- made ³²P-H³PO⁴ and its Application to the Synthesis of [α-³²P]ATP, Korean Biochem. J., 1984, 17(1), 80.

American Chemical Society, 1965, 87(8), 1785.

13. J. Zimmet, L. Jarlebark, R. Hammarberg, P.J.M. von Gslrn, K.S. Jsvobdon, and E. Heilbronn, Nucleosides &

Nucleotides, 1993, 12(1), 1.

14. Hiroshi Takaku, Ryuichi Yamaguchi, and Tadaaki Nomoto, Tetrahedron Letters, 1979, 40, 3857.

15. Hiroshi Takaku, Chem. Pharm. Bull, 1977, 25(8), 2121.

16. Hiroshi Takaku, Toshimi Konishi, and Tsujiaki Hata, Chemistry Letters, 1977, 655.

17. Koichiro Fukuoka, Fuminori Suda, Masahide Ishikawa, and Tsujiaki Hata, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 693.

18. Hiroshi Matsuo, Tomohisa Morguchi, Toshimitsu TaK- abe, Stephen Buratowski, Mitsuo Sekine, Yoshimasa Kyogoku, and Gerhard Wagner, J. Am. Chem. Soc.,

2000, 122, 2417.

19. Tsujiaki HATA and Mitsuo SEKINE, The synthesis of S-phenyl nucleoside phosphorothioates, Chemistry Let- ters, 1974, 837.